Оценка структурной чувствительности внутренне неупорядоченных участков в ответ на гиперосмотический стресс в живых клетках с помощью FRET

Резюме

Внутренне неупорядоченные области (IDR) представляют собой гибкие белковые домены, которые изменяют свою конформацию в ответ на изменения окружающей среды. Ансамблевый флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) позволяет оценивать размеры белка в различных условиях. Мы представляем подход FRET для оценки структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в условиях гиперосмотического стресса.

Аннотация

Внутренне неупорядоченные области (IDR) — это белковые домены, которые участвуют в важнейших клеточных процессах. В стрессовых условиях изменяются физико-химические свойства клеточной среды, что напрямую влияет на конформационный ансамбль РДЭ. РДЭ по своей природе чувствительны к возмущениям окружающей среды. Изучение того, как физико-химические свойства клетки регулируют конформационный ансамбль РДЭ, имеет важное значение для понимания экологического контроля их функции. В данной статье мы опишем пошаговый метод измерения структурной чувствительности РДЭ в живых клетках Saccharomyces cerevisiae в ответ на гиперосмотические стрессовые условия. Мы представляем использование ансамбля флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET) для оценки того, как изменяются глобальные размеры РДЭ при прогрессирующем увеличении гиперосмотического стресса, наложенного на клетки с любым осмолитом. Кроме того, мы предоставляем скрипт для обработки флуоресцентных измерений и сравнения структурной чувствительности для разных РДЭ. Следуя этому методу, исследователи могут получить ценную информацию о конформационных изменениях, которые претерпевают IDR в сложной внутриклеточной среде при изменении окружающей среды.

Введение

Внутренне неупорядоченные области (РДЭ) являются важнейшими компонентами клеточных процессов¹. В сочетании со структурированными доменами IDR имеют важное значение для белковых функций. Аминокислотный состав РДЭ смещен, представлен в основном заряженными, гидрофильными и мелкими остатками. Из-за этого свойства IDR считаются доменами низкой сложности ^2,3. Многочисленные РДЭ привлекли к себе внимание, в первую очередь потому, что эти регионы играют решающую роль в патологических состояниях, особенно нейродегенеративных заболеваниях. Такие заболевания характеризуются самосборкой и последую....

протокол

1. Плазмидная конструкция

1. С помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) усилите открытую рамку считывания (ORF), которая кодирует желаемый IDR. Не включайте стоп-кодон, так как ORF будет окружен генами, кодирующими флуоресцентные белки. Для усиления разработайте праймеры с сайтами ограничения SacI (5') и BglII (3').
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для раздела репрезентативных результатов мы использовали AtLEA4-5 в качестве выбранного IDR. Мы амплифицировали КИН AtLEA4-5 из плазмиды pTrc99A-AtLEA4-5¹².
2. Расщепление продукта ПЦР ORF путем последовательного ограничения ферментами SacI и BglII

Результаты

После трансформации дрожжевых клеток плазмидой pDRFLIP38-AtLEA4-5 наблюдалась флуоресценция положительных трансформантов с помощью трансиллюминатора синего света и фильтра (рис. 1). Приготовление различных растворов для индуцирования гиперосмотического стресса занимает мно.......

Обсуждение

Представленный здесь метод позволяет получить представление о том, как глобальные измерения ансамбля РДЭ воспринимают и реагируют на возмущения окружающей среды. Этот метод основан на генетически закодированной конструкции и не требует никаких дополнительных компонентов, кроме ста?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500