Stima della sensibilità strutturale di regioni intrinsecamente disordinate in risposta allo stress iperosmotico in cellule viventi utilizzando FRET

Riepilogo

Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono domini proteici flessibili che modificano la loro conformazione in risposta ai cambiamenti ambientali. Il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza d'insieme (FRET) può stimare le dimensioni delle proteine in diverse condizioni. Presentiamo un approccio FRET per valutare la sensibilità strutturale dell'IDR in cellule viventi di Saccharomyces cerevisiae in condizioni di stress iperosmotico.

Abstract

Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono domini proteici che partecipano a processi cellulari cruciali. Durante le condizioni di stress, le proprietà fisico-chimiche dell'ambiente cellulare cambiano, influenzando direttamente l'insieme conformazionale degli IDR. Gli esami approfonditi sono intrinsecamente sensibili alle perturbazioni ambientali. Studiare come le proprietà fisico-chimiche della cellula regolano l'insieme conformazionale degli IDR è essenziale per comprendere il controllo ambientale della loro funzione. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per misurare la sensibilità strutturale degli IDR in cellule viventi di Saccharomyces cerevisiae in risposta a condizioni di stress iperosmotico. Presentiamo l'uso del trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza d'insieme (FRET) per stimare come cambiano le dimensioni globali degli IDR durante un progressivo aumento dello stress iperosmotico imposto alle cellule con qualsiasi osmolito. Inoltre, forniamo uno script per l'elaborazione delle misure di fluorescenza e il confronto della sensibilità strutturale per diversi IDR. Seguendo questo metodo, i ricercatori possono ottenere preziose informazioni sui cambiamenti conformazionali che gli IDR subiscono nel complesso ambiente intracellulare al variare degli ambienti.

Introduzione

Le regioni intrinsecamente disordinate (IDR) sono componenti fondamentali nei processi cellulari¹. In combinazione con i domini strutturati, gli IDR sono essenziali per le funzioni proteiche. La composizione amminoacidica degli IDR è distorta, rappresentata principalmente da residui carichi, idrofili e di piccole dimensioni. A causa di questa proprietà, gli esami approfonditi sono considerati domini a bassa complessità ^2,3. Numerosi esami approfonditi hanno attirato l'attenzione, principalmente perché queste regioni svolgono un ruolo cruciale nelle condizioni patologiche, in particolare....

Protocollo

1. Costrutto plasmidico

1. Amplificare il frame di lettura aperto (ORF) che codifica per l'IDR desiderato mediante reazione a catena della polimerasi (PCR). Non includere il codone di stop poiché l'ORF sarà affiancato dai geni che codificano le proteine fluorescenti. Per l'amplificazione, progettare primer con i siti di restrizione SacI (5') e BglII (3').
   NOTA: Per la sezione dei risultati rappresentativi, abbiamo utilizzato AtLEA4-5 come IDR selezionato. Abbiamo amplificato l'ORF di AtLEA4-5 dal plasmide pTrc99A-AtLEA4-5¹².
2. Digerire il prodotto ORF PCR mediante restrizione consecutiva con ....

Discussione

Il metodo qui presentato offre un modo per ottenere informazioni su come le dimensioni globali dell'insieme degli IDR percepiscono e rispondono alle perturbazioni ambientali. Questo metodo si basa su un costrutto geneticamente codificato e non richiede componenti aggiuntivi oltre a un'espressione stabile del plasmide nelle cellule di lievito, il che lo rende adattabile per potenziali applicazioni in altri tipi di cellule. Inoltre, è versatile per esplorare altre perturbazioni fisico-chimiche che le cellule eucariotiche .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500