АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлен протокол, в котором объединены несколько биоинформатических инструментов для изучения биологических функций TMEM200A при раке. Кроме того, мы также экспериментально проверяем предсказания биоинформатики.

Аннотация

Известно, что трансмембранный белок, TMEM200A, связан с раком человека и иммунной инфильтрацией. Здесь мы оценили функцию TMEM200A при распространенных раковых опухолях с помощью мультиомного анализа и использовали клеточные культуры клеток желудка in vitro для проверки результатов. Экспрессию TMEM200A при нескольких типах рака человека оценивали с использованием данных РНК-секвенирования из базы данных UCSC Xena. Биоинформатический анализ выявил потенциальную роль TMEM200A как диагностического и прогностического биомаркера.

Культивировались культуры нормальных желудочных и раковых клеточных линий , и TMEM200A сбивали. Уровни экспрессии TMEM200A измеряли с помощью количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени и вестерн-блоттинга. Затем исследования потери функции in vitro были использованы для определения роли TMEM200A в злокачественном поведении и опухолевом образовании клеток рака желудка (ГК). Вестерн-блоттинг использовали для оценки влияния нокдауна на эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) и сигнальный путь PI3K/AKT при ГК. Биоинформатический анализ показал, что TMEM200A экспрессируется на высоких уровнях в ГХ.

Пролиферация GC-клеток ингибировалась нокдауном TMEM200A, который также снижал количество белков виментина, N-кадгерина и Snai и ингибировал фосфорилирование AKT. Сигнальный путь PI3K/AKT также, по-видимому, участвует в TMEM200A-опосредованной регуляции развития ГК. Представленные здесь результаты свидетельствуют о том, что TMEM200A регулирует микроокружение опухоли, воздействуя на ЭМП. TMEM200A также может влиять на ЭМП через передачу сигналов PI3K/AKT, тем самым влияя на микроокружение опухоли. Таким образом, при панраковых опухолях, особенно при ГК, TMEM200A может быть потенциальным биомаркером и онкогеном.

Введение

Рак превратился в постоянную проблему общественного здравоохранения, угрожающую здоровью человека во всеммире1из-за высокого уровня заболеваемости и смертности во всем мире, что создает тяжелое финансовое и медицинское бремядля общества2. Значительные успехи в терапии рака были достигнуты в последние годы благодаря открытию раковыхмаркеров, и исследователи разработали новые методы диагностики и новые лекарства для лечения рака. Тем не менее, некоторые пациенты с раком по-прежнему имеют плохие прогнозы из-за таких факторов, как лекарственная устойчивость, побочные эффекты лекарств и чувствительность к химическимвеществам. В связи с этим существует острая необходимость в выявлении новых биомаркеров для скрининга и лечения рака на ранних стадиях5.

Мембранные белки - это белки, которые могут связываться и интегрироваться в клетки и мембраны органелл6. Они могут быть сгруппированы в три категории в зависимости от силы связывания с мембраной и их расположения: липидно-якорные белки, интегральные белки и периферические мембранные белки 7,8. Трансмембранный белок (ТМЕМ) представляет собой интегральный мембранный белок, состоящий по меньшей мере из одного трансмембранного сегмента9, который полностью или частично проходит через биологическую мембрану.

Хотя механизмы действия белков, принадлежащих к семейству TMEM, недостаточно изучены, известно, что эти белки участвуют в развитии нескольких типоврака. Некоторые белки ТМЕМ ассоциированы с мигрирующими, пролиферативными и инвазивными фенотипами, и их экспрессия часто связана с прогнозом пациента11. Таким образом, члены семейства ТМЕМ стали объектом исследования. Всесторонний обзор существующих сообщений о ТМЕМ показал, что они в основном связаны с меж- и внутриклеточной сигнализацией12, иммунозависимыми заболеваниями и опухолегенезом10. Многие ТЭМ также обладают важными физиологическими функциями, например, ионными каналами в плазматической мембране, активацией путей передачи сигнала, а также посредничеством клеточного хемотаксиса, адгезии, апоптоза и аутофагии10. Таким образом, мы предположили, что белки ТМЕМ могут быть важными прогностическими маркерами в выявлении и лечении опухолей.

TMEM200A экспрессия значительно повышена при раке желудка (ГК). Более высокая экспрессия TMEM200A13, которая имеет восемь экзонов и полную длину 77,536 kb на хромосоме 6q23.1, была связана с плохим прогнозом общей выживаемости (ОВ) в случаях ГК. Тем не менее, об изменениях в его экспрессии редко сообщалось в онкологических исследованиях. В данной статье сравнивается и анализируется полезность TMEM200A в качестве терапевтической мишени и опухолевого диагностического маркера в различных онкологических исследованиях с использованием различных общедоступных наборов данных. Мы оценивали эффективность TMEM200A как панракового диагностического и прогностического биомаркера, а также уровни его экспрессии при различных типах рака человека с использованием данных РНК-секвенирования из баз данных UCSC Xena и TCGA, а также количественной полимеразной цепной реакции в реальном времени (qRT-PCR) и вестерн-блоттинга.

