Analyse multiomique de TMEM200A en tant que biomarqueur pancancéreux

Résumé

Ici, un protocole est présenté dans lequel de multiples outils bioinformatiques sont combinés pour étudier les fonctions biologiques de TMEM200A dans le cancer. De plus, nous validons également expérimentalement les prédictions bioinformatiques.

Résumé

La protéine transmembranaire, TMEM200A, est connue pour être associée aux cancers humains et à l’infiltration immunitaire. Ici, nous avons évalué la fonction de TMEM200A dans les cancers courants par analyse multiomique et utilisé des cultures cellulaires in vitro de cellules gastriques pour vérifier les résultats. L’expression de TMEM200A dans plusieurs types de cancer humain a été évaluée à l’aide des données de séquençage de l’ARN de la base de données Xena de l’UCSC. L’analyse bioinformatique a révélé un rôle potentiel de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique.

Des cultures de lignées cellulaires gastriques et cancéreuses normales ont été cultivées et TMEM200A a été abattue. Les niveaux d’expression de TMEM200A ont été mesurés à l’aide d’une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel et d’un transfert Western. Des études in vitro de perte de fonction ont ensuite été utilisées pour déterminer les rôles de la TMEM200A dans le comportement malin et la formation tumorale des cellules cancéreuses gastriques (GC). Des Western blots ont été utilisés pour évaluer l’effet de l’inhibition sur la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) et la voie de signalisation PI3K/AKT dans la GC. L’analyse bioinformatique a montré que TMEM200A était exprimée à des niveaux élevés dans la GC.

La prolifération des cellules GC a été inhibée par TMEM200A knockdown, qui a également diminué la vimentine, la N-cadhérine et les protéines Snai, et a inhibé la phosphorylation de l’AKT. La voie de signalisation PI3K/AKT semble également être impliquée dans la régulation médiée par TMEM200A du développement de la GC. Les résultats présentés ici suggèrent que TMEM200A régule le microenvironnement tumoral en affectant l’EMT. TMEM200A peut également affecter l’EMT par le biais de la signalisation PI3K/AKT, influençant ainsi le microenvironnement tumoral. Par conséquent, dans les pan-cancers, en particulier la GC, TMEM200A peut être un biomarqueur et un oncogène potentiel.

Introduction

Le cancer est devenu un problème de santé publique persistant mettant en danger la santé humaine dans le monde¹en raison de ses taux élevés de morbidité et de mortalité dans le monde, ce qui représente un lourd fardeau financier et médical pour la société². Des progrès significatifs dans le traitement du cancer ont été réalisés ces dernières années grâce à la découverte de marqueurs du cancer³, et les chercheurs ont mis au point de nouvelles méthodes de diagnostic et de nouveaux médicaments pour traiter le cancer. Cependant, certains patients atteints de cancer ont encore un mauvais pronostic en raison de facteurs tels que la résistance aux médicaments, les effets secondaires des médicaments et la sensibilité chimique⁴. Par conséquent, il est urgent d’identifier de nouveaux biomarqueurs pour le dépistage et le traitement des cancers à un stade précoce⁵.

Les protéines membranaires sont des protéines qui peuvent se lier et s’intégrer dans les cellules et les membranes des organites⁶. Celles-ci peuvent être regroupées en trois catégories en fonction de la force de liaison à la membrane et de leur emplacement : les protéines ancrées dans les lipides, les protéines intégrales et les protéines membranaires périphériques ^7,8. Une protéine transmembranaire (TMEM) est une protéine membranaire intégrale constituée d’au moins un segment transmembranaire⁹, qui traverse complètement ou partiellement la membrane biologique.

Bien que les mécanismes d’action des protéines appartenant à la famille des TMEM ne soient pas bien compris, ces protéines sont connues pour être impliquées dans plusieurs types de cancers¹⁰. Plusieurs protéines TMEM sont associées à des phénotypes migratoires, prolifératifs et invasifs, et leur expression est souvent associée au pronostic¹¹ du patient. Par conséquent, les membres de la famille TMEM sont devenus la cible de la recherche. Un examen complet des rapports existants sur le TMEM a révélé qu’ils sont principalement associés à la signalisation inter- et intracellulaire¹², aux maladies liées au système immunitaire et à la tumorigenèse¹⁰. De nombreux TMEM possèdent également des fonctions physiologiques importantes, par exemple, les canaux ioniques dans la membrane plasmique, l’activation des voies de transduction du signal, ainsi que la médiation de la chimiotaxie cellulaire, de l’adhésion, de l’apoptose et de l’autophagie¹⁰. Par conséquent, nous avons émis l’hypothèse que les protéines TMEM pourraient être des marqueurs pronostiques importants dans la détection et le traitement des tumeurs.

TMEM200A expression est significativement élevée dans le cancer gastrique (GC). L’expression plus élevée de TMEM200A¹³, qui a huit exons et une longueur totale de 77,536 kb sur le chromosome 6q23.1, a été liée à un mauvais pronostic de survie globale (SG) dans les cas de GC. Pourtant, les changements dans son expression ont rarement été rapportés dans les études en oncologie. Cet article compare et analyse l’utilité de l’TMEM200A en tant que cible thérapeutique et marqueur diagnostique de tumeur dans diverses études sur le cancer à l’aide de différents ensembles de données accessibles au public. Nous avons évalué l’efficacité de TMEM200A en tant que biomarqueur diagnostique et pronostique pancancéreux ainsi que ses niveaux d’expression dans divers types de cancer humain à l’aide de données de séquençage de l’ARN provenant des bases de données UCSC Xena et TCGA, ainsi que par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR) et Western blot.

L’effet des niveaux d’expression de TMEM200A sur les taux de mutation, les processus de régulation, le diagnostic et le pronostic tumoral, l’infiltration immunitaire et l’immunothérapie a été étudié plus en détail à l’aide d’un mélange d’outils informatiques et de sites Web de données. Les bases de données CBioPortal et COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) ont été utilisées pour examiner les mutations dans TMEM200A. Les sites Web Sangerbox et TISIDB ont été utilisés pour comprendre comment TMEM200A influence l’infiltration immunitaire. L’outil en ligne TISCH (Tumor Immune Single Cell Center) et la base de données CancerSEA ont été utilisés pour étudier la fonction de TMEM200A. Enfin, pour évaluer l’impact de la TMEM200A sur le comportement malin et la fonction de développement tumoral des cellules GC, une expérience de perte de fonction a été menée dans un essai in vitro . De plus, un transfert Western a été effectué pour évaluer comment TMEM200A knockdown affectait la voie de signalisation PI3K/AKT et la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) dans la GC.

Protocole

1. La base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA)

NOTE : La base de données de l’Atlas du génome du cancer (TCGA) contient les données de séquençage des gènes dans différents tissus tumoraux¹⁴. Les données de séquençage de l’ARN dans TCGA pour l’étude des formats de transcrits TMEM200A par partie par million (TPM) ont été extraites du site Web Xena de l’UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) et log2 transformées pour comparer les expressions entre les échantillons.

1. Accédez à l’interface du site Web d’UCSC Xena .
2. Cliquez sur l’onglet Lancer Xena .
3. Cliquez sur l’onglet ENSEMBLES DE DONNÉES en haut de l’écran.
4. Parmi les 129 cohortes et les 1 571 ensembles de données de cette page, cliquez sur l’onglet pour un total de 33 cancers tels que la leucémie myéloïde aiguë (LAM) GDC TCGA, le cancer corticosurrénalien GDC TCGA (ACC), le cancer des canaux biliaires GDC TCGA (CHOL), et plus encore.
5. Dans le menu RNAseq d’expression génique , sélectionnez et cliquez sur l’onglet HTSeq - FPKM GDC Hub .
   REMARQUE : HTSeq - FPKM GDC Hub représente les données qui ont été corrigées par consentement.
6. Dans le menu de téléchargement , cliquez sur le lien correspondant.
   REMARQUE : Par la méthode ci-dessus, les données de séquençage de l’ARN ont été téléchargées pour 33 types de cancer différents.
7. Décompressez l’archive zip des données de séquençage de l’ARN pour 33 types de cancer différents dans un seul fichier dans le dossier du bureau de l’ordinateur.
8. Unifiez les fichiers txt décompressés dans le même dossier et placez les scripts Perl dans ce dossier.
9. Ouvrez le logiciel Perl , copiez et collez le chemin du dossier dans le logiciel Perl où se trouve le curseur de la souris, appuyez sur la touche Entrée , entrez le nom du code Perl et le nom du gène (TMEM200A), puis appuyez sur la touche Entrée pour obtenir un nouveau fichier txt (singleGeneExp.txt).
   NOTE : Ce nouveau fichier txt (singleGeneExp.txt) contient l’expression génique de TMEM200A dans 33 cancers chez différents patients.
10. Ouvrez le code R (diffR) et copiez et collez le chemin d’accès où se trouve le fichier singleGeneExp.txt à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
11. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié (diffR) et dessinez l’image à l’aide du paquet « ggpubr ».

2. La base de données TIMER2.0

1. Accédez à l’interface du site Web de la base de données TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) ¹⁶.
2. Cliquez sur l’onglet Exploration du cancer.
3. Entrez l’ID du gène (TMEM200A) dans la zone de recherche et cliquez sur l’onglet Soumettre pour obtenir les images d’expression différentielle des TMEM200A dans différents types de tumeurs.

3. Atlas des protéines humaines (HPA)

1. Accédez à l’interface Web de l’Atlas des protéines humaines (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷.
2. Tapez ID (TMEM200A) dans la zone de recherche et cliquez sur le bouton Rechercher . Sélectionnez le sous-atlas TISSUE.
3. Passez la souris sur la page et faites défiler vers le bas pour trouver l’onglet Vue d’ensemble de l’expression des protéines .
   REMARQUE : La section Vue d’ensemble de l’expression des protéines montre les niveaux d’expression des protéines de TMEM200A dans 45 organes du corps humain.

4. Le réseau de plate-forme de méthylation de l’ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium

REMARQUE : Le réseau de plate-forme de méthylation de l’ADN HumanMethylation450 Illumina Infinium a été utilisé pour collecter des données sur la méthylation. Nous avons pu évaluer les niveaux de méthylation de l’ADN TMEM200A à l’aide de la base de données SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)¹⁸.

1. Accédez à l’interface du site Web SMART .
2. Entrez l’ID du gène (TMEM200A) dans la zone de recherche pour obtenir la distribution des TMEM200A dans les chromosomes et le niveau de méthylation de TMEM200A dans différents types de tumeurs malignes.
3. Faites défiler la page vers le bas jusqu’au menu Cliquez pour vérifier la méthylation agrégée CpG et cliquez sur le bouton Tracer . En bas de la page, recherchez et cliquez sur le bouton Télécharger la figure . Téléchargez la figure.

5. La base de données UALCAN

1. Accédez à l’interface du site Web d’UALCAN .
   NOTE : Des boîtes à moustaches des niveaux de méthylation du promoteur TMEM200A dans diverses tumeurs malignes ont été générées à l’aide de la base de données UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹
2. En haut de la page, cliquez sur le bouton TCGA .
3. Entrez TMEM200A dans la zone de saisie Identification génétique à l’écran. Dans le menu du jeu de données TCGA , faites défiler vers le bas et sélectionnez le type de cancer à interroger.
4. Après avoir cliqué sur le bouton Explorer , cliquez sur son sous-groupe d’analyse Méthylation dans le menu Liens pour l’analyse afin d’obtenir les résultats de méthylation de cette tumeur.
   NOTE : Par cette méthode, nous avons obtenu des résultats de méthylation pour 22 tumeurs dans la base de données UALCAN .

6. La base de données du Catalogue des mutations somatiques dans les cellules cancéreuses (COSMIC)

1. Rendez-vous sur l’interface du site Web du Catalogue des mutations somatiques dans les cellules cancéreuses (COSMIC).
   NOTE : Les données sur les mutations codantes, les réarrangements génomiques mutants non codants et les gènes de fusion dans le génome humain sont disponibles dans la base de données ²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) du Catalogue des mutations somatiques dans les cellules cancéreuses (COSMIC), qui est également utilisée pour déterminer la fréquence de diverses mutations TMEM200A dans divers cancers.
2. Entrez l’identifiant du gène (TMEM200A) dans la zone de recherche et cliquez sur le bouton RECHERCHER pour accéder à un nouvel écran.
3. Dans le menu Gènes , localisez et cliquez sur le lien où apparaît le nom de l’identifiant génétique de l’TMEM200A .
4. Recherchez la colonne Groupement de distribution de mutation sur la nouvelle page pour obtenir l’état de mutation de TMEM200A dans la tumeur.

7. Portail CBioPortail

1. Accédez à l’interface du site Web CBioPortal .
   REMARQUE : Les données génomiques sur le cancer peuvent être trouvées, téléchargées, analysées et visualisées à l’aide de la base de données cBioPortal (www.cioportal.org). Les mutations somatiques, les changements du nombre de copies d’ADN (CNA), l’expression de l’ARNm et du microARN (miARN), la méthylation de l’ADN, l’abondance des protéines et l’abondance des phosphoprotéines ne sont que quelques-uns des types de données génomiques qui sont intégrés par cBioPortal²¹. Avec cBioPortal, un large éventail d’études peut être réalisé ; Cependant, l’accent est mis sur les différentes analyses relatives aux mutations et à leur visualisation.
2. Sélectionnez le jeu de données Pan-cancer analysis of whole genomes (Analyse pancancéreuse des génomes entiers) dans la sous-section PanCancer Studies (Études Pan-Cancer de la section Select Studies for Visualization & Analysis (Sélectionner les études pour la visualisation et l’analyse ). Ensuite, cliquez sur le bouton Query By Gene (Rechercher par gène ).
3. Entrez l’ID du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête de Entrer des gènes. Cliquez sur le bouton Envoyer la requête .
4. Cliquez sur le bouton Type de cancer détaillé en haut de la page pour obtenir les mutations de TMEM200A dans différents types de cancers.

8. Outil Sangerbox 3.0

1. Accédez à l’interface de l’outil Sangerbox 3.0 .
   NOTE : La corrélation de l’expression de TMEM200A avec les cellules infiltrantes immunitaires, les agents immunosuppresseurs, les facteurs immunostimulants et les molécules du CMH (complexe majeur d’histocompatibilité) dans tous les cancers a été analysée par infiltration immunitaire CIBERSORT à l’aide des données d’infiltration immunitaire pancancéreuse dans l’outil²² (http://vip.sangerbox.com/ de Sangerbox 3.0).
2. Dans la barre d’outils située sur le côté gauche de la page, sélectionnez et cliquez sur l’onglet Analyse immunocellulaire (CIBERSORT) dans le menu Analyse pancancéreuse .
3. Entrez l’ID du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête de Entrer des gènes. Cliquez sur le bouton Envoyer .

9. Base de données TISIDB

1. Rendez-vous sur l’interface du site Web de TISIDB .
   NOTE : La base de données TISIDB²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) a été utilisée pour examiner la corrélation de l’expression de TMEM200A avec les cellules immunoinfiltrantes, les agents immunosuppresseurs, les facteurs immunostimulants et les molécules du CMH dans divers cancers.
2. Entrez le symbole du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête de Entrer des gènes. Cliquez sur le bouton Envoyer .
3. Cliquez sur les sections Lymphocytes, Immunomodulateurs, Chimiokines et Sous-type en haut de la page. Téléchargez les images correspondantes en bas de page.

10. La base de données TIDE

1. Rendez-vous sur l’interface du site Web de TIDE .
   REMARQUE : La base de données TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) a été utilisée pour évaluer le potentiel de TMEM200A en tant que biomarqueur pour prédire la réponse au traitement par blocage du point de contrôle immunitaire tumoral.
2. Entrez l’adresse e-mail sur l’écran initial pour enregistrer le compte et vous connecter.
3. Trouvez la sous-section Évaluation des biomarqueurs en haut de la page et cliquez dessus.
4. Entrez l’ID du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête pour Entrer des gènes au bas de la page. Ensuite, cliquez sur le bouton Envoyer .
5. Dans la page, faites glisser la souris pour faire glisser la page vers le bas afin de trouver les résultats de l’analyse.

11. La base de données CancerSEA

1. Rendez-vous sur l’interface du site Web de CancerSEA .
   NOTE : À l’aide de données de séquençage de cellules uniques, les relations entre l’expression de TMEM200A et l’état fonctionnel de différentes cellules tumorales ont été étudiées. Cela a été fait à l’aide de la base de données CancerSEA²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. En haut de la page, recherchez et cliquez sur l’onglet Rechercher .
3. Entrez l’ID du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête de Entrer des gènes. Cliquez sur le bouton Envoyer .

12. L’outil de réseau de centre unicellulaire immunitaire tumoral (TISCH)

1. Accédez à l’interface Web de l’outil réseau du centre unicellulaire immunitaire tumoral (TISCH).
   REMARQUE : La corrélation entre les niveaux d’expression des cellules TMEM200A et cancéreuses a également été démontrée à l’aide de l’outil de réseau TISCH (tumor immune single-cell center)²⁵.
2. Entrez l’ID du gène cible (TMEM200A) dans la zone de requête de Entrer des gènes. Cliquez sur le bouton Explorer .
3. Dans le menu Type de cancer de cette page, sélectionnez et cliquez sur le jeu de données Tous les cancers . Ensuite, faites défiler la page vers le bas et cliquez sur le bouton Rechercher .

13. GeneMANIA (en anglais seulement)

1. Rendez-vous sur l’interface du site GeneMANIA .
   NOTE : La corrélation entre le TMEM200A et ses gènes fonctionnellement pertinents a été prédite à l’aide de la stratégie d’intégration du réseau multi-association de gènes Site Web GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ pour la construction de réseaux d’interaction gène-gène (GGI ).
2. Dans la zone de recherche en haut à gauche de la page, entrez l’ID du gène (TMEM200A) et cliquez sur Outils de recherche.
   NOTE : L’outil Web GeneMANIA a été utilisé pour trouver 20 gènes associés à TMEM200A.

14. Analyse de l’enrichissement fonctionnel

1. Enregistrez les ID de symbole des gènes à analyser pour enrichissement au format de fichier txt.
2. Ouvrez le code R (symbolidR) et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier txt ci-dessus sur la ligne où se trouve setwd dans le code R.
3. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (symbolidR). Convertissez les identifiants symboliques de ces gènes en entrezID via l’application « org. Hs.eg.db ». Récupérez le fichier id.txt .
4. Ouvrez le code R (GOR et KEGGR) et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier id.txt à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
5. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (GOR et KEGGR). Pour suivre ce protocole, analysez ces gènes pour l’enrichissement GO et KEGG par les packages « clusterProfiler », « org. Hs.eg.db » et « enrichplot » et tracez les résultats de l’enrichissement à l’aide du package « gglot2 ».

15. Analyse des différences dans l’activité des gènes

NOTA : TMEM200A score dans chaque échantillon de cancer a été calculé à l’aide de ssGSEA (analyse d’enrichissement de l’ensemble des gènes à échantillon unique)²⁷, et l’analyse différentielle de TMEM200A l’activité des gènes dans les tissus cancéreux et sains a été effectuée pour divers cancers.

1. Sur la base des données de séquençage de l’ARN de 33 types de tumeurs téléchargées à l’étape 1.7, décompressez tous les fichiers téléchargés et placez-les dans un dossier unifié.
2. Placez le fichier merge.txt dans le dossier ci-dessus.
   REMARQUE : Les données contenues dans merge.txt fichier de BioWolf (www.biowolf.cn) contiennent l’expression génique de tous les patients dans toutes les tumeurs de la base de données The Cancer Genome Atlas (TCGA).
3. Ouvrez le code R (ssGSEAR) et copiez et collez le chemin où se trouve le dossier ci-dessus sur la ligne où se trouve setwd dans le code R.
4. Prenez la ligne où se trouve nom_gène dans le code R (ssGSEAR) et entrez l’ID du gène (TMEM200A).
5. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (ssGSEAR). Obtenir le fichier de notation de l’activité des gènes : scores.txt.
   NOTE : Avec l’algorithme ssGSEA, nous construisons d’abord un fichier d’ensemble de gènes basé sur les coefficients de corrélation entre les gènes selon les données fournies dans le fichier merge.txt et identifions les gènes ayant une corrélation plus élevée avec le gène cible (TMEM200A) à partir du fichier. Ensuite, les gènes ayant une corrélation plus élevée sont unifiés en tant que gènes actifs de TMEM200A, et enfin, nous obtenons le score des gènes actifs dans chaque échantillon.
6. Ouvrez le code R (scoreDiffR) et copiez et collez le chemin d’accès où se trouve le fichier scores.txt à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
7. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié (scoreDiffR) et dessinez l’image à l’aide des packages « plir », « reshape2 » et « ggpubr ».

16. Analyse de la corrélation clinicopathologique et du pronostic de survie

1. Accédez à l’interface du site Web d’UCSC Xena .
2. Cliquez sur l’onglet Lancer Xena .
3. Cliquez sur l’onglet ENSEMBLES DE DONNÉES en haut de l’écran.
4. Passez la souris sur la page et faites défiler vers le bas pour trouver l’onglet TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
5. Parmi les 129 cohortes et les 1 571 ensembles de données de cette page, cliquez sur l’onglet TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. Dans le menu phénotype , sélectionnez et cliquez sur l’onglet Données cliniques organisées.
7. Dans le menu de téléchargement , cliquez sur le lien correspondant.
   REMARQUE : Téléchargez les données cliniques de 33 cancers à partir de la base de données TCGA en cliquant sur le lien ci-dessus.
8. Décompressez le fichier de données cliniques téléchargé et ouvrez-le au format de fichier xls.
9. Organisez et conservez les données cliniques nécessaires (stade, âge, stade pathologique et statut du patient) dans le fichier, supprimez les données cliniques inutiles restantes et enregistrez l’intégralité du fichier en tant que fichier au format txt après l’avoir renommé clinique.
10. Sur la base des singleGeneExp.txt obtenues à l’étape 1.9, placez ce fichier dans le même dossier que le fichier clinical.txt organisé.
11. Décompressez les données cliniques téléchargées et placez les fichiers singleGeneExp.txt et clinical.txt dans le même dossier que les fichiers cliniques décompressés.
12. Ouvrez le code R (clinicalDiffR) et copiez et collez le chemin d’accès où se trouve le dossier ci-dessus à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
13. Ouvrez le logiciel R, exécutez le code R modifié (clinicalDiffR) et dessinez l’image à l’aide du package « ggpubr ».
14. Accédez à l’interface du site Web d’UCSC Xena .
15. Cliquez sur l’onglet Lancer Xena .
16. Cliquez sur l’onglet ENSEMBLES DE DONNÉES en haut de l’écran.
17. Parmi les 129 cohortes et les 1 571 ensembles de données de cette page, cliquez sur l’onglet pour un total de 33 cancers tels que la leucémie myéloïde aiguë (LAM) GDC TCGA, le cancer corticosurrénalien GDC TCGA (ACC), le cancer des canaux biliaires GDC TCGA (CHOL), et plus encore.
18. Dans le menu phénotype , sélectionnez et cliquez sur l’onglet Données de survie.
19. Dans le menu de téléchargement , cliquez sur le lien correspondant.
20. Décompressez l’archive zip des données de survie pour 33 types de cancer différents dans un seul fichier dans le dossier du bureau de l’ordinateur.
21. Placez les données de survie décompressées dans le même dossier que le fichier singleGeneExp.txt obtenu à l’étape 1.9.
22. Ouvrez le code R (preOSR) et copiez et collez le chemin où se trouve le dossier ci-dessus sur la ligne où se trouve setwd dans le code R.
23. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (preOSR). Calculez à l’aide du package « limma » pour obtenir un fichier de données sur la survie de la TMEM200A dans le pan-cancer : expTime.txt.
24. Ouvrez le code R (OSR) et copiez et collez le chemin d’accès où se trouve le fichier expTime.txt à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
25. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (OSR). Effectuez une analyse de la KM à l’aide des packages « survival » et « survminer » en fonction des données du fichier expTime.txt et tracez les courbes de survie pour les TMEM200A dans le pan-cancer.

17. Analyses de régression de Cox univariées et multivariées avec construction de parcelles forestières

1. Ouvrez le code R (COXR) et copiez et collez le chemin où nous avons obtenu le fichier expTime.txt de 16.23 à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
2. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (COXR). Sur la base des données du fichier expTime.txt , effectuez des analyses de régression COX univariées à l’aide des packages « survival », « survminer » et « forestplot » pour tracer un diagramme univarié de forêt de TMEM200A dans différents cancers.
3. Placez le fichier expTime.txt de l’étape 16.23 et clinical.txt de l’étape 16.10 dans le même dossier.
4. Ouvrez le code R (multicoxR) et copiez et collez le chemin d’accès où se trouve le dossier contenant le fichier expTime.txt de l’étape 16.23 et clinical.txt fichier de l’étape 16.10 jusqu’à la ligne où se trouve setwd dans le code R.
5. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (multicoxR). Effectuez une analyse de régression COX multivariée à l’aide des packages « survival » et « survminer » pour tracer un diagramme de forêt multivariée de TMEM200A dans différents cancers en fonction des données des fichiers expTime.txt et clinical.txt .

18. Modèle pronostique du cancer gastrique basé sur l’expression TMEM200A et les caractéristiques cliniques

1. Placez le fichier clinical.txt de l’étape 16.10 et le fichier expTime.txt de l’étape 16.23 dans le même dossier.
2. Ouvrez le code R (NomoR) et copiez et collez le chemin où se trouve le fichier txt ci-dessus sur la ligne où se trouve setwd dans le code R.
3. Ouvrez le logiciel R et exécutez le code R modifié (NomoR). Utilisez les progiciels « survival », « regplot » et « rms » pour les données d’expression TMEM200A dans la GC et les données cliniques afin de construire un modèle pronostique pour prédire la survie des patients.

19. Culture cellulaire et transfection de siRNA de TMEM200A

NOTE : Des cellules HGC-27 STAD humaines, des cellules SGC-7901 et des cellules GES-1 de l’épithélium de la muqueuse gastrique humaine ont été obtenues commercialement (voir le tableau des matériaux), réanimées, inoculées dans un milieu complet 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenant 10 % de sérum de veau fœtal néonatal et 1 % de mélange de pénicilline) et cultivées à 37 °C dans un mélange de CO₂ à 5 % incubateur de culture cellulaire. Le milieu de culture a été changé tous les 2-3 jours. Les cellules en bon état de croissance ont été inoculées dans des plaques à six puits selon (2-3) × 10^{à 5} cellules par puits.

1. Tout d’abord, prenez trois tubes de microcentrifugation et ajoutez 8 μL de réactif de transfection (voir laT able des matériaux) et 200 μL de milieu basal dans chaque tube. Ensuite, ajoutez 4 μg de SiRNA1, SiRNA2 et SiRNA3 dans chaque tube respectivement.
   REMARQUE : Pour TMEM200A knockdown, siRNA a été conçu et acheté (voir le tableau des matériaux).
2. Mélangez bien le mélange dans les trois tubes de microcentrifugation et ajoutez-le à chacun des trois puits de la plaque à 6 puits. Secouez doucement la plaque à 6 puits pour répartir uniformément le mélange. Étiquetez les trois puits où le mélange a été ajouté comme SiRNA-1, SiRNA-2 et SiRNA-3.
3. Lorsque les cellules ont été incubées pendant 4 à 6 h, replacez la moitié du milieu dans les trois sous-puits de la plaque à 6 puits.
   REMARQUE : Lorsque vous remplacez la moitié du milieu complet, aspirez la moitié du milieu complet d’origine et réapprovisionnez-le avec la moitié du milieu complet frais.
4. Vingt-quatre à 48 h plus tard, utilisez TMEM200A cellules transfectées par siRNA comme groupe expérimental et des cellules non transfectées comme groupe témoin négatif. Réaliser une réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (qRT-PCR, voir rubrique 20) pour évaluer l’effet de la transfection sur les cellules.

20. Réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel

1. Jetez le milieu de culture cellulaire de chaque sous-groupe et lavez délicatement les cellules deux fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Isolez l’ARN total à l’aide d’une trousse d’isolement de l’ARN (voir le tableau des matériaux).
3. Estimez la concentration d’ARN et synthétisez l’ADNc avec 1 μg d’ARN à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc, en suivant les instructions du fabricant.
4. Effectuez une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) sur des dilutions 10 fois supérieures à l’ADNc dans 10 μL de mélange réactionnel, y compris des amorces directes et inverses spécifiques à l’homme pour le GAPDH (pour la normalisation), le TMEM200A (voir le tableau des matériaux) et le mélange maître qPCR, à l’aide du système de dosage PCR en temps réel.
   REMARQUE : Effectuez chaque expérience en trois exemplaires.
5. Utiliser les conditions de réaction qPCR suivantes : initialisation, 95 °C pendant 3 min ; dénaturation, 95 °C pendant 10 s ; recuit, 60 °C pendant 30 s ; et extension, 80 °C pendant 10 s ; Répétez la dénaturation, le recuit et l’extension 40x. Déterminer l’expression relative de chaque gène à l’aide de la technique ^{2-ΔΔCt 28}.
6. Répétez les expériences au moins trois fois pour obtenir des triples biologiques.

21. Détection par transfert Western de l’expression des protéines pertinentes

1. Jeter le milieu de culture cellulaire de chaque sous-groupe et laver délicatement les cellules avec 2 x 1 mL de PBS.
2. Refroidir les plaques à 6 puits contenant les cellules sur glace et ajouter 150 μL de tampon de lyse prérefroidi pour le test de précipitation radio-immunitaire (RIPA) (150 mM de NaCl, 0,1 % de Triton X-100, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 50 mM de Tris-HCl pH 8,0 et un cocktail d’inhibiteurs de protéase fraîchement ajouté). Laisser la lyse se dérouler sur de la glace pendant 10 minutes.
3. À l’aide d’un grattoir à cellules en plastique, retirez les cellules adhérentes de la boîte et transférez délicatement la solution cellulaire dans un tube de microcentrifugation qui a été prérefroidi.
4. Centrifuger le lysat cellulaire pendant 10 min à 1,5 × 10⁴ g à 4 °C. Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL.
5. Utilisez un kit de dosage des protéines BCA pour déterminer la teneur en protéines selon les instructions du fabricant.
6. Charger 30 g de protéines de chaque échantillon sur un gel d’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 10 % (SDS-PAGE) et faire fonctionner à 80 V pendant 0,5 h, suivi de 1,5 h à 120 V.
7. Transférez les protéines du gel sur une membrane de polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 45 μm à une tension de 300 mA pendant 1 à 1,5 h.
8. Après avoir placé la membrane PVDF sur un agitateur et l’avoir agitée pendant 3 x 5 min, ajoutez une solution saline tamponnée Tris avec Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl et 0,1 % Tween 20) dans le récipient approprié avec le côté protéique (côté gel) vers le haut.
9. Placez la membrane dans le tampon de blocage (voir le tableau des matériaux) et incubez-la pendant 0,5 h à température ambiante.
10. Lavez la membrane avec TBST pendant 3 x 10 min.
11. Incuber la membrane avec des anticorps primaires contre la phospho-AKT (p-AKT ; 1 :1 000), l’AKT total 1 :1 000, l’E-cadhérine (E-ca ; 1 :1 000), la N-cadhérine (N-ca ; 1 :1 000), la Vimentine 1 :1 000, l’escargot 1 :1 000, TMEM200A 1 :1 000, la glycéraldéhyde 3-phosphate déshydrogénase (GAPDH ; 1 :1 000), pendant la nuit à 4 °C.
12. Lavez la membrane pendant 3 x 10 min et incubez-la avec un anticorps secondaire de lapin ou de souris (1 :5 000) pendant 1 h à température ambiante.
13. Incuber la membrane PVDF avec un substrat ECL pendant 30 s et détecter le signal à l’aide d’un système d’imagerie.

22. Dosage CCK-8

1. Semencer des cellules STAD HGC-27 humaines en bon état de croissance dans des plaques à 96 puits.
2. Lorsque la densité cellulaire atteint 60-70%, transfectez les cellules avec TMEM200A siRNA (comme à l’étape 19.3).
3. Ensemencer les cellules transfectées en plaques de 96 puits à une densité cellulaire de 5 × 10 ³/puits (compter les cellules viables à l’aide d’un compteur de cellules), divisées en groupes NC et TMEM200A siRNA (avec trois puits de répétition dans chaque groupe) et incubées à 37 °C.
4. Ajouter le réactif CCK-8 après 0, 24, 48, 72 et 96 h et incuber à 37 °C pendant 2 h. Mesurez l’absorbance (450 nm) à l’aide d’un étiqueteuse enzymatique multifonctionnelle.

Résultats

Expression de TMEM200A dans divers cancers
Comme l’illustre la figure 1, nous avons d’abord analysé les niveaux d’expression différentiels de TMEM200A dans divers cancers à l’aide de différentes bases de données. TMEM200A expression était élevée dans le cholangiocarcinome (CHOL), le carcinome épidermoïde de la tête et du cou (HNSC), le carcinome rénal à cellules claires (KIRC), le carcinome papillaire rénal...

Discussion

TMEM200A appartient à une famille de TMEM qui est essentielle à la prolifération des cellules cancéreuses³⁸. L’expression variable de la TMEM200A dans les différentes tumeurs malignes a reçu moins d’attention, et une enquête approfondie sur le cancer fait défaut. Cependant, les preuves continuent de s’accumuler, montrant que la famille des protéines transmembranaires TMEM peut être importante dans le maintien de la malignité des cellules cancéreuses grâce à de...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold