FRETを用いた生細胞の高浸透圧ストレスに応答した内在性変性領域の構造感受性の推定

要約

天然変性領域(IDR)は、環境変化に応答してコンフォメーションを変化させる柔軟なタンパク質ドメインです。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)は、さまざまな条件下でタンパク質の寸法を推定できます。高浸透圧ストレス下で生きた 出芽酵母 細胞のIDR構造感受性を評価するためのFRETアプローチを提示します。

要約

天然変性領域(IDR)は、重要な細胞プロセスに関与するタンパク質ドメインです。ストレス状態では、細胞環境の物理化学的特性が変化し、IDRのコンフォメーションアンサンブルに直接影響します。IDRは本質的に環境の摂動に敏感です。細胞の物理化学的性質がIDRの立体構造アンサンブルをどのように制御するかを研究することは、その機能の環境制御を理解するために不可欠です。ここでは、高浸透圧ストレス条件に応答して、生きた出 芽酵母 細胞におけるIDRの構造感受性を測定するための段階的な方法について説明します。アンサンブル蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を使用して、浸透圧を有する細胞に課せられる高浸透圧ストレスの漸進的な増加中にIDRの全体的な寸法がどのように変化するかを推定します。さらに、蛍光測定を処理し、異なるIDRの構造感度を比較するためのスクリプトを提供しています。この方法に従うことで、研究者は、環境の変化に応じてIDRが複雑な細胞内環境で受ける立体構造の変化に関する貴重な洞察を得ることができます。

概要

天然変性領域(IDR)は、^{細胞プロセスにおける}重要な構成要素です1。構造化ドメインと組み合わせて、IDRはタンパク質機能に不可欠です。IDRのアミノ酸組成は偏っており、主に荷電残基、親水性残基、および小残基で表されます。この特性により、IDRは複雑度の低いドメインと見なされる^2,3。多くのIDRが注目されているのは、これらの領域が病態、特に神経変性疾患において重要な役割を果たしていることが主な理由です。このような疾患は、自己組織化とそれに続くニューロンにおけるIDRの細胞外または細胞内沈着を特徴とする⁴。例えば、アルツハイマー病のアミロイドβ(Aβ)、ハンチントン病のハンチンチン(HTT)、筋萎縮性側索硬化症や前頭側頭型^認知症のTAR DNA結合タンパク質-43(TDP-43)や肉腫で融合したタンパク質(FUS)などが挙げられる4。疾患におけるIDRの構造再配列の研究は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)などの分光法によって大幅に強化されています。

IDRの親水性と伸長性により、溶液環境の物理化学的特性の変化に非常に敏感になります⁵。IDRの立体配座アンサンブルが環境によ....

プロトコル

1. プラスミドコンストラクト

1. ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって目的のIDRをコードするオープンリーディングフレーム(ORF)を増幅します。終止コドンは、蛍光タンパク質をコードする遺伝子に挟まれるため、含めないでください。増幅には、 SacI(5')および BglII(3')の制限部位を持つプライマーを設計します。
   注:代表的な結果のセクションでは、選択したIDRとしてAtLEA4-5を使用しました。pTrc99A-AtLEA4-5プラスミド¹²からAtLEA4-5のORFを増幅した。
2. SacIおよびBglII酵素による連続制限によりORF PCR産物を消化する¹³。
3. 市販のプラスミド pDRFLIP38-AtLEA4-5 (#178189) を Addgene (https://www.addgene.org/178189/) から入手します。
4. SacIおよびBglII酵素を用いて連続的な制限を行い、pDRFLIP38-AtLEA4-5プラスミドからAtLEA4-5 ORFを除去し、FRETペアを含むオープンプラスミドを残します¹³。
5. ア....

ディスカッション

ここで紹介する手法は、IDRのアンサンブルのグローバルな次元が環境摂動をどのように感知し、応答するかについての洞察を得る方法を提供します。この方法は、遺伝的にコードされたコンストラクトに依存しており、酵母細胞でのプラスミドの安定発現以外に追加の成分を必要としないため、他の細胞タイプでの潜在的なアプリケーションに適応できます。さらに、真核細胞がライフサイ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500