Влияние уровней экспрессии TMEM200A на частоту мутаций, регуляторные процессы, диагностику и прогноз опухолей, иммунную инфильтрацию и иммунотерапию было дополнительно изучено с использованием комбинации вычислительных инструментов и веб-сайтов наборов данных. Для изучения мутаций в TMEM200A использовались базы данных CBioPortal и Каталог соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC). Для понимания того , как TMEM200A влияет на иммунную инфильтрацию, были использованы веб-сайты Sangerbox и TISIDB. Для исследования функции TMEM200A был использован онлайн-инструмент Центра опухолевого иммунитета (TISCH) и база данных CancerSEA. Наконец, для оценки влияния TMEM200A на злокачественное поведение и функцию развития опухоли ГК-клеток был проведен эксперимент по потере функции в анализе in vitro . Кроме того, был проведен вестерн-блоттинг для оценки влияния нокдауна TMEM200A сигнальный путь PI3K/AKT и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT) при ГК.

протокол

1. База данных «Атлас генома рака» (TCGA)

ПРИМЕЧАНИЕ: База данных Атласа генома рака (TCGA) содержит данные секвенирования генов в различных опухолевых тканях14. Данные РНК-секвенирования в TCGA для изучения форматов TMEM200A transcripts per part per million (TPM) были извлечены с веб-сайта UCSC Xena 15 (https://xenabrowser. net/datapages/) и преобразованы log2 для сравнения экспрессий между образцами.

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  2. Перейдите на вкладку «Запустить Xena ».
  3. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  4. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице нажмите на вкладку, чтобы увидеть в общей сложности 33 вида рака, таких как острый миелоидный лейкоз GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Рак коры надпочечников (ACC), GDC TCGA Рак желчных протоков (CHOL) и другие.
  5. В меню RNAseq экспрессии генов выберите и щелкните вкладку HTSeq - FPKM GDC Hub .
    ПРИМЕЧАНИЕ: HTSeq - FPKM GDC Hub представляет данные, которые были исправлены по согласию.
  6. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью вышеуказанного метода были загружены данные RNA-Seq для 33 различных типов рака.
  7. Распакуйте zip-архив данных РНК-секвенирования для 33 различных типов рака в один файл в папке рабочего стола компьютера.
  8. Объедините распакованные txt-файлы в одну папку и поместите в нее Perl-скрипты.
  9. Откройте программу Perl, скопируйте и вставьте путь к папке в программу Perl, в которой находится курсор мыши, нажмите клавишу Enter, введите имя кода Perl и имя гена (TMEM200A), а затем нажмите клавишу Enter, чтобы получить новый файл (singleGeneExp.txt).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот новый txt-файл (singleGeneExp.txt) содержит экспрессию генов TMEM200A в 33 видах рака у разных пациентов.
  10. Откройте код R (diffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл singleGeneExp.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  11. Откройте программу R, запустите модифицированный код R (diffR) и нарисуйте картинку с помощью пакета ggpubr.

2. База данных TIMER2.0

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта TIMER2.0 (http://timer.cistrome.org) database 16 .
  2. Перейдите на вкладку Исследование рака.
  3. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска и перейдите на вкладку Отправить , чтобы получить изображения дифференциальной экспрессии TMEM200A в различных типах опухолей.

3. Атлас белков человека (HPA)

  1. Перейдите в веб-интерфейс Human Protein Atlas (HPA) (www.proteinatlas.org) 17.
  2. Введите ID (TMEM200A) в поле поиска и нажмите кнопку Поиск . Выберите вложенный атлас TISSUE.
  3. Наведите курсор на страницу и прокрутите вниз, чтобы найти вкладку «Обзор экспрессии белка ».
    ПРИМЕЧАНИЕ: В разделе «Обзор экспрессии белка » показаны уровни экспрессии белка TMEM200A в 45 органах человеческого тела.

4. Массив платформ метилирования ДНК HumanMethylation450 Illumina Infinium

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора данных о метилировании ДНК использовалась матрица платформы метилирования ДНК HumanMethylation450 Illumina Infinium . Мы могли бы оценить TMEM200A уровни метилирования ДНК с помощью базы данных SMART (http://www.bioinfo-zs.com/smartapp/)18.

  1. Перейдите в интерфейс сайта SMART .
  2. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска , чтобы получить распределение TMEM200A в хромосомах и уровень метилирования TMEM200A при различных типах злокачественных новообразований.
  3. Прокрутите страницу вниз до меню Нажмите, чтобы проверить метилирование, агрегированное CpG, и нажмите кнопку График . В нижней части страницы найдите и нажмите кнопку «Загрузить рисунок ». Скачать рисунок.

5. База данных УАЛКАН

  1. Перейдите в интерфейс сайта UALCAN .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ящичковые диаграммы уровней метилирования промоторов TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях были построены с помощью базы данных UALCAN (http://ualcan.path.uab.edu/analysisprot.html)19
  2. В верхней части страницы нажмите на кнопку TCGA .
  3. Введите TMEM200A в поле ввода Gene ID на экране. В меню набора данных TCGA прокрутите вниз и выберите тип рака, который нужно запросить.
  4. После нажатия кнопки «Исследовать » нажмите на ее подгруппу анализа «Метилирование» в меню «Ссылки для анализа », чтобы получить результаты метилирования этой опухоли.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью этого метода мы получили результаты метилирования для 22 опухолей в базе данных UALCAN .

6. База данных «Каталог соматических мутаций в раковых клетках» (COSMIC)

  1. Перейти на сайт Каталога соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные о кодирующих мутациях, некодирующих мутантных геномных перестройках и слияниях генов в геноме человека доступны из базы данных Каталога соматических мутаций в раковых клетках (COSMIC)20 (https://cancer.sanger.ac.uk/cosmic/), которая также используется для определения частоты различных мутаций TMEM200A при различных видах рака.
  2. Введите идентификатор гена (TMEM200A) в поле поиска и нажмите кнопку ПОИСК, чтобы перейти на новый экран.
  3. В меню «Гены » найдите и щелкните ссылку, по которой отображается имя идентификатора гена TMEM200A .
  4. Найдите столбец Группировка распределения мутаций на новой странице, чтобы получить статус мутации TMEM200A в опухоли.

7. CBioPortal

  1. Перейдите в интерфейс сайта CBioPortal .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные геномики рака могут быть найдены, загружены, проанализированы и визуализированы с помощью базы данных cBioPortal (www.cioportal.org). Соматические мутации, изменения числа копий ДНК (CNA), экспрессия мРНК и микроРНК (miRNA), метилирование ДНК, обилие белка и содержание фосфопротеинов — это лишь некоторые из типов геномных данных, которые интегрированы в cBioPortal21. С помощью cBioPortal можно проводить широкий спектр исследований; Тем не менее, основной акцент делается на различных анализах, связанных с мутациями и их визуализацией.
  2. Выберите набор данных « Панраковый анализ целых геномов » в подразделе « Исследования панрака » раздела «Выбор исследований для визуализации и анализа ». Затем нажмите кнопку Query By Gene .
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить запрос .
  4. Нажмите на кнопку «Сведения о типе рака » в верхней части страницы, чтобы получить мутации TMEM200A при различных типах рака.

8. Инструмент Sangerbox 3.0

  1. Перейдите в интерфейс инструмента Sangerbox 3.0 .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция экспрессии TMEM200A с иммунными инфильтрирующими клетками, иммунодепрессантами, иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC (главный комплекс гистосовместимости) при всех видах рака была проанализирована методом иммунной инфильтрации CIBERSORT с использованием данных панраковой иммунной инфильтрации в Sangerbox 3.0 инструмент22 (http://vip.sangerbox.com/).
  2. На панели инструментов в левой части страницы выберите и щелкните вкладку «Иммуноклеточный анализ (CIBERSORT)» в меню «Панраковый анализ ».
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .

9. База данных TISIDB

  1. Перейдите в интерфейс сайта TISIDB .
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных TISIDB23 (http://cis.hku.hk/TISIDB/) была использована для изучения корреляции экспрессии TMEM200A с иммунными инфильтрирующими клетками, иммунодепрессантами, иммуностимулирующими факторами и молекулами MHC при различных видах рака.
  2. Введите целевой символ гена (TMEM200A) в поле запроса команды Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .
  3. Нажмите на разделы «Лимфоциты», «Иммуномодуляторы», «Химиконы» и « Подтипы » в верхней части страницы. Загрузите соответствующие изображения внизу страницы.

10. База данных TIDE

  1. Перейдите в интерфейс сайта TIDE .
    ПРИМЕЧАНИЕ: База данных TIDE (http://tide.dfci.harvard.edu/) была использована для оценки потенциала TMEM200A в качестве биомаркера для прогнозирования ответа на терапию блокадой иммунных контрольных точек опухолевого иммунитета.
  2. Введите адрес электронной почты на первом экране, чтобы зарегистрировать учетную запись и войти в систему.
  3. Найдите подраздел «Оценка биомаркеров » в верхней части страницы и нажмите на него.
  4. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены в нижней части страницы. Затем нажмите кнопку «Отправить ».
  5. На странице перетащите мышь, чтобы сдвинуть страницу вниз, чтобы найти результаты анализа.

11. База данных CancerSEA

  1. Перейдите в интерфейс сайта CancerSEA .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используя данные секвенирования отдельных клеток, были исследованы взаимосвязи между экспрессией TMEM200A и функциональным состоянием различных опухолевых клеток. Это было сделано с помощью базы данных CancerSEA24 (http://biocc.hrbmu.edu.cn/CancerSEA/).
  2. В верхней части страницы найдите и нажмите на вкладку «Поиск ».
  3. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Отправить .

12. Сетевой инструмент «Одноклеточный центр опухолевого иммунитета» (TISCH)

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта сетевого инструмента Центра иммунного иммунитета опухолей (TISCH).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между уровнями экспрессии TMEM200A и раковых клеток также была показана с помощью сетевого инструмента сети опухолевого иммунного одноклеточного центра (TISCH)25.
  2. Введите идентификатор целевого гена (TMEM200A) в поле запроса Введите гены. Нажмите кнопку Исследовать .
  3. В меню Тип рака на этой странице выберите и щелкните набор данных All Cancers. Затем прокрутите страницу вниз и нажмите кнопку «Поиск».

13. Геномания

  1. Перейдите в интерфейс сайта GeneMANIA .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Корреляция между TMEM200A и его функционально значимыми генами была предсказана с использованием стратегии интеграции генной мультиассоциативной сети Website GeneMANIA (www.genemania.org)26 для построения сетей ген-ген-генного взаимодействия (GGI).
  2. В поле поиска в левом верхнем углу страницы введите идентификатор гена (TMEM200A) и нажмите Инструменты поиска.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Веб-инструмент GeneMANIA был использован для поиска 20 генов, связанных с TMEM200A.

14. Анализ функционального обогащения

  1. Сохраните идентификаторы символов анализируемых генов для обогащения в формате txt.
  2. Откройте код R (symbolidR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится приведенный выше txt-файл, в строку, где находится setwd в коде R.
  3. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (symbolidR). Преобразуйте идентификаторы символов этих генов в entrezID с помощью команды "org. Hs.eg.db». Получите файл id.txt .
  4. Откройте код R (GOR и KEGGR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл id.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (GOR и KEGGR). Чтобы следовать этому протоколу, проанализируйте эти гены на предмет обогащения GO и KEGG пакетами "clusterProfiler", "org. Hs.eg.db" и "enrichplot" и построить график результатов обогащения с помощью пакета "gglot2".

15. Анализ различий в активности генов

ПРИМЕЧАНИЕ: TMEM200A баллов в каждом образце рака рассчитывали с помощью ssGSEA (анализ обогащения набора генов с одним выборкой)27, а для различных видов рака был проведен дифференциальный анализ активности TMEM200A генов в раковых и здоровых тканях.

  1. На основе данных РНК-секвенирования 33 типов опухолей, загруженных на шаге 1.7, распакуйте все загруженные файлы и поместите их в единую папку.
  2. Поместите merge.txt файл в указанную выше папку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Данные merge.txt файле BioWolf (www.biowolf.cn) содержат экспрессию генов для всех пациентов во всех опухолях в базе данных The Cancer Genome Atlas (TCGA).
  3. Откройте код R (ssGSEAR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  4. Возьмите строку, где geneName находится в коде R (ssGSEAR) и введите идентификатор гена (TMEM200A).
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (ssGSEAR). Получите файл оценки активности генов: scores.txt.
    ПРИМЕЧАНИЕ: С помощью алгоритма ssGSEA мы сначала создаем файл набора генов на основе коэффициентов корреляции между генами в соответствии с данными, представленными в файле merge.txt , и идентифицируем гены с более высокой корреляцией с целевым геном (TMEM200A) из файла. Затем гены с более высокой корреляцией объединяются как активные гены TMEM200A, и, наконец, мы получаем оценку активных генов в каждой выборке.
  6. Откройте код R (scoreDiffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл scores.txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  7. Откройте программное обеспечение R, запустите модифицированный код R (scoreDiffR) и нарисуйте изображение с помощью пакетов "plyr", "reshape2" и "ggpubr".

16. Клинико-патологическая корреляция и анализ прогноза выживаемости

  1. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  2. Перейдите на вкладку Запустить Xena .
  3. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  4. Наведите курсор на страницу и прокрутите вниз, чтобы найти вкладку TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  5. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице перейдите на вкладку TCGA Pan-Cancer (PANCAN).
  6. В меню фенотипа выберите и щелкните вкладку Курируемые клинические данные.
  7. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Загрузите клинические данные по 33 видам рака из базы данных TCGA по ссылке выше.
  8. Распакуйте загруженный файл клинических данных и откройте его в формате xls.
  9. Систематизируйте и сохраняйте необходимые клинические данные (стадия, возраст, патологическая стадия и состояние пациента) в файле, удаляйте оставшиеся ненужные клинические данные и сохраняйте весь файл в формате txt после переименования его в клинический.
  10. Основываясь на singleGeneExp.txt , полученных на шаге 1.9, поместите этот файл в ту же папку, что и организованный файл clinical.txt .
  11. Распакуйте загруженные клинические данные и поместите файлы singleGeneExp.txt и clinical.txt в ту же папку, что и разархивированные клинические файлы.
  12. Откройте код R (clinicalDiffR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  13. Откройте программу R, запустите модифицированный код R (clinicalDiffR) и нарисуйте картинку с помощью пакета ggpubr.
  14. Перейдите в интерфейс веб-сайта UCSC Xena .
  15. Перейдите на вкладку Запустить Xena .
  16. Нажмите на вкладку НАБОРЫ ДАННЫХ в верхней части экрана.
  17. Из 129 когорт и 1 571 наборов данных на этой странице нажмите на вкладку, чтобы увидеть в общей сложности 33 вида рака, таких как острый миелоидный лейкоз GDC TCGA (LAML), GDC TCGA Рак коры надпочечников (ACC), GDC TCGA Рак желчных протоков (CHOL) и другие.
  18. В меню фенотипа выберите и нажмите на вкладку данных о выживаемости.
  19. В меню загрузки нажмите на соответствующую ссылку.
  20. Распакуйте zip-архив данных о выживаемости для 33 различных видов рака в один файл в папке рабочего стола компьютера.
  21. Поместите распакованные данные о выживании в ту же папку, что и singleGeneExp.txt файл, полученный на шаге 1.9.
  22. Откройте код R (preOSR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится указанная выше папка, в строку, где находится setwd в коде R.
  23. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (preOSR). Вычислите через пакет «лимма», чтобы получить файл данных о выживаемости TMEM200A при панраке: expTime.txt.
  24. Откройте код R (OSR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится файл expTime.txt , в строку, где находится setwd в коде R.
  25. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (OSR). Выполните анализ КМ с использованием пакетов «survival» и «survminer» на основе данных в файле expTime.txt и постройте кривые выживаемости для TMEM200A при панраке.

17. Одномерный и многомерный регрессионный анализ Кокса при строительстве лесных участков

  1. Открываем R-код (COXR) и копируем и вставляем путь, по которому мы получили expTime.txt находится файл из 16.23 , в строку, где находится setwd в R-коде.
  2. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (COXR). Основываясь на данных в файле expTime.txt , выполните одномерный регрессионный анализ ЦОГ с использованием пакетов «survival», «survminer» и «forestplot», чтобы построить одномерный лесной график TMEM200A при различных видах рака.
  3. Поместите expTime.txt файл из шага 16.23 и clinical.txt из шага 16.10 в одну папку.
  4. Откройте код R (multicoxR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится папка, содержащая файл expTime.txt из шага 16.23 и файл clinical.txt из шага 16.10, в строку, где находится setwd в коде R.
  5. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (multicoxR). Выполните многомерный регрессионный анализ COX с использованием пакетов "survival" и "survminer", чтобы построить многомерный лесной график TMEM200A при различных видах рака на основе данных в файлах expTime.txt и clinical.txt .

18. Прогностическая модель рака желудка на основе экспрессии TMEM200A и клинических особенностей

  1. Поместите clinical.txt файл из шага 16.10 и expTime.txt файл из шага 16.23 в одну папку.
  2. Откройте код R (NomoR), скопируйте и вставьте путь, по которому находится приведенный выше файл txt, в строку, где находится setwd в коде R.
  3. Откройте программное обеспечение R и запустите измененный код R (NomoR). Используйте программные пакеты "survival", "regplot" и "rms" для TMEM200A экспрессии данных в ГК и клинических данных для построения прогностической модели для прогнозирования выживаемости пациентов.

19. Клеточная культура и трансфекция миРНК TMEM200A

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки HGC-27 STAD человека, клетки SGC-7901 и эпителиальные клетки слизистой оболочки желудка человека GES-1 были получены коммерчески (см. таблицу материалов), реанимированы, инокулированы в полную среду Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 (содержащую 10% сыворотки новорожденного плода крупного рогатого скота и 1% смеси пенициллина) и культивированы при 37 °C в 5%CO2 инкубатор клеточных культур. Питательную среду меняли каждые 2-3 дня. Клетки в хорошем состоянии роста высевали в шестилуночные планшеты по (2-3) × 105 клеток на лунку.

  1. Сначала возьмите три микроцентрифужные пробирки и добавьте в каждую пробирку 8 мкл реагента для трансфекции (см. раздел«Материалы») и 200 мкл базальной среды. Затем добавьте 4 мкг SiRNA1, SiRNA2 и SiRNA3 в каждую пробирку соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для TMEM200A нокдауна была разработана и закуплена миРНК (см. Таблицу материалов).
  2. Тщательно перемешайте смесь в трех пробирках микроцентрифуги и добавьте в каждую из трех лунок 6-луночной пластины. Осторожно встряхните 6-луночную пластину, чтобы равномерно распределить смесь. Обозначьте три лунки, в которые была добавлена смесь , как SiRNA-1, SiRNA-2 и SiRNA-3.
  3. После инкубации клеток в течение 4-6 ч замените половину среды в трех подлунках 6-луночной планшета.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При замене половины полной среды отсасывайте половину исходной полной среды и пополняйте половину свежей полной среды.
  4. Через 24-48 ч использовали TMEM200A клетки , трансфицированные миРНК, в качестве экспериментальной группы, и нетрансфицированные клетки в качестве отрицательной контрольной группы. Проведите количественную полимеразную цепную реакцию в реальном времени (qRT-PCR, см. раздел 20) для оценки влияния трансфекции на клетки.

20. Количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени

  1. Отбросьте питательную среду для клеток в каждой подгруппе и осторожно промойте клетки дважды 1 мл фосфатно-солевого буфера (PBS).
  2. Выделите общую РНК с помощью набора для выделения РНК (см. таблицу материалов).
  3. Оцените концентрацию РНК и синтезируйте кДНК с 1 мкг РНК с помощью набора для синтеза кДНК, следуя инструкциям производителя.
  4. Выполняйте количественную ПЦР в реальном времени (qRT-PCR) на 10-кратных разведениях кДНК в 10 мкл реакционной смеси, включая прямые и обратные праймеры для GAPDH (для стандартизации), TMEM200A (см. таблицу материалов) и мастер-микс для кПЦР в реальном времени, используя систему анализа ПЦР в реальном времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте каждый эксперимент в трех экземплярах.
  5. Используют следующие условия реакции кПЦР: инициализация, 95 °C в течение 3 мин; денатурация, 95 °С в течение 10 с; отжиг, 60 °С в течение 30 с; и удлинения, 80 °C в течение 10 с; Повторите денатурацию, отжиг и удлинение 40х. Определите относительную экспрессию каждого гена с помощью метода 2-ΔΔCt 28.
  6. Повторите эксперименты не менее трех раз, чтобы получить биологические трипликаты.

21. Вестерн-блоттинг экспрессии соответствующего белка

  1. Выбросьте питательную среду для клеток в каждой подгруппе и аккуратно промойте клетки 2 x 1 мл PBS.
  2. Охладите 6-луночные планшеты, содержащие клетки на льду, и добавьте 150 мкл предварительно охлажденного буфера для лизиса радиоиммунного анализа (RIPA) (150 мМ NaCl, 0,1% Triton X-100, 0,5% дезоксихолата натрия, 0,1% SDS, 50 мМ Tris-HCl pH 8,0 и свежедобавленный коктейль ингибиторов протеазы). Дайте лизису продолжаться на льду в течение 10 минут.
  3. Используя пластиковый скребок для клеток, удалите прилипшие клетки из чашки и осторожно перенесите клеточный раствор в предварительно охлажденную микроцентрифужную пробирку.
  4. Центрифугируют клеточный лизат в течение 10 мин при 1,5 × 104 г при 4 °С. Перелейте надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл.
  5. Используйте набор для анализа белка BCA, чтобы определить содержание белка в соответствии с инструкциями производителя.
  6. Загрузите 30 г белка из каждого образца на 10%-ный гель для электрофореза с полиакриламидным гелем на основе додецилсульфата натрия (SDS-PAGE) и запустите при 80 В в течение 0,5 ч, а затем 1,5 ч при 120 В.
  7. Переносят белки из геля на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) 45 мкм при напряжении 300 мА в течение 1-1,5 ч.
  8. Поместив мембрану из ПВДФ на шейкер и встряхивая ее в течение 3 x 5 мин, добавьте Tris-буферный физиологический раствор с Tween 20 (TBST, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,4, 150 мМ NaCl и 0,1% Tween 20) в соответствующий контейнер белковой стороной (гелевой стороной) вверх.
  9. Поместите мембрану в блокирующий буфер (см. таблицу материалов) и инкубируйте ее в течение 0,5 ч при комнатной температуре.
  10. Промывайте мембрану TBST в течение 3 x 10 мин.
  11. Инкубируют мембрану с первичными антителами против фосфо-АКТ (p-AKT; 1:1,000), общего AKT 1:1,000, E-кадгерина (E-ca; 1:1,000), N-кадгерина (N-ca; 1:1,000), виментина 1:1,000, улитки 1:1,000, TMEM200A 1:1,000, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH; 1:1,000), в течение ночи при 4 °C.
  12. Промывают мембрану в течение 3 х 10 мин и инкубируют мембрану с вторичными антителами кролика или мыши (1:5 000) в течение 1 ч при комнатной температуре.
  13. Инкубируйте мембрану PVDF с подложкой ECL в течение 30 секунд и детектируйте сигнал с помощью системы визуализации.

22. Проба CCK-8

  1. Высейте человеческие клетки STAD HGC-27 в хороших условиях роста в 96-луночные планшеты.
  2. Когда плотность клеток достигнет 60-70%, трансфицируют клетки TMEM200A миРНК (как на шаге 19.3).
  3. Трансфицированные клетки засевают в 96-луночные планшеты с плотностью клеток 5 × 10 3 на лунку (подсчитывают жизнеспособные клетки с помощью счетчика клеток), разделяют на группы NC и TMEM200A миРНК (с тремя реплицированными лунками в каждой группе) и инкубируют при 37 °C.
  4. Реагент CCK-8 добавляют через 0, 24, 48, 72 и 96 ч и инкубируют при 37 °C в течение 2 ч. Измерьте абсорбцию (450 нм) с помощью многофункционального этикетировщика ферментов.

Результаты

Экспрессия TMEM200A при различных видах рака
Как показано на рисунке 1, сначала мы проанализировали дифференциальные уровни экспрессии TMEM200A при различных видах рака с помощью различных баз данных. TMEM200A экспрессия была повышена при холанг?...

Обсуждение

TMEM200A принадлежит к семейству ТМЭМ, которые необходимы для пролиферации раковых клеток38. Вариабельная экспрессия TMEM200A при различных злокачественных новообразованиях привлекла меньше внимания, и отсутствует тщательное панраковое исследование. Тем не менее, прод...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82160550).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-AKT antibodyProteintech Group, Inc60203-2-Ig
Anti-E-cadherin antibodyProteintech Group, Inc20874-1-AP
anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibodyProteintech Group, Inc10494-1-AP
Anti-N-cadherin antibodyProteintech Group, Inc22018-1-AP
Anti-P-AKT antibodyProteintech Group, Inc66444-1-Ig
Anti-snail antibodyProteintech Group, Inc13099-1-AP
Anti-Vimentin antibodyProteintech Group, Inc10366-1-AP
AxyPrepMultisourceTotalRNAMini-
prep Kit		Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., LtdUEL-UE-MN-MS-RNA-50G
BCA Protein Assay KitEpizyme BiotechZJ101L
CCK-8 reagentMedChemExpressHY-K0301-500T
Fetal bovine serum (FBS)CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INCFBSSR-01021
GAPDH primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG
GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG
TCAGAGGAG
HighGene plus Transfection reagentABclonalRM09014P
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-1
HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L)Proteintech Group, IncSA00001-2
Human gastric mucosal epithelial GES-1 cellsGuangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd.
Human STAD HGC-27 cellsProcell Life Science&Technology Co.,Ltd
Human STAD SGC-7901 cellsProcell Life Science&Technology Co.,Ltd
MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX)Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMQ10101S
MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase  Mona (Suzhou) Biotechnology Co., LtdMR05101M
Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence KitEpizyme BiotechSQ201
PAGE Gel Fast Preparationb Kit Epizyme BiotechPG111
Penicillin-streptomycin (Pen-Strep)Beijing Solarbio Science & Technology Co.,LtdP1400-100
Polyvinylidene difluoride (PVDF) membraneMerck KGaAIPVH00010-1
Protein Free Rapid Blocking BufferEpizyme BiotechPS108P
RIPA lysis solutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdR0010
RPMI 1640 complete mediumThermo Fisher ScientificC11875500BT
Skimmed milkCampina: Elk
TBST buffer solutionBeijing Solarbio Science & Technology Co., LtdT1082
The protein loading bufferEpizyme BiotechLT101S
TMEM200A knockdown plasmidMiaoLing Plasmid
TMEM200A primerSangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd.Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT
TMEM200A SiRNA1MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC
TMEM200A SiRNA2MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC
TMEM200A SiRNA3MiaoLing PlasmidForward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC
Transmembrane protein 200A AntibodyProteintech Group, Inc48081-1
Equipment
CO2 cell culture incubatorHaier GroupPYXE-80IR
Electrophoresis instrumentBio-RAD
Fluorescence quantitative PCR instrumentBio-RAD
Gel Imaging System (Tanon 5200)Tanon Science & Technology Co., LtdLAB-0002-0007-SHTN
Multifunctional Enzyme LabelerBerthold

Ссылки

  1. Torre, L. A., Siegel, R. L., Ward, E. M., Jemal, A. Global cancer incidence and mortality rates and trends--an update. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 25 (1), 16-27 (2016).
  2. Long, X., et al. Economic burden of malignant tumors - Yichang City, Hubei Province, China, 2019. China CDC Wkly. 4 (15), 312-316 (2022).
  3. Harbeck, N., Gnant, M. Breast cancer. Lancet. 389 (10074), 1134-1150 (2017).
  4. Bagchi, S., Yuan, R., Engleman, E. G. Immune checkpoint inhibitors for the treatment of cancer: clinical impact and mechanisms of response and resistance. Annu Rev Pathol. 16, 223-249 (2021).
  5. Lam, G. T., et al. Pitfalls in cutaneous melanoma diagnosis and the need for new reliable markers. Mol Diagn Ther. 27 (1), 49-60 (2023).
  6. Gromiha, M. M., Ou, Y. Y. Bioinformatics approaches for functional annotation of membrane proteins. Brief Bioinform. 15 (2), 155-168 (2014).
  7. Schmit, K., Michiels, C. TMEM proteins in cancer: a review. Front Pharmacol. 9, 1345 (2018).
  8. Marx, S., et al. Transmembrane (TMEM) protein family members: Poorly characterized even if essential for the metastatic process. Semin Cancer Biol. 60, 96-106 (2020).
  9. Fu, K., et al. Overexpression of transmembrane protein 168 in the mouse nucleus accumbens induces anxiety and sensorimotor gating deficit. PLoS One. 12 (12), e0189006 (2017).
  10. Cuajungco, M. P., et al. Abnormal accumulation of human transmembrane (TMEM)-176A and 176B proteins is associated with cancer pathology. Acta Histochem. 114 (7), 705-712 (2012).
  11. Zhang, S., et al. TMEM116 is required for lung cancer cell motility and metastasis through PDK1 signaling pathway. Cell Death Dis. 12 (12), 1086 (2021).
  12. Zhang, N., Pan, H., Liang, X., Xie, J., Han, W. The roles of transmembrane family proteins in the regulation of store-operated Ca(2+) entry. Cell Mol Life Sci. 79 (2), 118 (2022).
  13. Zhang, X., Zheng, P., Li, Z., Gao, S., Liu, G. The somatic mutation landscape and RNA prognostic markers in stomach adenocarcinoma. Onco Targets Ther. 13, 7735-7746 (2020).
  14. Jia, D., et al. Mining TCGA database for genes of prognostic value in glioblastoma microenvironment. Aging (Albany NY). 10 (4), 592-605 (2018).
  15. Wang, S., et al. UCSCXenaShiny: an R/CRAN package for interactive analysis of UCSC Xena data. Bioinformatics. 38 (2), 527-529 (2022).
  16. Li, T., et al. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Res. 48 (W1), W509-W514 (2020).
  17. Thul, P. J., et al. A subcellular map of the human proteome. Science. 356 (6340), eaal3321 (2017).
  18. Li, Y., Ge, D., Lu, C. The SMART App: an interactive web application for comprehensive DNA methylation analysis and visualization. Epigenetics Chromatin. 12 (1), 71 (2019).
  19. Chandrashekar, D. S., et al. UALCAN: An update to the integrated cancer data analysis platform. Neoplasia. 25, 18-27 (2022).
  20. Tate, J. G., et al. COSMIC: the Catalogue Of Somatic Mutations In Cancer. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D941-D947 (2019).
  21. Gao, J., et al. Integrative analysis of complex cancer genomics and clinical profiles using the cBioPortal. Sci Signal. 6 (269), pl1 (2013).
  22. Shen, W., et al. Sangerbox: A comprehensive, interaction-friendly clinical bioinformatics analysis platform. iMeta. 1 (3), e36 (2022).
  23. Ru, B., et al. TISIDB: an integrated repository portal for tumor-immune system interactions. Bioinformatics. 35 (20), 4200-4202 (2019).
  24. Yuan, H., et al. CancerSEA: a cancer single-cell state atlas. Nucleic Acids Res. 47 (D1), D900-D908 (2019).
  25. Sun, D., et al. TISCH: a comprehensive web resource enabling interactive single-cell transcriptome visualization of tumor microenvironment. Nucleic Acids Res. 49 (D1), D1420-D1430 (2021).
  26. Warde-Farley, D., et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res. 38, W214-W220 (2010).
  27. Zhu, Y., Feng, S., Song, Z., Wang, Z., Chen, G. Identification of immunological characteristics and immune subtypes based on single-sample gene set enrichment analysis algorithm in lower-grade glioma. Front Genet. 13, 894865 (2022).
  28. Mueller Bustin, S. A., R, Real-time reverse transcription PCR (qRT-PCR) and its potential use in clinical diagnosis. Clin Sci (Lond). 109 (4), 365-379 (2005).
  29. Sun, L., Zhang, H., Gao, P. Metabolic reprogramming and epigenetic modifications on the path to cancer. Protein Cell. 13 (12), 877-919 (2022).
  30. Ntontsi, P., Photiades, A., Zervas, E., Xanthou, G., Samitas, K. Genetics and epigenetics in asthma. Int J Mol Sci. 22 (5), 2412 (2021).
  31. Martínez-Reyes, I., Chandel, N. S. Cancer metabolism: looking forward. Nat Rev Cancer. 21 (10), 669-680 (2021).
  32. Chen, Y., et al. PremPS: Predicting the impact of missense mutations on protein stability. PLoS Comput Biol. 16 (12), e1008543 (2020).
  33. Li, M., Petukh, M., Alexov, E., Panchenko, A. R. Predicting the impact of missense mutations on protein-protein binding affinity. J Chem Theory Comput. 10 (4), 1770-1780 (2014).
  34. Hirsch, D., et al. Clinical responses to PD-1 inhibition and their molecular characterization in six patients with mismatch repair-deficient metastatic cancer of the digestive system. J Cancer Res Clin Oncol. 147 (1), 263-273 (2021).
  35. Poulogiannis, G., Frayling, I. M., Arends, M. J. DNA mismatch repair deficiency in sporadic colorectal cancer and Lynch syndrome. Histopathology. 56 (2), 167-179 (2010).
  36. Chintamani, J., et al. The expression of mismatched repair genes and their correlation with clinicopathological parameters and response to neo-adjuvant chemotherapy in breast cancer. Int Semin Surg Oncol. 4, 5 (2007).
  37. Deng, H., et al. High expression of TMEM200A is associated with a poor prognosis and immune infiltration in gastric cancer. Pathol Oncol Res. 29, 1610893 (2023).
  38. Stemmler, M. P. Cadherins in development and cancer. Mol Biosyst. 4 (8), 835-850 (2008).
  39. Bill, A., et al. ANO1/TMEM16A interacts with EGFR and correlates with sensitivity to EGFR-targeting therapy in head and neck cancer. Oncotarget. 6 (11), 9173-9188 (2015).
  40. De Las Rivas, J., et al. Cancer drug resistance induced by EMT: novel therapeutic strategies. Arch Toxicol. 95 (7), 2279-2297 (2021).
  41. Tian, S., et al. SERPINH1 regulates EMT and gastric cancer metastasis via the Wnt/β-catenin signaling pathway. Aging (Albany NY). 12 (4), 3574-3593 (2020).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

TMEM200Ain vitroEMTPI3K AKT

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены