Estimación de la sensibilidad estructural de regiones intrínsecamente desordenadas en respuesta al estrés hiperosmótico en células vivas mediante FRET

Resumen

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son dominios proteicos flexibles que modifican su conformación en respuesta a los cambios ambientales. La transferencia de energía por resonancia de fluorescencia de conjunto (FRET) puede estimar las dimensiones de las proteínas en diferentes condiciones. Presentamos un enfoque FRET para evaluar la sensibilidad estructural de IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae bajo estrés hiperosmótico.

Resumen

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR, por sus siglas en inglés) son dominios proteicos que participan en procesos celulares cruciales. Durante las condiciones de estrés, las propiedades fisicoquímicas del entorno celular cambian, lo que afecta directamente al conjunto conformacional de las IDR. Los exámenes exhaustivos son inherentemente sensibles a las perturbaciones ambientales. El estudio de cómo las propiedades fisicoquímicas de la célula regulan el conjunto conformacional de las IDR es esencial para comprender el control ambiental de su función. Aquí, describimos un método paso a paso para medir la sensibilidad estructural de las IDR en células vivas de Saccharomyces cerevisiae en respuesta a condiciones de estrés hiperosmótico. Presentamos el uso de la transferencia de energía por resonancia fluorescente de conjunto (FRET) para estimar cómo cambian las dimensiones globales de las IDR durante un aumento progresivo del estrés hiperosmótico impuesto a las células con cualquier osmolito. Además, proporcionamos un script para procesar las mediciones de fluorescencia y comparar la sensibilidad estructural para diferentes IDR. Siguiendo este método, los investigadores pueden obtener información valiosa sobre los cambios conformacionales que experimentan las IDR en el complejo entorno intracelular al cambiar de entorno.

Introducción

Las regiones intrínsecamente desordenadas (IDR) son componentes críticos en los procesos celulares¹. En combinación con los dominios estructurados, los IDR son esenciales para las funciones de las proteínas. La composición de aminoácidos de los IDR está sesgada, representada principalmente por residuos cargados, hidrófilos y pequeños. Debido a esta propiedad, los IDR se consideran dominios de baja complejidad ^2,3. Numerosas IDR han atraído la atención, principalmente porque estas regiones juegan un papel crucial en las condiciones patológicas, particularmente las enfermedades neurodegen....

Protocolo

1. Construcción de plásmido

1. Amplifique el marco de lectura abierto (ORF) que codifica la IDR deseada mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). No incluya el codón de parada, ya que el ORF estará flanqueado por los genes que codifican las proteínas fluorescentes. Para la amplificación, diseñe cebadores con los sitios de restricción SacI (5') y BglII (3').
   NOTA: Para la sección de resultados representativos, utilizamos AtLEA4-5 como IDR seleccionado. Amplificamos el ORF de AtLEA4-5 a partir del plásmido¹² pTrc99A-AtLEA4-5.
2. Digerir el producto de PCR ORF por restricción consecu....

Discusión

El método que aquí se presenta ofrece una forma de obtener información sobre cómo las dimensiones globales del conjunto de exámenes exhaustivos detectan y responden a las perturbaciones ambientales. Este método se basa en una construcción codificada genéticamente y no requiere componentes adicionales más allá de una expresión estable de plásmido en células de levadura, lo que lo hace adaptable para aplicaciones potenciales en otros tipos de células. Además, es versátil para explorar otras perturbaciones f.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500