Мультиомный анализ TMEM200A как панракового биомаркера

Резюме

Здесь представлен протокол, в котором объединены несколько биоинформатических инструментов для изучения биологических функций TMEM200A при раке. Кроме того, мы также экспериментально проверяем предсказания биоинформатики.

Аннотация

Известно, что трансмембранный белок, TMEM200A, связан с раком человека и иммунной инфильтрацией. Здесь мы оценили функцию TMEM200A при распространенных раковых опухолях с помощью мультиомного анализа и использовали клеточные культуры клеток желудка in vitro для проверки результатов. Экспрессию TMEM200A при нескольких типах рака человека оценивали с использованием данных РНК-секвенирования из базы данных UCSC Xena. Биоинформатический анализ выявил потенциальную роль TMEM200A как диагностического и прогностического биомаркера.

Культивировались культуры нормальных желудочных и раковых клеточных линий , и TMEM200A сбивали. Уровни экспрессии TMEM200A измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и вестерн-блоттинга. Затем исследования потери функции in vitro были использованы для определения роли TMEM200A в злокачественном поведении и опухолевом образовании клеток рака желудка (ГК). Вестерн-блоттинг использовали для оценки влияния нокдауна на эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и сигнальный путь PI3K/AKT при ГК. Биоинформатический анализ показал, что TMEM200A экспрессируется на высоких уровнях в ГХ.

Пролиферация GC-клеток ингибировалась нокдауном TMEM200A, который также снижал количество белков виментина, N-кадгерина и Snai и ингибировал фосфорилирование AKT. Сигнальный путь PI3K/AKT также, по-видимому, участвует в TMEM200A-опосредованной регуляции развития ГК. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что TMEM200A регулирует микроокружение опухоли, воздействуя на ЭМП. TMEM200A также может влиять на ЭМП через передачу сигналов PI3K/AKT, тем самым влияя на микроокружение опухоли. Таким образом, при панраковых опухолях, особенно при ГК, TMEM200A может быть потенциальным биомаркером и онкогеном.

Введение

Рак превратился в постоянную проблему общественного здравоохранения, угрожающую здоровью человека во всем^мире1из-за высокого уровня заболеваемости и смертности во всем мире, что создает тяжелое финансовое и медицинское бремя^{для общества2}. Значительные успехи в терапии рака были достигнуты в последние годы благодаря открытию раковых^{маркеров,} и исследователи разработали новые методы диагностики и новые лекарства для лечения рака. Тем не менее, некоторые пациенты с раком по-прежнему имеют плохие прогнозы из-за таких факторов, как лекарственная устойчивость, побочные эффекты лекарств и чувствительност....

протокол

1. База данных «Атлас генома рака» (TCGA)

ПРИМЕЧАНИЕ: База данных Атласа генома рака (TCGA) содержит данные секвенирования генов в различных опухолевых тканях¹⁴. Данные РНК-секвенирования в TCGA для изучения форматов TMEM200A transcripts per part per million (TPM) были извлечены с веб-сайта UCSC Xena ¹⁵ (https://xenabrowser. net/datapages/) и преобразованы log2 для сравнения экспрессий между образцами.

1. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
2. Перейдите на вкладку «Запустить Xena

Результаты

Экспрессия TMEM200A при различных видах рака
Как показано на рисунке 1, сначала мы проанализировали дифференциальные уровни экспрессии TMEM200A при различных видах рака с помощью различных баз данных. TMEM200A экспрессия была повышена при холанг?.......

Обсуждение

TMEM200A принадлежит к семейству ТМЭМ, которые необходимы для пролиферации раковых клеток³⁸. Вариабельная экспрессия TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях привлекла меньше внимания, и отсутствует тщательное панраковое исследование. Тем не менее, прод.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody	Proteintech Group, Inc	10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibody	Proteintech Group, Inc	22018-1-AP
Anti-P-AKT antibody	Proteintech Group, Inc	66444-1-Ig
Anti-snail antibody	Proteintech Group, Inc	13099-1-AP
Anti-Vimentin antibody	Proteintech Group, Inc	10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit	Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd	UEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay Kit	Epizyme Biotech	ZJ101L
CCK-8 reagent	MedChemExpress	HY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)	CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC	FBSSR-01021
GAPDH primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagent	ABclonal	RM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)	Proteintech Group, Inc	SA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells	Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cells	Procell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase	Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd	MR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit	Epizyme Biotech	SQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit	Epizyme Biotech	PG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)	Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd	P1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane	Merck KGaA	IPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking Buffer	Epizyme Biotech	PS108P
RIPA lysis solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	R0010
RPMI 1640 complete medium	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Skimmed milk	Campina: Elk
TBST buffer solution	Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd	T1082
The protein loading buffer	Epizyme Biotech	LT101S
TMEM200A knockdown plasmid	MiaoLing Plasmid
TMEM200A primer	Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.		Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3	MiaoLing Plasmid		Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A Antibody	Proteintech Group, Inc	48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubator	Haier Group	PYXE-80IR
Electrophoresis instrument	Bio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrument	Bio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)	Tanon Science & Technology Co., Ltd	LAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme Labeler	Berthold