Multiomics-Analyse von TMEM200A als Pan-Cancer-Biomarker

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll vorgestellt, in dem mehrere bioinformatische Werkzeuge kombiniert werden, um die biologischen Funktionen von TMEM200A bei Krebs zu untersuchen. Darüber hinaus validieren wir die bioinformatischen Vorhersagen auch experimentell.

Zusammenfassung

Es ist bekannt, dass das Transmembranprotein TMEM200A mit menschlichen Krebserkrankungen und Immuninfiltration in Verbindung gebracht wird. Hier untersuchten wir die Funktion von TMEM200A bei häufigen Krebserkrankungen mittels Multiomics-Analyse und verwendeten in vitro Zellkulturen von Magenzellen, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Expression von TMEM200A in verschiedenen menschlichen Krebsarten wurde anhand der RNA-seq-Daten aus der UCSC Xena-Datenbank untersucht. Die bioinformatische Analyse ergab eine mögliche Rolle von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker.

Es wurden Kulturen von normalen Magen- und Krebszelllinien gezüchtet und TMEM200A wurde niedergeschlagen. Die Expressionsniveaus von TMEM200A wurden mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und Western Blot gemessen. In vitro Loss-of-Function-Studien wurden dann verwendet, um die Rolle von TMEM200A beim malignen Verhalten und der Tumorbildung von Magenkrebszellen (GC) zu bestimmen. Western Blots wurden verwendet, um die Wirkung des Knockdowns auf den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) und den PI3K/AKT-Signalweg in der GC zu untersuchen. Bioinformatische Analysen zeigten, dass TMEM200A in hohen Konzentrationen in GC exprimiert wurde.

Die Proliferation von GC-Zellen wurde durch TMEM200A Knockdown gehemmt, der auch Vimentin-, N-Cadherin- und Snai-Proteine verringerte und die AKT-Phosphorylierung hemmte. Der PI3K/AKT-Signalweg schien ebenfalls an der TMEM200A-vermittelten Regulation der GC-Entwicklung beteiligt zu sein. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A die Mikroumgebung des Tumors reguliert, indem es die EMT beeinflusst. TMEM200A kann auch die EMT durch PI3K/AKT-Signale beeinflussen und so die Mikroumgebung des Tumors beeinflussen. Daher kann TMEM200A bei Pankarzinomen, insbesondere GC, ein potenzieller Biomarker und ein Onkogen sein.

Einleitung

Krebs hat sich aufgrund seiner weltweit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten zu einem anhaltendenProblem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, das die menschliche Gesundheit weltweit gefährdet 1 und eine schwere finanzielle und medizinische Belastung für die Gesellschaft darstellt². In den letzten Jahren wurden dank der Entdeckung von Krebsmarkern³ bedeutende Fortschritte in der Krebstherapie erzielt, und Forscher haben neuartige Diagnosemethoden und neue Medikamente zur Behandlung von Krebs entwickelt. Einige Patienten mit Krebs haben jedoch aufgrund von Faktoren wie Medikamentenresistenz, Nebenwirkungen von Medikamenten und Chemikalienempfindlichkeit immer noch schlechte Prognosen⁴. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Identifizierung neuer Biomarker für das Screening und die Behandlung von Krebserkrankungen im Frühstadium⁵.

Membranproteine sind Proteine, die sich an Zellen und Organellenmembranen binden und integrieren können⁶. Diese können je nach Stärke der Bindung an die Membran und ihrer Lage in drei Kategorien eingeteilt werden: lipidverankerte Proteine, integrale Proteine und periphere Membranproteine ^7,8. Ein Transmembranprotein (TMEM) ist ein integrales Membranprotein, das aus mindestens einem Transmembransegment⁹ besteht, das entweder ganz oder teilweise durch die biologische Membran verläuft.

Obwohl die Wirkmechanismen der Proteine der TMEM-Familie nicht gut verstanden sind, ist bekannt, dass diese Proteine an verschiedenen Krebsarten beteiligt sind¹⁰. Mehrere TMEM-Proteine sind mit migratorischen, proliferativen und invasiven Phänotypen assoziiert, und ihre Expression ist oft mit der Prognose eines Patienten verbunden¹¹. Daher sind Mitglieder der TMEM-Familie zum Ziel der Forschung geworden. Eine umfassende Überprüfung bestehender Berichte über TMEM ergab, dass sie hauptsächlich mit inter- und intrazellulärer Signalübertragung¹², immunbedingten Erkrankungen und Tumorgenese¹⁰ assoziiert sind. Viele TMEMs besitzen auch wichtige physiologische Funktionen, z. B. Ionenkanäle in der Plasmamembran, die Aktivierung von Signaltransduktionswegen sowie die Vermittlung von Zellchemotaxis, Adhäsion, Apoptose und Autophagie¹⁰. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass TMEM-Proteine wichtige prognostische Marker bei der Erkennung und Behandlung von Tumoren sein könnten.

TMEM200A Expression ist bei Magenkrebs (GC) signifikant erhöht. Eine höhere Expression von TMEM200A¹³, das acht Exons und eine Gesamtlänge von 77,536 kb auf Chromosom 6q23.1 aufweist, wurde mit einer schlechten Prognose für das Gesamtüberleben (OS) bei GC in Verbindung gebracht. Dennoch wurden die Veränderungen in seiner Expression in onkologischen Studien nur selten berichtet. Dieser Artikel vergleicht und analysiert die Nützlichkeit von TMEM200A als therapeutisches Ziel und tumordiagnostischer Marker in verschiedenen Krebsstudien unter Verwendung verschiedener öffentlich zugänglicher Datensätze. Wir untersuchten die Wirksamkeit von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker für Krebserkrankungen sowie seine Expressionsniveaus bei verschiedenen menschlichen Krebsarten mit Hilfe von RNA-seq-Daten aus den UCSC-Xena- und TCGA-Datenbanken sowie mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Western Blotting.

Der Einfluss TMEM200A Expressionsniveaus auf Mutationsraten , regulatorische Prozesse, Tumordiagnose und -prognose, Immuninfiltration und Immuntherapie wurde mit einer Mischung aus Computerwerkzeugen und Datensatz-Websites weiter untersucht. CBioPortal und die COSMIC-Datenbanken (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) wurden verwendet, um Mutationen in TMEM200A zu untersuchen. Sangerbox- und TISIDB-Websites wurden verwendet, um zu verstehen, wie TMEM200A die Immuninfiltration beeinflusst. Mit dem Online-Tool des Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) und der Datenbank CancerSEA wurde die Funktion von TMEM200A untersucht. Um den Einfluss von TMEM200A auf das maligne Verhalten und die Tumorentwicklungsfunktion von GC-Zellen zu untersuchen, wurde schließlich ein Loss-of-Function-Experiment in einem In-vitro-Assay durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Western Blot durchgeführt, um zu beurteilen , wie sich TMEM200A Knockdown auf den PI3K/AKT-Signalweg und die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) bei GC auswirkt.

Protokoll

1. Die Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA)

HINWEIS: Die Datenbank des Cancer Genome Atlas (TCGA) enthält die Sequenzierungsdaten von Genen in verschiedenen Tumorgeweben¹⁴. RNA-seq-Daten in TCGA für die Untersuchung von TMEM200A Transkripten pro Teil pro Million (TPM) Formaten wurden von der UCSC Xena-Website ^{extrahiert 15} (https://xenabrowser. net/datapages/) und log2 transformiert, um die Expressionen zwischen den Proben zu vergleichen.

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
2. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
3. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
4. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte für insgesamt 33 Krebsarten wie GDC TCGA Akute myeloische Leukämie (LAML), GDC TCGA Nebennierenrindenkrebs (ACC), GDC TCGA Gallengangskrebs (CHOL) und mehr.
5. Wählen Sie im Menü Genexpression RNAseq die Registerkarte HTSeq - FPKM GDC Hub aus und klicken Sie darauf.
   HINWEIS: HTSeq - FPKM GDC Hub stellt Daten dar, die durch Einwilligung korrigiert wurden.
6. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
   HINWEIS: Mit der oben genannten Methode wurden RNA-Seq-Daten für 33 verschiedene Krebsarten heruntergeladen.
7. Entpacken Sie das Zip-Archiv mit RNA-seq-Daten für 33 verschiedene Krebsarten in einer einzigen Datei im Desktop-Ordner des Computers.
8. Vereinheitlichen Sie die entpackten txt-Dateien im selben Ordner und legen Sie die Perl-Skripte in diesem Ordner ab.
9. Öffnen Sie die Perl-Software , kopieren Sie den Pfad des Ordners und fügen Sie ihn in die Perl-Software ein, in der sich der Mauszeiger befindet, drücken Sie die Eingabetaste , geben Sie den Namen des Perl-Codes und den Namen des Gens (TMEM200A) ein, und drücken Sie dann die Eingabetaste , um eine neue TXT-Datei(singleGeneExp.txt) zu erhalten.
   HINWEIS: Diese neue txt-Datei (singleGeneExp.txt) enthält die Genexpression von TMEM200A bei 33 Krebsarten bei verschiedenen Patienten.
10. Öffnen Sie den R-Code (diffR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die singleGeneExp.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
11. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (diffR) aus, und zeichnen Sie das Bild durch das Paket "ggpubr".

2. Die TIMER2.0-Datenbank

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) Datenbank ¹⁶ auf.
2. Klicken Sie auf die Registerkarte Krebsforschung.
3. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Registerkarte Senden , um die differentiellen Expressionsbilder von TMEM200A in verschiedenen Tumorarten zu erhalten.

3. Humaner Proteinatlas (HPA)

1. Rufen Sie die Weboberfläche des Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷auf.
2. Geben Sie ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen . Wählen Sie den Subatlas TISSUE aus.
3. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Seite und scrollen Sie nach unten, um die Registerkarte Übersicht über die Proteinexpression zu finden.
   HINWEIS: Der Abschnitt Übersicht über die Proteinexpression zeigt die Proteinexpressionsniveaus von TMEM200A in 45 Organen des menschlichen Körpers.

4. Das HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-Methylierungsplattform-Array

HINWEIS: Das HumanMethylation450 Illumina Infinium DNA-Methylierungsplattform-Array wurde verwendet, um Daten zur Methylierung zu sammeln. Wir konnten den TMEM200A DNA-Methylierungsgrad mit Hilfe der SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/) Datenbank¹⁸ bestimmen.

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der SMART-Website auf.
2. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein, um die Verteilung der TMEM200A in den Chromosomen und den Methylierungsgrad von TMEM200A bei verschiedenen Arten von Malignomen zu erhalten.
3. Scrollen Sie auf der Seite nach unten zum Menü Klicken Sie, um die aggregierte CpG-Methylierung zu überprüfen , und klicken Sie auf die Schaltfläche Plotten . Suchen Sie unten auf der Seite die Schaltfläche Abbildung herunterladen und klicken Sie darauf. Laden Sie die Abbildung herunter.

5. Die UALCAN-Datenbank

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UALCAN-Website auf.
   ANMERKUNG: Boxplots der TMEM200A Promotormethylierungsniveaus bei verschiedenen Malignomen wurden über die UALCAN-Datenbank (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹ erstellt
2. Klicken Sie oben auf der Seite auf die Schaltfläche TCGA .
3. Geben Sie TMEM200A in das Eingabefeld Gen-ID auf dem Bildschirm ein. Scrollen Sie im Menü des TCGA-Datensatzes nach unten und wählen Sie die Art der Krebsart aus, die abgefragt werden soll.
4. Nachdem Sie auf die Schaltfläche "Erkunden" geklickt haben, klicken Sie im Menü "Links zur Analyse" auf die Untergruppenanalyse Methylierung, um die Methylierungsergebnisse dieses Tumors zu erhalten.
   HINWEIS: Mit dieser Methode erhielten wir Methylierungsergebnisse für 22 Tumore in der UALCAN-Datenbank .

6. Datenbank des Katalogs somatischer Mutationen in Krebszellen (COSMIC)

1. Rufen Sie die Website Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells (COSMIC) auf.
   HINWEIS: Daten zu kodierenden Mutationen, nicht-kodierenden mutierten genomischen Umlagerungen und Fusionsgenen im menschlichen Genom sind in der Datenbank ²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/ des Katalogs für somatische Mutationen in Krebszellen (COSMIC) verfügbar, die auch zur Bestimmung der Häufigkeit verschiedener TMEM200A Mutationen bei verschiedenen Krebsarten verwendet wird.
2. Geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) in das Suchfeld ein und klicken Sie auf die Schaltfläche SUCHEN , um zu einem neuen Bildschirm zu gelangen.
3. Suchen Sie im Menü Gene den Link, auf dem der Gen-ID-Name des TMEM200A angezeigt wird, und klicken Sie darauf.
4. Suchen Sie auf der neuen Seite die Spalte Gruppierung der Mutationsverteilung , um den Mutationsstatus von TMEM200A im Tumor zu erhalten.

7. CBioPortal

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der CBioPortal-Website auf.
   HINWEIS: Krebsgenomik-Daten können mit der cBioPortal (www.cioportal.org) Datenbank gefunden, heruntergeladen, analysiert und visualisiert werden. Somatische Mutationen, Veränderungen der DNA-Kopienzahl (CNAs), mRNA- und microRNA (miRNA)-Expression, DNA-Methylierung, Proteinhäufigkeit und Phosphoproteinhäufigkeit sind nur einige der genomischen Datentypen, die von cBioPortal²¹ integriert werden. Mit cBioPortal kann ein breites Spektrum an Studien durchgeführt werden; Der Schwerpunkt liegt jedoch auf verschiedenen Analysen von Mutationen und deren Visualisierung.
2. Wählen Sie den Datensatz Pan-Cancer analysis of whole genomes aus dem Unterabschnitt PanCancer Studies des Abschnitts Select Studies for Visualization & Analysis (Studien für Visualisierung und Analyse auswählen ) aus. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Nach Genen abfragen .
3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Abfrage senden .
4. Klicken Sie oben auf der Seite auf die Schaltfläche Krebsart detailliert , um die Mutationen von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten zu erhalten.

8. Sangerbox 3.0 Werkzeug

1. Gehen Sie zur Benutzeroberfläche des Sangerbox 3.0-Tools .
   ANMERKUNG: Die Korrelation der TMEM200A Expression mit immuninfiltrierenden Zellen, Immunsuppressiva, immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen (Haupthistokompatibilitätskomplex) bei allen Krebsarten wurde mittels CIBERSORT-Immuninfiltration unter Verwendung der Pan-Krebs-Immuninfiltrationsdaten in Sangerbox 3.0 Tool²² (http://vip.sangerbox.com/) analysiert.
2. Wählen Sie in der Symbolleiste auf der linken Seite die Registerkarte Immunzelluläre Analyse (CIBERSORT) aus dem Menü Pan-Krebsanalyse aus und klicken Sie darauf.
3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .

9. TISIDB-Datenbank

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TISIDB-Website auf.
   ANMERKUNG: Die TISIDB-Datenbank²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) wurde verwendet, um die Korrelation der TMEM200A Expression mit immuninfiltrierenden Zellen, Immunsuppressiva, immunstimulatorischen Faktoren und MHC-Molekülen bei verschiedenen Krebsarten zu untersuchen.
2. Geben Sie das Zielgensymbol (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .
3. Klicken Sie auf die Abschnitte Lymphozyten, Immunmodulatoren, Chemokine und Subtypen oben auf der Seite. Laden Sie die entsprechenden Bilder unten auf der Seite herunter.

10. Die TIDE-Datenbank

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der TIDE-Website auf.
   HINWEIS: Die TIDE-Datenbank (http://tide.dfci.harvard.edu/) wurde verwendet, um das Potenzial von TMEM200A als Biomarker für die Vorhersage des Ansprechens auf eine Tumor-Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie zu bewerten.
2. Geben Sie auf dem Einstiegsbildschirm die E-Mail-Adresse ein, um das Konto zu registrieren und sich anzumelden.
3. Suchen Sie den Unterabschnitt Biomarker-Bewertung oben auf der Seite und klicken Sie darauf.
4. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld für Gene eingeben unten auf der Seite ein. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Senden .
5. Ziehen Sie auf der Seite die Maus, um die Seite nach unten zu schieben und die Ergebnisse der Analyse zu finden.

11. Die CancerSEA-Datenbank

1. Gehen Sie auf die Benutzeroberfläche der CancerSEA-Website .
   HINWEIS: Anhand von Einzelzellsequenzierungsdaten wurden die Zusammenhänge zwischen TMEM200A Expression und dem funktionellen Zustand verschiedener Tumorzellen untersucht. Dies geschah mit Hilfe der CancerSEA-Datenbank²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. Suchen und klicken Sie oben auf der Seite auf die Registerkarte Suchen .
3. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Senden .

12. Das Tumor-Immun-Einzelzellzentrum (TISCH) Netzwerk-Tool

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche des Netzwerktools für das Tumorimmun-Einzelzellzentrum (TISCH) auf.
   ANMERKUNG: Die Korrelation zwischen den Expressionsniveaus von TMEM200A - und Krebszellen wurde auch unter Verwendung des TISCH-Netzwerkwerkzeugs (Tumor Immune Single-Cell Center)²⁵ gezeigt.
2. Geben Sie die Zielgen-ID (TMEM200A) in das Abfragefeld von Gene eingeben ein. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erkunden .
3. Wählen Sie im Menü Krebstyp auf dieser Seite das Dataset All Cancers aus, und klicken Sie darauf. Scrollen Sie dann auf der Seite nach unten und klicken Sie auf die Schaltfläche Suchen .

13. GeneMANIA

1. Rufen Sie die GeneMANIA-Website auf.
   ANMERKUNG: Die Korrelation zwischen TMEM200A und seinen funktionell relevanten Genen wurde mit Hilfe der Integrationsstrategie für das Gen-Multi-Assoziations-Netzwerk Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ zur Konstruktion von Gen-Gen-Interaktionsnetzwerken (GGI) vorhergesagt.
2. Geben Sie im Suchfeld oben links auf der Seite die Gen-ID (TMEM200A) ein und klicken Sie auf Suchtools.
   HINWEIS: Das Web-Tool GeneMANIA wurde verwendet, um 20 Gene zu finden, die mit TMEM200A assoziiert sind.

14. Analyse der funktionellen Anreicherung

1. Speichern Sie die Symbol-IDs der zu analysierenden Gene zur Anreicherung im txt-Dateiformat.
2. Öffnen Sie den R-Code (symbolidR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die obige txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (symbolidR) aus. Wandeln Sie die Symbol-IDs dieser Gene über die "org. Hs.eg.db"-Paket. Rufen Sie die id.txt Datei ab.
4. Öffnen Sie den R-Code (GOR und KEGGR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die id.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (GOR und KEGGR) aus. Um diesem Protokoll zu folgen, analysieren Sie diese Gene auf GO- und KEGG-Anreicherung mit den Paketen "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" und "enrichplot" und stellen Sie die Anreicherungsergebnisse mit dem Paket "gglot2" dar.

15. Analyse der Unterschiede in der Genaktivität

HINWEIS: TMEM200A Scoring in jeder Krebsprobe wurde mit Hilfe von ssGSEA (Single-Sample Gene Set Enrichment Analysis)²⁷ berechnet, und die differentielle Analyse der Genaktivität in TMEM200A Krebs- und gesunden Geweben wurde für verschiedene Krebsarten durchgeführt.

1. Basierend auf den RNA-Seq-Daten von 33 Tumortypen, die in Schritt 1.7 heruntergeladen wurden, entpacken Sie alle heruntergeladenen Dateien und legen Sie sie in einem einheitlichen Ordner ab.
2. Legen Sie die merge.txt Datei im obigen Ordner ab.
   HINWEIS: Die Daten in merge.txt Datei von BioWolf (www.biowolf.cn) enthalten die Genexpression für alle Patienten in allen Tumoren in der Datenbank The Cancer Genome Atlas (TCGA).
3. Öffnen Sie den R-Code (ssGSEAR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
4. Nehmen Sie die Zeile, in der geneName im R-Code (ssGSEAR) steht, und geben Sie die Gen-ID (TMEM200A) ein.
5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (ssGSEAR) aus. Holen Sie sich die Bewertungsdatei für die Genaktivität: scores.txt.
   HINWEIS: Mit dem ssGSEA-Algorithmus konstruieren wir zunächst eine Gensatzdatei basierend auf den Korrelationskoeffizienten zwischen Genen gemäß den in der merge.txt Datei bereitgestellten Daten und identifizieren die Gene mit einer höheren Korrelation mit dem Zielgen (TMEM200A) aus der Datei. Dann werden die Gene mit der höheren Korrelation als aktive Gene von TMEM200A vereinheitlicht, und schließlich erhalten wir die Bewertung der aktiven Gene in jeder Probe.
6. Öffnen Sie den R-Code (scoreDiffR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die scores.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
7. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (scoreDiffR) aus, und zeichnen Sie das Bild durch die Pakete "plyr", "reshape2" und "ggpubr".

16. Klinisch-pathologische Korrelations- und Überlebensprognoseanalyse

1. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
2. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
3. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
4. Bewegen Sie den Mauszeiger über die Seite und scrollen Sie nach unten, um die Registerkarte TCGA Pan-Cancer (PANCAN) zu finden.
5. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. Wählen Sie im Menü "Phänotyp " die Registerkarte "Kuratierte klinische Daten" aus und klicken Sie darauf.
7. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
   HINWEIS: Laden Sie klinische Daten für 33 Krebsarten aus der TCGA-Datenbank unter dem obigen Link herunter.
8. Entpacken Sie die heruntergeladene klinische Datendatei und öffnen Sie die entpackte Datei im xls-Dateiformat.
9. Organisieren und bewahren Sie die erforderlichen klinischen Daten (Stadium, Alter, pathologisches Stadium und Patientenstatus) in der Datei auf, löschen Sie die verbleibenden nicht benötigten klinischen Daten und speichern Sie die gesamte Datei als Datei im txt-Format, nachdem Sie sie in klinisch umbenannt haben.
10. Legen Sie diese Datei basierend auf den in Schritt 1.9 ermittelten singleGeneExp.txt im selben Ordner wie die organisierte clinical.txt Datei ab.
11. Entpacken Sie die heruntergeladenen klinischen Daten und legen Sie die singleGeneExp.txt - und clinical.txt Dateien im selben Ordner wie die entpackten klinischen Dateien ab.
12. Öffnen Sie den R-Code (clinicalDiffR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
13. Öffnen Sie die R-Software, führen Sie den geänderten R-Code (clinicalDiffR) aus, und zeichnen Sie das Bild mit dem Paket "ggpubr".
14. Rufen Sie die Benutzeroberfläche der UCSC Xena-Website auf.
15. Klicken Sie auf die Registerkarte Xena starten .
16. Klicken Sie auf die Registerkarte DATENSÄTZE am oberen Bildschirmrand.
17. Klicken Sie aus den 129 Kohorten und 1.571 Datensätzen auf dieser Seite auf die Registerkarte für insgesamt 33 Krebsarten wie GDC TCGA Akute myeloische Leukämie (LAML), GDC TCGA Nebennierenrindenkrebs (ACC), GDC TCGA Gallengangskrebs (CHOL) und mehr.
18. Wählen Sie im Phänotyp-Menü die Registerkarte Überlebensdaten aus und klicken Sie darauf.
19. Klicken Sie im Download-Menü auf den entsprechenden Link.
20. Entpacken Sie das Zip-Archiv mit Überlebensdaten für 33 verschiedene Krebsarten in einer einzigen Datei im Desktop-Ordner des Computers.
21. Legen Sie die entpackten Überlebensdaten im selben Ordner wie die singleGeneExp.txt Datei ab, die Sie in Schritt 1.9 erhalten haben.
22. Öffnen Sie den R-Code (preOSR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich der obige Ordner befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
23. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (preOSR) aus. Berechnen Sie mit dem Paket "limma", um eine Datendatei über das Überleben der TMEM200A bei Pankarzinom zu erhalten: expTime.txt.
24. Öffnen Sie den R-Code (OSR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich die expTime.txt Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
25. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (OSR) aus. Führen Sie eine KM-Analyse mit den Paketen "survival" und "survminer" basierend auf den Daten in der expTime.txt Datei durch und zeichnen Sie die Überlebenskurven für TMEM200A bei Pan-Krebs auf.

17. Univariate und multivariate Cox-Regressionsanalysen mit Waldparzellenbau

1. Öffnen Sie den R-Code (COXR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich die expTime.txt Datei von 16.23 befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
2. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (COXR) aus. Führen Sie basierend auf den Daten in der expTime.txt Datei univariate COX-Regressionsanalysen mit den Paketen "survival", "survminer" und "forestplot" durch, um ein univariates Forest-Diagramm von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten zu zeichnen.
3. Legen Sie die expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 und clinical.txt aus Schritt 16.10 im selben Ordner ab.
4. Öffnen Sie den R-Code (multicoxR), kopieren Sie den Pfad, in dem sich der Ordner mit der expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 und clinical.txt Datei aus Schritt 16.10 befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
5. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (multicoxR) aus. Führen Sie eine multivariate COX-Regressionsanalyse mit den Paketen "survival" und "survminer" durch, um ein multivariates Forest-Diagramm der TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten basierend auf den Daten in den expTime.txt - und clinical.txt-Dateien zu zeichnen.

18. Prognostisches Modell des Magenkarzinoms basierend auf TMEM200A Expression und klinischen Merkmalen

1. Legen Sie die clinical.txt Datei aus Schritt 16.10 und die expTime.txt Datei aus Schritt 16.23 im selben Ordner ab.
2. Öffnen Sie den R-Code (NomoR) und kopieren Sie den Pfad, in dem sich die obige txt-Datei befindet, und fügen Sie ihn in die Zeile ein, in der sich setwd im R-Code befindet.
3. Öffnen Sie die R-Software, und führen Sie den geänderten R-Code (NomoR) aus. Verwenden Sie die Softwarepakete "survival", "regplot" und "rms" für TMEM200A Expressionsdaten in GC und klinischen Daten, um ein prognostisches Modell zur Vorhersage des Patientenüberlebens zu erstellen.

19. Zellkultur und siRNA-Transfektion von TMEM200A

ANMERKUNG: Humane STAD HGC-27-Zellen, SGC-7901-Zellen und humane GES-1-Zellen des Magenschleimhautepithels wurden kommerziell gewonnen (siehe Materialtabelle), wiederbelebt, in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 vollständigem Medium (mit 10 % neonatalem fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Mischung) geimpft und bei 37 °C in einem 5%igen CO₂ kultiviert Zellkultur-Inkubator. Das Nährmedium wurde alle 2-3 Tage gewechselt. Die Zellen in gutem Wachstumszustand wurden in Sechs-Well-Platten gemäß (2-3) × 10⁵ Zellen pro Well inokuliert.

1. Nehmen Sie zunächst drei Mikrozentrifugenröhrchen und geben Sie 8 μl Transfektionsreagenz (siehe Table von Materialien) und 200 μl Basalmedium in jedes Röhrchen. Geben Sie dann 4 μg SiRNA1, SiRNA2 und SiRNA3 in jedes Röhrchen.
   HINWEIS: Für TMEM200A Knockdown wurde siRNA entworfen und gekauft (siehe Materialtabelle).
2. Mischen Sie die Mischung in den drei Mikrozentrifugenröhrchen gründlich und geben Sie sie in jede der drei Vertiefungen der 6-Well-Platte. Schütteln Sie die 6-Well-Platte vorsichtig, um die Mischung gleichmäßig zu verteilen. Kennzeichnen Sie die drei Vertiefungen, in denen das Gemisch zugegeben wurde , als SiRNA-1, SiRNA-2 und SiRNA-3.
3. Wenn die Zellen 4-6 h inkubiert wurden, ersetzen Sie die Hälfte des Mediums in den drei Unterwells der 6-Well-Platte.
   HINWEIS: Wenn Sie die Hälfte des vollständigen Mediums ersetzen, saugen Sie die Hälfte des ursprünglichen vollständigen Mediums an und füllen Sie es mit der Hälfte des frischen vollständigen Mediums auf.
4. Vierundzwanzig bis 48 Stunden später werden TMEM200A siRNA-transfizierte Zellen als Versuchsgruppe und nicht transfizierte Zellen als negative Kontrollgruppe verwendet. Führen Sie eine quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR, siehe Abschnitt 20) durch, um die Wirkung der Transfektion auf die Zellen zu beurteilen.

20. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion

1. Verwerfen Sie das Zellkulturmedium in jeder Untergruppe und waschen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
2. Isolieren Sie die Gesamt-RNA mit einem RNA-Isolationskit (siehe Materialtabelle).
3. Schätzen Sie die RNA-Konzentration und synthetisieren Sie cDNA mit 1 μg RNA unter Verwendung eines cDNA-Synthesekits gemäß den Anweisungen des Herstellers.
4. Durchführung einer quantitativen Echtzeit-PCR (qRT-PCR) mit 10-fachen Verdünnungen von cDNA in 10 μl Reaktionsmischung, einschließlich humanspezifischer Vorwärts- und Rückwärtsprimer für GAPDH (zur Standardisierung), TMEM200A (siehe Materialtabelle) und qPCR-Mastermix, unter Verwendung des Real-Time-PCR-Assay-Systems.
   HINWEIS: Führen Sie jedes Experiment in dreifacher Ausführung durch.
5. Verwenden Sie die folgenden qPCR-Reaktionsbedingungen: Initialisierung, 95 °C für 3 min; Denaturierung, 95 °C für 10 s; Glühen, 60 °C für 30 s; und Verlängerung, 80 °C für 10 s; Wiederholen Sie die Denaturierung, das Glühen und die Verlängerung 40x. Bestimmen Sie die relative Expression jedes Gens unter Verwendung der ^{2-ΔΔCt-Technik 28}.
6. Wiederholen Sie die Experimente mindestens dreimal, um biologische Triplikate zu erhalten.

21. Western-Blot-Nachweis relevanter Proteinexpression

1. Verwerfen Sie das Zellkulturmedium in jeder Untergruppe und waschen Sie die Zellen vorsichtig mit 2 x 1 ml PBS.
2. Kühlen Sie die 6-Well-Platten mit den Zellen auf Eis ab und fügen Sie 150 μl vorgekühlten RIPA-Lysepuffer (Radio Immune Precipitation Assay) hinzu (150 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,5 % Natriumdesoxycholat, 0,1 % SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 und frisch hinzugefügter Protease-Inhibitor-Cocktail). Lassen Sie die Lyse 10 Minuten lang auf Eis laufen.
3. Entfernen Sie mit einem Kunststoff-Zellschaber anhaftende Zellen aus der Schale und geben Sie die Zelllösung vorsichtig in ein vorgekühltes Mikrozentrifugenröhrchen um.
4. Das Zelllysat wird 10 min bei 1,5 ×^{10 4} g bei 4 °C zentrifugiert. Den Überstand in ein neues 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen überführen.
5. Verwenden Sie ein BCA-Protein-Assay-Kit, um den Proteingehalt gemäß den Anweisungen des Herstellers zu bestimmen.
6. Laden Sie 30 g Protein aus jeder Probe auf ein 10%iges Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Gel (SDS-PAGE) und lassen Sie es 0,5 h bei 80 V laufen, gefolgt von 1,5 h bei 120 V.
7. Die Proteine aus dem Gel werden 1-1,5 h lang bei einer Spannung von 300 mA auf eine 45 μm Polyvinylidendifluorid (PVDF)-Membran übertragen.
8. Nachdem Sie die PVDF-Membran auf einen Schüttler gelegt und 3 x 5 Minuten lang geschüttelt haben, geben Sie Tris-gepufferte Kochsalzlösung mit Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl und 0,1 % Tween 20) mit der Proteinseite (Gelseite) nach oben in den entsprechenden Behälter.
9. Legen Sie die Membran in den Blockierungspuffer (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie sie 0,5 h bei Raumtemperatur.
10. Waschen Sie die Membran 3 x 10 Minuten lang mit TBST.
11. Die Membran wird mit Primärantikörpern gegen Phospho-AKT (p-AKT; 1:1.000), Gesamt-AKT 1:1.000, E-Cadherin (E-ca; 1:1.000), N-Cadherin (N-ca; 1:1.000), Vimentin 1:1.000, Schnecke 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH; 1:1.000) über Nacht bei 4 °C inkubiert.
12. Waschen Sie die Membran 3 x 10 min lang und inkubieren Sie die Membran mit einem Sekundärantikörper von Kaninchen oder Maus (1:5.000) für 1 h bei Raumtemperatur.
13. Inkubieren Sie die PVDF-Membran 30 s lang mit ECL-Substrat und detektieren Sie das Signal mit einem Bildgebungssystem.

22. CCK-8-Assay

1. Besiedeln Sie humane STAD HGC-27-Zellen in gutem Wachstumszustand in 96-Well-Platten.
2. Wenn die Zelldichte 60-70% erreicht, transfizieren Sie die Zellen mit TMEM200A siRNA (wie in Schritt 19.3).
3. Die transfizierten Zellen werden in 96-Well-Platten mit einer Zelldichte von 5 × 10 ³/Well (Zählung lebensfähiger Zellen mit einem Zellzähler) ausgesät, in NC - und TMEM200A siRNA-Gruppen (mit drei Replikat-Wells in jeder Gruppe) unterteilt und bei 37 °C inkubiert.
4. CCK-8-Reagenz nach 0, 24, 48, 72 und 96 h zugeben und 2 h bei 37 °C inkubieren. Messen Sie die Extinktion (450 nm) mit einem multifunktionalen Enzymmarkierer.

Ergebnisse

Expression von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten
Wie in Abbildung 1 dargestellt, analysierten wir zunächst die unterschiedlichen Expressionsniveaus von TMEM200A bei verschiedenen Krebsarten anhand verschiedener Datenbanken. TMEM200A Expression war bei Cholangiokarzinomen (CHOL), Plattenepithelkarzinomen im Kopf- und Halsbereich (HNSC), klarzelligen Nierenkarzinomen (KIRC), renalen papillärzelligen Karzinomen (KIRP), hepato...

Diskussion

TMEM200A gehört zu einer Familie von TMEMs, die für die Vermehrung von Krebszellen unerlässlich sind³⁸. Die variable Expression von TMEM200A bei verschiedenen Malignomen hat weniger Aufmerksamkeit erhalten, und es fehlt an einer gründlichen Untersuchung von Krebserkrankungen. Es häufen sich jedoch weiterhin Hinweise darauf, dass die TMEM-Transmembranproteinfamilie wichtig sein kann, um Krebszellen durch Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen bösartig zu halten, z. B. förd...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold