Analisi multiomica del TMEM200A come biomarcatore pan-tumorale

Riepilogo

Qui viene presentato un protocollo in cui vengono combinati più strumenti bioinformatici per studiare le funzioni biologiche dei TMEM200A nel cancro. Inoltre, validiamo sperimentalmente le previsioni bioinformatiche.

Abstract

La proteina transmembrana, TMEM200A, è nota per essere associata ai tumori umani e all'infiltrazione immunitaria. Qui, abbiamo valutato la funzione di TMEM200A nei tumori comuni mediante analisi multiomica e abbiamo utilizzato colture cellulari in vitro di cellule gastriche per verificare i risultati. L'espressione di TMEM200A in diversi tipi di cancro umano è stata valutata utilizzando i dati RNA-seq del database Xena dell'UCSC. L'analisi bioinformatica ha rivelato un potenziale ruolo della TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico.

Sono state coltivate colture di normali linee cellulari gastriche e tumorali e TMEM200A è stato abbattuto. I livelli di espressione di TMEM200A sono stati misurati utilizzando la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale e il western blotting. Sono stati quindi utilizzati studi in vitro sulla perdita di funzione per determinare il ruolo delle TMEM200A nel comportamento maligno e nella formazione tumorale delle cellule tumorali gastriche (GC). I Western blot sono stati utilizzati per valutare l'effetto del knockdown sulla transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) e sulla via di segnalazione PI3K/AKT nella GC. L'analisi bioinformatica ha mostrato che TMEM200A era espresso ad alti livelli nella GC.

La proliferazione delle cellule GC è stata inibita dal knockdown TMEM200A, che ha anche diminuito la vimentina, la N-caderina e le proteine Snai e ha inibito la fosforilazione di AKT. La via di segnalazione PI3K/AKT sembra anche essere coinvolta nella regolazione mediata da TMEM200A dello sviluppo dei GC. I risultati qui presentati suggeriscono che TMEM200A regola il microambiente tumorale influenzando l'EMT. TMEM200A può anche influenzare l'EMT attraverso la segnalazione PI3K/AKT, influenzando così il microambiente tumorale. Pertanto, nei pan-tumori, in particolare nei GC, TMEM200A può essere un potenziale biomarcatore e oncogene.

Introduzione

Il cancro è emerso come un problema persistente di salute pubblica che mette in pericolo la salute umana a livello globale¹a causa dei suoi elevati tassi di morbilità e mortalità in tutto il mondo, ponendo un pesante onere finanziario e medico alla società². Negli ultimi anni sono stati compiuti progressi significativi nella terapia del cancro grazie alla scoperta dei marcatori tumorali³ e i ricercatori hanno sviluppato nuovi metodi diagnostici e nuovi farmaci per il trattamento del cancro. Tuttavia, alcuni pazienti con cancro hanno ancora prognosi sfavorevoli a causa di fattori come la resistenza ai farmaci, gli effetti collaterali dei farmaci e la sensibilità chimica⁴. Pertanto, vi è un urgente bisogno di identificare nuovi biomarcatori per lo screening e il trattamento dei tumori in fase iniziale⁵.

Le proteine di membrana sono proteine che possono legarsi e integrarsi nelle cellule e nelle membrane degli organelli⁶. Queste possono essere raggruppate in tre categorie a seconda della forza di legame alla membrana e della loro posizione: proteine ancorate ai lipidi, proteine integrali e proteine di membrana periferica ^7,8. Una proteina transmembrana (TMEM) è una proteina di membrana integrale costituita da almeno un segmento^{transmembrana 9}, che passa completamente o parzialmente attraverso la membrana biologica.

Sebbene i meccanismi d'azione delle proteine appartenenti alla famiglia TMEM non siano ben compresi, è noto che queste proteine sono coinvolte in diversi tipi di tumori¹⁰. Diverse proteine TMEM sono associate a fenotipi migratori, proliferativi e invasivi e la loro espressione è spesso associata alla prognosi di un paziente¹¹. Pertanto, i membri della famiglia TMEM sono diventati l'obiettivo della ricerca. Una revisione completa dei rapporti esistenti su TMEM ha rivelato che sono per lo più associati alla segnalazione inter- e intracellulare¹², alle malattie immuno-correlate e alla tumorigenesi¹⁰. Molti TMEM possiedono anche importanti funzioni fisiologiche, ad esempio i canali ionici nella membrana plasmatica, l'attivazione delle vie di trasduzione del segnale, nonché la mediazione della chemiotassi cellulare, l'adesione, l'apoptosi e l'autofagia¹⁰. Pertanto, abbiamo ipotizzato che le proteine TMEM possano essere importanti marcatori prognostici nell'individuazione e nel trattamento dei tumori.

TMEM200A'espressione è significativamente elevata nel carcinoma gastrico (GC). Una maggiore espressione di TMEM200A¹³, che ha otto esoni e una lunghezza completa di 77,536 kb sul cromosoma 6q23.1, è stata collegata a una prognosi sfavorevole per la sopravvivenza globale (OS) nei casi di GC. Tuttavia, i cambiamenti nella sua espressione sono stati raramente riportati negli studi oncologici. Questo articolo confronta e analizza l'utilità della TMEM200A come bersaglio terapeutico e marcatore diagnostico del tumore in vari studi sul cancro utilizzando diversi set di dati disponibili pubblicamente. È stata valutata l'efficacia di TMEM200A come biomarcatore diagnostico e prognostico pan-cancro, nonché i suoi livelli di espressione in vari tipi di cancro umano utilizzando i dati RNA-seq dei database UCSC Xena e TCGA, nonché mediante reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) e western blotting.

L'effetto dei livelli di espressione TMEM200A sui tassi di mutazione, sui processi regolatori, sulla diagnosi e sulla prognosi del tumore, sull'infiltrazione immunitaria e sull'immunoterapia è stato ulteriormente studiato utilizzando un mix di strumenti computazionali e siti Web di set di dati. CBioPortal e i database COSMIC (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) sono stati utilizzati per esaminare le mutazioni in TMEM200A. I siti web Sangerbox e TISIDB sono stati utilizzati per capire come TMEM200A influenza l'infiltrazione immunitaria. Lo strumento online del Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) e il database CancerSEA sono stati utilizzati per studiare la funzione di TMEM200A. Infine, per valutare l'impatto della TMEM200A sul comportamento maligno e sulla funzione di sviluppo tumorale delle cellule GC, è stato condotto un esperimento di perdita di funzione in un test in vitro . Inoltre, è stato eseguito il western blotting per valutare in che modo TMEM200A knockdown ha influenzato la via di segnalazione PI3K/AKT e la transizione epiteliale-mesenchimale (EMT) nella GC.

Protocollo

1. Il database dell'Atlante del Genoma del Cancro (TCGA)

NOTA: Il database Cancer Genome Atlas (TCGA) contiene i dati di sequenziamento dei geni in diversi tessuti tumorali¹⁴. I dati RNA-seq in TCGA per lo studio dei formati di trascritti TMEM200A per parte per milione (TPM) sono stati estratti dal sito web UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) e log2 trasformato per confrontare le espressioni tra i campioni.

1. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
2. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
3. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
4. Dalle 129 coorti e 1.571 set di dati in questa pagina, fai clic sulla scheda per un totale di 33 tumori come la leucemia mieloide acuta GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Cancro corticosurrenalico (ACC), GDC TCGA Cancro del dotto biliare (CHOL) e altri.
5. Dal menu RNAseq di espressione genica , selezionare e fare clic sulla scheda HTSeq - FPKM GDC Hub .
   NOTA: HTSeq - FPKM GDC Hub rappresenta i dati che sono stati corretti con il consenso.
6. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
   NOTA: Con il metodo di cui sopra, sono stati scaricati i dati RNA-Seq per 33 diversi tipi di cancro.
7. Decomprimere l'archivio zip dei dati RNA-seq per 33 diversi tipi di cancro in un unico file nella cartella desktop del computer.
8. Unifica i file txt decompressi nella stessa cartella e posiziona gli script Perl in questa cartella.
9. Aprire il software Perl , copiare e incollare il percorso della cartella nel software Perl in cui si trova il cursore del mouse, premere il tasto Invio , inserire il nome del codice Perl e il nome del gene (TMEM200A), quindi premere il tasto Invio per ottenere un nuovo file txt (singleGeneExp.txt).
   NOTA: Questo nuovo file txt (singleGeneExp.txt) contiene l'espressione genica di TMEM200A in 33 tumori in diversi pazienti.
10. Aprire il codice R (diffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file singleGeneExp.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
11. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (diffR) e disegnare l'immagine tramite il pacchetto "ggpubr".

2. Il database TIMER2.0

1. Vai all'interfaccia del sito Web del database TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) ¹⁶.
2. Fare clic sulla scheda Esplorazione del cancro.
3. Immettere l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca e fare clic sulla scheda Invia per ottenere le immagini di espressione differenziale di TMEM200A in diversi tipi di tumori.

3. Atlante delle proteine umane (HPA)

1. Accedere all'interfaccia Web dell'Atlante delle proteine umane (HPA) (www.proteinatlas.org) ¹⁷.
2. Digita ID (TMEM200A) nella casella di ricerca e fai clic sul pulsante Cerca . Selezionare il sottoatlante TISSUE.
3. Passa il mouse sopra la pagina e scorri verso il basso per trovare la scheda Panoramica dell'espressione proteica .
   NOTA: La sezione Panoramica sull'espressione proteica mostra i livelli di espressione proteica di TMEM200A in 45 organi del corpo umano.

4. L'array della piattaforma di metilazione del DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium

NOTA: L'array della piattaforma di metilazione del DNA HumanMethylation450 Illumina Infinium è stato utilizzato per raccogliere dati sulla metilazione. Abbiamo potuto valutare i TMEM200A livelli di metilazione del DNA utilizzando il database SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)¹⁸.

1. Vai all'interfaccia del sito Web SMART .
2. Inserisci l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca per ottenere la distribuzione di TMEM200A nei cromosomi e il livello di metilazione di TMEM200A nei diversi tipi di neoplasie.
3. Scorrere la pagina verso il basso fino al menu Fare clic per controllare la metilazione aggregata CpG e fare clic sul pulsante Traccia . Nella parte inferiore della pagina, trova e fai clic sul pulsante Scarica figura . Scarica la figura.

5. La banca dati UALCAN

1. Vai all'interfaccia del sito web UALCAN .
   NOTA: I box plot dei livelli di metilazione del promotore TMEM200A in varie neoplasie sono stati generati attraverso il database UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)¹⁹
2. Nella parte superiore della pagina, fai clic sul pulsante TCGA .
3. Immettere TMEM200A nella casella di input ID gene sullo schermo. Nel menu del set di dati TCGA , scorri verso il basso e seleziona il tipo di cancro da interrogare.
4. Dopo aver fatto clic sul pulsante Esplora , fare clic sull'analisi del sottogruppo Metilazione nel menu Collegamenti per l'analisi per ottenere i risultati della metilazione di questo tumore.
   NOTA: Con questo metodo, abbiamo ottenuto risultati di metilazione per 22 tumori nel database UALCAN .

6. Il database del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC)

1. Vai all'interfaccia del sito web del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC).
   NOTA: I dati sulle mutazioni codificanti, sui riarrangiamenti genomici mutanti non codificanti e sui geni di fusione nel genoma umano sono disponibili nel database ²⁰ (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/) del Catalogo delle mutazioni somatiche nelle cellule tumorali (COSMIC), che viene utilizzato anche per determinare la frequenza di varie mutazioni TMEM200A in vari tumori.
2. Immettere l'ID del gene (TMEM200A) nella casella di ricerca e fare clic sul pulsante CERCA per passare a una nuova schermata.
3. Nel menu Geni, individuare e fare clic sul collegamento in cui viene visualizzato il nome dell'ID del gene del TMEM200A .
4. Trova la colonna Raggruppamento della distribuzione delle mutazioni nella nuova pagina per ottenere lo stato di mutazione di TMEM200A nel tumore.

7. CBioPortal

1. Vai all'interfaccia del sito web CBioPortal .
   NOTA: I dati genomici del cancro possono essere trovati, scaricati, analizzati e visualizzati utilizzando il database cBioPortal (www.cioportal.org). Le mutazioni somatiche, le variazioni del numero di copie del DNA (CNA), l'espressione di mRNA e microRNA (miRNA), la metilazione del DNA, l'abbondanza di proteine e l'abbondanza di fosfoproteine sono solo alcuni dei tipi di dati genomici integrati da cBioPortal²¹. Con cBioPortal è possibile effettuare un'ampia gamma di studi; Tuttavia, l'enfasi maggiore è posta su diverse analisi relative alle mutazioni e alla loro visualizzazione.
2. Selezionare il set di dati Pan-cancer analysis of whole genomes dalla sottosezione PanCancer Studies della sezione Select Studies for Visualization & Analysis . Quindi, fare clic sul pulsante Query By Gene .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia query .
4. Fare clic sul pulsante Dettagliato del tipo di cancro nella parte superiore della pagina per ottenere le mutazioni di TMEM200A in vari tipi di cancro.

8. Strumento Sangerbox 3.0

1. Vai all'interfaccia dello strumento Sangerbox 3.0 .
   NOTA: La correlazione dell'espressione di TMEM200A con le cellule infiltranti immunitarie, gli agenti immunosoppressori, i fattori immunostimolatori e le molecole MHC (complesso maggiore di istocompatibilità) in tutti i tumori è stata analizzata mediante l'infiltrazione immunitaria CIBERSORT utilizzando i dati di infiltrazione immunitaria pan-cancerogena nello strumento Sangerbox 3.0²² (http://vip.sangerbox.com/).
2. Dalla barra degli strumenti sul lato sinistro della pagina, selezionare e fare clic sulla scheda Analisi immunocellulare (CIBERSORT) dal menu Analisi pan-cancro .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .

9. Banca dati TISIDB

1. Vai all'interfaccia del sito web di TISIDB .
   NOTA: Il database TISIDB²³ (http://cis.hku.hk/TISIDB/) è stato utilizzato per esaminare la correlazione dell'espressione di TMEM200A con cellule infiltranti immunitarie, agenti immunosoppressori, fattori immunostimolatori e molecole MHC in vari tumori.
2. Immettere il simbolo del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .
3. Fare clic sulle sezioni Linfociti, Immunomodulatori, Chemochine e Sottotipo nella parte superiore della pagina. Scarica le relative immagini in fondo alla pagina.

10. La banca dati TIDE

1. Vai all'interfaccia del sito web di TIDE .
   NOTA: Il database TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) è stato utilizzato per valutare il potenziale di TMEM200A come biomarcatore per predire la risposta alla terapia di blocco del checkpoint immunitario tumorale.
2. Inserisci l'indirizzo e-mail nella schermata iniziale per registrare l'account e accedere.
3. Trova la sottosezione Valutazione dei biomarcatori nella parte superiore della pagina e fai clic su di essa.
4. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query per Immettere i geni nella parte inferiore della pagina. Quindi, fai clic sul pulsante Invia .
5. Nella pagina, trascinare il mouse per far scorrere la pagina verso il basso e trovare i risultati dell'analisi.

11. La banca dati CancerSEA

1. Vai all'interfaccia del sito web di CancerSEA .
   NOTA: Utilizzando i dati di sequenziamento di singole cellule, sono state studiate le relazioni tra l'espressione di TMEM200A e lo stato funzionale di diverse cellule tumorali. Ciò è stato fatto utilizzando il database CancerSEA²⁴ (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
2. Nella parte superiore della pagina, trova e fai clic sulla scheda Cerca .
3. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fare clic sul pulsante Invia .

12. Lo strumento di rete del centro a singola cellula immune al tumore (TISCH)

1. Vai all'interfaccia del sito Web dello strumento di rete TISCH (Tumor Immune Single-Cell Center).
   NOTA: La correlazione tra i livelli di espressione delle cellule TMEM200A e tumorali è stata dimostrata anche utilizzando lo strumento di rete TISCH (Tumor Immune Single-Cell Center)²⁵.
2. Immettere l'ID del gene di destinazione (TMEM200A) nella casella di query di Immettere i geni. Fai clic sul pulsante Esplora .
3. Nel menu Tipo di cancro in questa pagina, selezionare e fare clic sul set di dati Tutti i tumori . Quindi, scorri la pagina verso il basso e fai clic sul pulsante Cerca .

13. GeneMANIA

1. Vai all'interfaccia del sito web di GeneMANIA .
   NOTA: La correlazione tra TMEM200A e i suoi geni funzionalmente rilevanti è stata prevista utilizzando la strategia di integrazione per la rete multi-associazione genica Website GeneMANIA (www.genemania.org)²⁶ per la costruzione di reti di interazione gene-gene (GGI).
2. Nella casella di ricerca in alto a sinistra della pagina, inserisci l'ID del gene (TMEM200A) e fai clic su Strumenti di ricerca.
   NOTA: Lo strumento web GeneMANIA è stato utilizzato per trovare 20 geni associati a TMEM200A.

14. Analisi dell'arricchimento funzionale

1. Salvare gli ID dei simboli dei geni da analizzare per l'arricchimento in formato file txt.
2. Aprire il codice R (symbolidR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file txt precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
3. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (symbolidR). Converti gli ID simbolo di questi geni in entrezID tramite il comando "org. Hs.eg.db". Ottenere il file id.txt .
4. Apri il codice R (GOR e KEGGR) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file id.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (GOR e KEGGR). Per seguire questo protocollo, analizza questi geni per l'arricchimento GO e KEGG da parte dei pacchetti "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" e "enrichplot" e tracciare i risultati dell'arricchimento usando il pacchetto "gglot2".

15. Analisi delle differenze nell'attività genica

NOTA: TMEM200A punteggio in ciascun campione di cancro è stato calcolato utilizzando ssGSEA (analisi di arricchimento del set genico a campione singolo)²⁷ e l'analisi differenziale dell'attività genica di TMEM200A nei tessuti cancerosi e sani è stata eseguita per vari tumori.

1. Sulla base dei dati RNA-seq di 33 tipi di tumore scaricati nel passaggio 1.7, decomprimere tutti i file scaricati e inserirli in una cartella unificata.
2. Posiziona il file merge.txt nella cartella precedente.
   NOTA: I dati in merge.txt file di BioWolf (www.biowolf.cn) contengono l'espressione genica per tutti i pazienti in tutti i tumori nel database The Cancer Genome Atlas (TCGA).
3. Aprire il codice R (ssGSEAR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
4. Prendi la riga in cui geneName si trova nel codice R (ssGSEAR) e inserisci l'ID gene (TMEM200A).
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (ssGSEAR). Ottenere il file di punteggio per l'attività genica: scores.txt.
   NOTA: Con l'algoritmo ssGSEA, costruiamo prima un file di set di geni basato sui coefficienti di correlazione tra i geni in base ai dati forniti nel file merge.txt e identifichiamo i geni con una correlazione più alta con il gene bersaglio (TMEM200A) dal file. Quindi, i geni con una correlazione più alta vengono unificati come i geni attivi di TMEM200A e, infine, otteniamo il punteggio dei geni attivi in ciascun campione.
6. Aprire il codice R (scoreDiffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file scores.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
7. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (scoreDiffR) e disegnare l'immagine tramite i pacchetti "plyr", "reshape2" e "ggpubr".

16. Correlazione clinicopatologica e analisi della prognosi di sopravvivenza

1. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
2. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
3. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
4. Passa il mouse sopra la pagina e scorri verso il basso per trovare la scheda TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
5. Dalle 129 coorti e dai 1.571 set di dati in questa pagina, fare clic sulla scheda TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
6. Dal menu fenotipo , selezionare e fare clic sulla scheda Dati clinici curati.
7. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
   NOTA: Scarica i dati clinici per 33 tumori dal database TCGA al link sopra.
8. Decomprimere il file di dati clinici scaricato e aprire il file decompresso in formato file xls.
9. Organizzare e conservare i dati clinici necessari (stadio, età, stadio patologico e stato del paziente) nel file, eliminare i dati clinici rimanenti non necessari e salvare l'intero file come file in formato txt dopo averlo rinominato clinico.
10. In base alle singleGeneExp.txt ottenute nel passaggio 1.9, inserire questo file nella stessa cartella del file clinical.txt organizzato.
11. Decomprimere i dati clinici scaricati e posizionare i file singleGeneExp.txt e clinical.txt nella stessa cartella dei file clinici decompressi.
12. Aprire il codice R (clinicalDiffR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
13. Aprire il software R, eseguire il codice R modificato (clinicalDiffR) e disegnare l'immagine usando il pacchetto "ggpubr".
14. Vai all'interfaccia del sito Web UCSC Xena .
15. Fare clic sulla scheda Avvia Xena .
16. Fare clic sulla scheda SET DI DATI nella parte superiore dello schermo.
17. Dalle 129 coorti e 1.571 set di dati in questa pagina, fai clic sulla scheda per un totale di 33 tumori come la leucemia mieloide acuta GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Cancro corticosurrenalico (ACC), GDC TCGA Cancro del dotto biliare (CHOL) e altri.
18. Dal menu fenotipo , selezionare e fare clic sulla scheda dei dati di sopravvivenza.
19. Dal menu di download , fare clic sul collegamento corrispondente.
20. Decomprimere l'archivio zip dei dati di sopravvivenza per 33 diversi tipi di cancro in un unico file nella cartella desktop del computer.
21. Inserire i dati di sopravvivenza decompressi nella stessa cartella del file singleGeneExp.txt ottenuto nel passaggio 1.9.
22. Apri il codice R (preOSR) e copia e incolla il percorso in cui si trova la cartella precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
23. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (preOSR). Calcola attraverso il pacchetto "limma" per ottenere un file di dati sulla sopravvivenza del TMEM200A nel pan-cancro: expTime.txt.
24. Aprire il codice R (OSR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file expTime.txt nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
25. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (OSR). Eseguire un'analisi KM utilizzando i pacchetti "survival" e "survminer" in base ai dati nel file expTime.txt e tracciare le curve di sopravvivenza per TMEM200A nel pan-cancro.

17. Analisi di regressione di Cox univariata e multivariata con costruzione di parcelle forestali

1. Aprire il codice R (COXR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova il file expTime.txt dalla versione 16.23 alla riga in cui si trova setwd nel codice R.
2. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (COXR). Sulla base dei dati nel file expTime.txt , eseguire analisi di regressione COX univariate utilizzando i pacchetti "survival", "survminer" e "forestplot" per tracciare un grafico univariato -forest di TMEM200A in diversi tumori.
3. Inserire il file expTime.txt del passaggio 16.23 e clinical.txt del passaggio 16.10 nella stessa cartella.
4. Aprire il codice R (multicoxR) e copiare e incollare il percorso in cui si trova la cartella contenente il file expTime.txt del passaggio 16.23 e clinical.txt file del passaggio 16.10 nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
5. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (multicoxR). Eseguire un'analisi di regressione COX multivariata utilizzando i pacchetti "survival" e "survminer" per tracciare un grafico multivariato della foresta di TMEM200A in diversi tumori in base ai dati nei file expTime.txt e clinical.txt .

18. Modello prognostico del carcinoma gastrico basato sull'espressione TMEM200A e sulle caratteristiche cliniche

1. Inserire il file clinical.txt del passaggio 16.10 e il file expTime.txt del passaggio 16.23 nella stessa cartella.
2. Apri il codice R (NomoR) e copia e incolla il percorso in cui si trova il file txt precedente nella riga in cui si trova setwd nel codice R.
3. Aprire il software R ed eseguire il codice R modificato (NomoR). Utilizzare i pacchetti software "survival", "regplot" e "rms" per i dati di espressione TMEM200A nei GC e nei dati clinici per costruire un modello prognostico per prevedere la sopravvivenza del paziente.

19. Coltura cellulare e trasfezione di siRNA di TMEM200A

NOTA: Le cellule umane STAD HGC-27, le cellule SGC-7901 e le cellule GES-1 epiteliali della mucosa gastrica umana sono state ottenute commercialmente (vedere la tabella dei materiali), rianimate, inoculate nel terreno completo 1640 del Roswell Park Memorial Institute (RPMI) (contenente il 10% di siero fetale neonatale bovino e l'1% di miscela di penicillina) e coltivate a 37 °C in un 5% di CO₂ incubatore per colture cellulari. Il terreno di coltura è stato cambiato ogni 2-3 giorni. Le cellule in buone condizioni di crescita sono state inoculate in piastre da sei pozzetti secondo (2-3) × 10^{5 cellule} per pozzetto.

1. Innanzitutto, prelevare tre provette per microcentrifuga e aggiungere 8 μL di reagente di trasfezione (vedere la Table dei materiali) e 200 μL di terreno basale a ciascuna provetta. Quindi, aggiungere 4 μg di SiRNA1, SiRNA2 e SiRNA3 rispettivamente a ciascuna provetta.
   NOTA: Per TMEM200A knockdown, il siRNA è stato progettato e acquistato (vedere la tabella dei materiali).
2. Mescolare accuratamente la miscela nelle tre provette per microcentrifuga e aggiungerla a ciascuno dei tre pozzetti della piastra a 6 pozzetti. Agitare delicatamente la piastra a 6 pozzetti per distribuire uniformemente la miscela. Etichettare i tre pozzetti in cui è stata aggiunta la miscela come SiRNA-1, SiRNA-2 e SiRNA-3.
3. Quando le cellule sono state incubate per 4-6 ore, sostituire metà del terreno nei tre sottopozzetti nella piastra a 6 pozzetti.
   NOTA: Quando si sostituisce metà del terreno completo, aspirare metà del terreno completo originale e rabboccare con metà del terreno completo fresco.
4. Da 24 a 48 ore dopo, utilizzare TMEM200A cellule trasfettate con siRNA come gruppo sperimentale e cellule non trasfettate come gruppo di controllo negativo. Eseguire la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (qRT-PCR, vedere paragrafo 20) per valutare l'effetto della trasfezione sulle cellule.

20. Reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale

1. Scartare il terreno di coltura cellulare in ciascun sottogruppo e lavare delicatamente le cellule due volte con 1 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Isolare l'RNA totale utilizzando un kit di isolamento dell'RNA (vedere la tabella dei materiali).
3. Stimare la concentrazione di RNA e sintetizzare il cDNA con 1 μg di RNA utilizzando un kit di sintesi del cDNA, seguendo le istruzioni del produttore.
4. Eseguire la PCR quantitativa in tempo reale (qRT-PCR) su diluizioni di 10 volte di cDNA in 10 μL di miscela di reazione, inclusi primer diretti e inversi specifici per l'uomo per GAPDH (per la standardizzazione), TMEM200A (vedere la tabella dei materiali) e qPCR Master Mix, utilizzando il sistema di analisi PCR in tempo reale.
   NOTA: Eseguire ogni esperimento in triplice copia.
5. Utilizzare le seguenti condizioni di reazione qPCR: inizializzazione, 95 °C per 3 min; denaturazione, 95 °C per 10 s; ricottura, 60 °C per 30 s; ed estensione, 80 °C per 10 s; Ripetere la denaturazione, la ricottura e l'estensione 40 volte. Determinare l'espressione relativa di ciascun gene utilizzando la tecnica ^{2-ΔΔCt 28}.
6. Ripetere gli esperimenti almeno tre volte per ottenere triplicati biologici.

21. Rilevamento Western blot dell'espressione proteica rilevante

1. Scartare il terreno di coltura cellulare in ciascun sottogruppo e lavare delicatamente le cellule con 2 x 1 mL di PBS.
2. Raffreddare le piastre a 6 pozzetti contenenti le cellule sul ghiaccio e aggiungere 150 μL di tampone di lisi RIPA (test di precipitazione radioimmunitaria) preraffreddato (150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% desossicolato di sodio, 0,1% SDS, 50 mM Tris-HCl pH 8,0 e cocktail di inibitori della proteasi appena aggiunti). Lasciare che la lisi proceda sul ghiaccio per 10 minuti.
3. Utilizzando un raschietto per cellule di plastica, rimuovere le cellule aderenti dal piatto e trasferire delicatamente la soluzione cellulare in una provetta per microcentrifuga preraffreddata.
4. Centrifugare il lisato cellulare per 10 minuti a 1,5 × 10⁴ g a 4 °C. Trasferire il surnatante in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 mL.
5. Utilizzare un kit di analisi delle proteine BCA per determinare il contenuto proteico secondo le istruzioni del produttore.
6. Caricare 30 g di proteine da ciascun campione su un gel di elettroforesi su gel di poliacrilammide di sodio dodecilsolfato al 10% (SDS-PAGE) e far funzionare a 80 V per 0,5 ore, seguite da 1,5 ore a 120 V.
7. Trasferire le proteine dal gel a una membrana di difluoruro di polivinilidene (PVDF) da 45 μm a una tensione di 300 mA per 1-1,5 ore.
8. Dopo aver posizionato la membrana in PVDF su uno shaker e averla agitata per 3 x 5 minuti, aggiungere soluzione salina tamponata con Tris con Tween 20 (TBST, 20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl e 0,1% Tween 20) nel contenitore appropriato con il lato proteico (lato gel) rivolto verso l'alto.
9. Posizionare la membrana nel tampone bloccante (vedere la tabella dei materiali) e incubarla per 0,5 ore a temperatura ambiente.
10. Lavare la membrana con TBST per 3 x 10 min.
11. Incubare la membrana con anticorpi primari contro fosfo-AKT (p-AKT; 1:1.000), AKT totale 1:1.000, E-caderina (E-ca; 1:1.000), N-caderina (N-ca; 1:1.000), Vimentina 1:1.000, lumaca 1:1.000, TMEM200A 1:1.000, gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH; 1:1.000), per una notte a 4 °C.
12. Lavare la membrana per 3 x 10 minuti e incubarla con un anticorpo secondario di coniglio o topo (1:5.000) per 1 ora a temperatura ambiente.
13. Incubare la membrana in PVDF con substrato ECL per 30 secondi e rilevare il segnale utilizzando un sistema di imaging.

22. Saggio CCK-8

1. Seminare cellule umane STAD HGC-27 in buone condizioni di crescita in piastre a 96 pozzetti.
2. Quando la densità cellulare raggiunge il 60-70%, trasfettare le cellule con TMEM200A siRNA (come nel passaggio 19.3).
3. Seminare le cellule trasfettate in piastre da 96 pozzetti con una densità cellulare di 5 × 10 ³/pozzetto (contare le cellule vitali utilizzando un contatore di cellule), divise in gruppi NC e TMEM200A siRNA (con tre pozzetti replicati in ciascun gruppo) e incubate a 37 °C.
4. Aggiungere il reagente CCK-8 dopo 0, 24, 48, 72 e 96 ore e incubare a 37 °C per 2 ore. Misurare l'assorbanza (450 nm) utilizzando un etichettatore enzimatico multifunzionale.

Risultati

Espressione di TMEM200A in vari tumori
Come illustrato nella Figura 1, abbiamo prima analizzato i livelli di espressione differenziale di TMEM200A in vari tumori attraverso diversi database. TMEM200A'espressione è risultata elevata nel colangiocarcinoma (CHOL), nel carcinoma a cellule squamose della testa e del collo (HNSC), nel carcinoma renale a cellule chiare (KIRC), nel carcinoma a cellule papillari renali (KIRP), nel carci...

Discussione

TMEM200A appartiene a una famiglia di TMEM che è essenziale per la proliferazione delle cellule tumorali³⁸. L'espressione variabile di TMEM200A in diverse neoplasie maligne ha ricevuto meno attenzione e manca un'indagine approfondita sul pan-cancro. Tuttavia, le prove continuano ad accumularsi, dimostrando che la famiglia di proteine transmembrana TMEM può essere importante nel mantenere le cellule tumorali maligne attraverso interazioni con diverse proteine, ad esempio, l'atti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold