Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos

Resumen

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) se definen por su capacidad de producir todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de su vida. Esto se prueba operativamente mediante el trasplante de poblaciones celulares que contienen HSC en ratones singénicos o inmunocomprometidos. A continuación, se mide el tamaño y la composición multilinaje del injerto a lo largo del tiempo, normalmente mediante citometría de flujo. Clásicamente, una población que contiene HSC se inyecta en la circulación del animal, después de lo cual las HSC se dirigen a la médula ósea, donde se alojan y comienzan a producir sangre. Alternativamente, las HSC y/o las células progenitoras (HSPC) pueden colocarse directamente en la cavidad de la médula ósea.

En este artículo se describe un protocolo para la inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes. En resumen, se anestesia a los ratones preacondicionados y se perfora un pequeño orificio a través de la rodilla hasta el fémur con una aguja. Usando una aguja de insulina más pequeña, las células se inyectan directamente en el mismo conducto creado por la primera aguja. Este método de trasplante se puede aplicar en diversos diseños experimentales, utilizando células de ratón o humanas como células donantes. Ha sido el más utilizado para el xenotrasplante, porque en este contexto, se cree que proporciona un mejor injerto sobre las inyecciones intravenosas, mejorando así el poder estadístico y reduciendo el número de ratones a utilizar.

Introducción

La sangre tiene una de las tasas de regeneración más altas del cuerpo humano, produciendo 1 × 10¹² células por día en^{la médula} ósea humana adulta. Las células madre hematopoyéticas (HSC) garantizan la producción de sangre a lo largo de la vida mediante el proceso de hematopoyesis y se definen por su capacidad para producir todos los tipos de células sanguíneas (multipotencialidad) mientras se mantienen (autorrenovación). Históricamente, el estándar de oro para probar la función de un HSC siempre se ha basado en el trasplante, probando la capacidad de una población de donantes para reconstituir todos los linajes sanguíneos de un ratón a largo plazo (comúnmente definido como un mínimo de 20 semanas)². Un gran número de trabajos funcionales que abarcan varias décadas han demostrado que el compartimento HSC es heterogéneo tanto en la producción de linaje como en la reconstitución a largo plazo. El conjunto de herramientas para estudiar la hematopoyesis se ha ampliado considerablemente a lo largo de los años, con muchas técnicas nuevas, incluidos los ensayos funcionales in vitro de una sola célula, los enfoques ómicos de una sola célula y el rastreo de linaje³. Estos últimos han demostrado de manera concluyente que las contribuciones de las HSC y los progenitores multipotentes difieren en gran medida en la hematopoyesis nativa y bajo el estrés impuesto por el trasplante. Todas estas técnicas complementan los ensayos de trasplante, que siguen siendo importantes para evaluar la capacidad de repoblación a largo plazo de las HSC. En el contexto del estudio de la hematopoyesis humana, el xenotrasplante proporciona el único método para evaluar experimentalmente la autorrenovación en un entorno de organismo completo.

El xenotrasplante de HSC se realiza comúnmente mediante la inyección intravenosa de células en ratones inmunocomprometidos. Sin embargo, las HSC son raras⁴ y el acceso a las muestras humanas que las contienen es limitado. En 2003, el grupo de John Dick adaptó un protocolo para la aspiración de médula ósea y la inyección intrafemoral de ratones diabéticos/inmunodeficiencia combinada grave (NOD-SCID) con células de sangre de cordón umbilical (CB) ^{Lin-CD34+ 5}. Hasta donde sabemos, no se ha informado de una comparación formal de las inyecciones intravenosas frente a las intrafemorales en los resultados de trasplante a largo plazo y en serie. Sin embargo, en comparación directa con las inyecciones intravenosas, las inyecciones intrafemorales proporcionan injertos de mayor tamaño con el mismo número de células trasplantadas⁶, al menos a corto plazo. Además, el injerto se puede detectar con muchas menos células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC) trasplantadas. Se cree que esto se debe a que la administración intrafemoral evita la necesidad de que las HSC lleguen a la médula ósea, lo que en el contexto del xenoinjerto es limitante debido a la falta de reactividad entre especies para una serie de receptores y citocinas. Mediante el uso de inyecciones intrafemorales, Notta y sus colegas fueron los primeros en trasplantar HSC humanas^{individuales 7}, aunque se deben tener consideraciones adicionales, como se describe en sus métodos. La administración intrafemoral de HSPC también tiene limitaciones. La inyección en sí misma altera y destruye parte de la médula ósea y, por lo tanto, no está indicada para estudios de la diafonía entre las HSC y su microambiente de médula ósea. Además, el número máximo de células está limitado por el volumen de esa cavidad ósea y eso puede ser demasiado pequeño para algunas aplicaciones. Al igual que con todas las técnicas, su aplicación en un experimento específico debe sopesarse en función de los beneficios/desventajas y de la pregunta que se hace. En el contexto de los xenotrasplantes, si el objetivo del experimento es probar el injerto de un número bajo de HSPCs humanas sin evaluar el microambiente, la administración intrafemoral suele ser preferible a la inyección intravenosa.

Protocolo

Toda la investigación con animales presentada aquí se adhiere a las Regulaciones de Enmienda de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 de 2012 y se realizó después de la revisión ética y la aprobación del Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB). CABECEO femenino. Se utilizaron para las inyecciones intrafemorales ratones Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG), de entre 12 y 16 semanas (~21-30 g), criados internamente y mantenidos en un centro de animales libres de patógenos específicos. Se recogieron muestras de CB no identificadas de donantes sanos tras el consentimiento informado del Biobanco de Sangre y Células Madre de Cambridge (CBSB) de acuerdo con los procedimientos regulados aprobados por el Comité de Ética de Investigación Local de Cambridgeshire (18/EE/0199).

1. Preparación del ratón

1. Antes de la irradiación, haga una muesca en las orejas de los ratones para identificarlos y péselos para determinar el peso de referencia.
2. Veinticuatro horas antes del trasplante de las células, irradiar subletalmente a los ratones con radiación de 2,4 Gy.

2. Preparación de las células

NOTA: Para estas inyecciones, se pueden utilizar células de muestras frescas o congeladas. Las subpoblaciones específicas de células se pueden clasificar mediante citometría de flujo. Alternativamente, las células se pueden cultivar en las condiciones deseadas antes del trasplante. Para los experimentos mostrados, estamos utilizando células CB CD34⁺ congeladas.

1. Descongele las células en un tubo de 50 ml mediante la adición gota a gota de 10 veces el volumen de la célula de IMDM precalentado + 50% de suero fetal bovino (FBS) + 0,1 mg/ml de DNasa mientras agita el tubo manualmente. Centrifugar las células a 500 × g durante 5 min.
2. Vuelva a suspender las células en 20-40 μL (idealmente 25 μL) de PBS + Penicilina-Estreptomicina (10 U/mL o 0,1%) por ratón. Si es posible, permita que las células adicionales obtengan un volumen muerto cuando las introduzca en la jeringa para las inyecciones. Almacene las células en hielo hasta las inyecciones. El número máximo de células por inyección es de 4 millones de células.

3. Preparación para la inyección intrafemoral en el animalario

1. Prepare las siguientes tres agujas necesarias para este procedimiento:
   1. Prepare una jeringa de 3 ml con una aguja de 27 G 1/2".
   2. Prepare una jeringa de insulina de 0,5 ml con una aguja de 29 g x 12,7 mm que contenga la suspensión celular.
   3. Prepare una jeringa de insulina de 1 mL con una aguja de 29 G x 0,5" con 0,1 mg/kg de buprenorfina (100 μL).
2. Anestesiar a los ratones en una caja anestésica (mediante la inhalación de isoflurano 2% (v/v) y oxígeno 2 L/min). Transfiera el mouse a un cono de nariz y confirme que está listo para el procedimiento pellizcando los dedos de los pies. Aplique ungüento oftálmico en los ojos para prevenir la sequedad.
   NOTA: Este procedimiento se lleva a cabo en una campana de bioseguridad de nivel 2 de contención y se utilizan condiciones estériles.

4. Inyección intrafemoral

1. Coloca al ratón boca arriba y flexiona su pata trasera. Asegure la pata trasera con la mano no dominante colocando el pulgar en el pie, el dedo medio en la cadera y el dedo índice en la parte exterior del fémur.
2. Afeita o arranca suavemente el vello alrededor de la rótula y usa un hisopo con alcohol para limpiar el área.
3. Use la jeringa de 3 ml con una aguja de 27 G 1/2" y apunte a la esquina superior interna de la rótula para perforar suavemente un orificio a través de la piel hacia el fémur. Aunque la aguja se puede girar hacia adelante y hacia atrás al principio, solo use un movimiento en el sentido de las agujas del reloj una vez en el hueso, hasta que toda la aguja esté en el hueso.
   NOTA: El objetivo de este paso es generar un conducto para la entrega de celdas. (Opcional) Para comprobar si la aguja está correctamente en el hueso, suelte la pata y gire la jeringa de lado a lado; Si está correctamente en el hueso, toda la pierna debe moverse con la rotación. Vuelva a asegurar la pierna con la mano no dominante colocando el pulgar en el pie, el dedo medio en la cadera y el dedo índice en la parte exterior del fémur, antes de continuar. Si se inserta incorrectamente, es probable que la aguja esté en el músculo o tendón, que la pierna no gire con la jeringa y que sienta la aguja debajo de la piel.
4. Retire la aguja girándola en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que esté a mitad de camino. En este punto, use un hisopo con alcohol para limpiar alrededor de la aguja (puede haber una pequeña gota de sangre) y luego continúe girando la aguja en sentido contrario a las agujas del reloj y retire la aguja.
5. Inserte la jeringa de insulina de 0,5 ml que contiene las células en la diáfisis femoral a través del mismo conducto. Una vez que la aguja esté dentro, tome nota de sentir un rasguño que indica la ubicación correcta. En este punto, suelte el agarre de la pierna, pero tenga cuidado de no quitar la aguja de la pierna. A continuación, inyecte suavemente los 25 μL de suspensión celular en el fémur y retire la aguja.
   NOTA: El "rasguño" descrito es como golpear una superficie rugosa y si la aguja siente que ha entrado suavemente sin sensación áspera, no está en el lugar correcto. La mayoría de los usuarios entienden esto claramente una vez que tienen éxito en su práctica.

5. Cuidados posteriores a la inyección

1. Inyectar al ratón por vía subcutánea con buprenorfina (0,1 mg/kg, 100 μL) antes de devolverlo a su jaula y controlar la recuperación del anestésico.
   NOTA: El ratón no debe dejarse desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal y no debe devolverse a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo. Es poco probable que los ratones muestren efectos adversos a la inyección intrafemoral; Sin embargo, la inyección intrafemoral puede resultar en una reducción de la actividad y dolor en el área operada.
2. Evalúe la hinchazón del corvejón, el dolor y la movilidad después del procedimiento.
   NOTA: Los ratones deben recuperar la movilidad normal de las extremidades dentro de las 24 horas posteriores a la inyección.

6. Análisis de los datos

1. Eutanasiar a los ratones mediante luxación cervical o cualquier método aprobado después de la inyección en cualquier momento, por ejemplo, 24-48 h para experimentos de localización, 4-12 semanas para la actividad de HSC a corto plazo, >18 semanas para el injerto a largo plazo. Si se planea el análisis de sangre periférica (PB), se debe sangrar a los ratones antes del sacrificio por cualquier método autorizado, produciendo idealmente 50-100 μL de sangre (no más del 10% del volumen total). Retire los huesos de la pata trasera y el bazo de acuerdo con los protocolos de disección estándar.
2. Para la médula ósea:
   1. Mantenga el fémur inyectado (IF) y los huesos no inyectados (tibias de la pierna trasera y fémures no inyectados, denominados BM) separados. Enjuague los huesos con 1 mL de IMDM + 5% FBS y una aguja de 36 G x 3/4" y centrifugue durante 5 min a 500 × g.
   2. Vuelva a suspender el pellet en 500 μL de PBS + 3% de FBS y luego transfiera 50 μL a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 para teñir.
   3. Congele la médula ósea restante y guárdela en nitrógeno líquido para realizar más experimentos ex vivo o secundarios in vivo .
3. Para el PP:
   1. Lave el tubo de recolección con 100 μL de PBS + 3% de FBS, transfiera la sangre a un tubo FACS de 5 mL y aumente el volumen a 2,5 mL con PBS + 3% FBS.
   2. Pipetear con cuidado 1 ml de Pancoll en el fondo de los tubos FACS y centrifugar durante 25 minutos a 500 × g con el freno apagado.
   3. Recoja la capa de capa leucocitaria, transfiérala a tubos de 1,5 ml y rellene hasta 1,5 ml con PBS + 3% FBS. Centrifugar durante 5 min a 500 × g.
   4. Vuelva a suspender el pellet en 50 μL de PBS + 3% de FBS y transfiéralo a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 para teñir.
4. Para el bazo:
   1. Coloque el bazo en un colador de células colocado en un tubo de 50 mL y triture con el émbolo de una jeringa de 3 mL.
   2. Un mililitro a la vez, agregue 5 mL de IMDM + 5% FBS para lavar las células. Lleve 50 μL a un pocillo de una placa de fondo redondo de 96 para teñir.
5. Preparar una mezcla maestra de anticuerpos; A continuación, se muestra un ejemplo de 10 ejemplos:
   1. Alícuota 550 μL de PBS + 3% FBS (50 μL/muestra + 10% extra) en un tubo de 1,5 o 2 mL.
   2. Agregue anticuerpos individuales para que su concentración final sea 2 veces en función de su titulación (por ejemplo, para un anticuerpo titulado 1:100, agregue 11 μL).
      NOTA: Elija un panel de anticuerpos que evalúe la posible diferenciación entre todos los linajes sanguíneos de interés, por ejemplo, CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 y CD3/APCCy7.
6. Tinción: añadir 50 μL de mezcla maestra de anticuerpos a cada uno de los pocillos de la placa de fondo redondo 96 que contiene las muestras a teñir. Teñir durante 20 min a temperatura ambiente, añadir 100 μL de PBS + 3% de FBS para lavar las células, y centrifugar durante 5 min a 500 × g. Retire el sobrenadante.
7. Vuelva a suspender el pellet en 200 μL de PBS + 3% de FBS y pase cada muestra a través de un tubo FACS con un tapón de filtro de células. A las muestras de médula ósea y bazo, añadir 200 μL adicionales de PBS + 3% de FBS.
8. Controles de citometría de flujo: Realice controles de tinción única utilizando perlas de compensación agregando 100 μL de PBS, 1 gota de perlas positivas, 1 gota de perlas negativas y 1 μL del anticuerpo a un tubo de FACS. Dejar actuar 5 min a temperatura ambiente y añadir 300 μL de PBS. Tome 50 μL de células de médula ósea sin teñir de hasta 400 μL con PBS + 3% de FBS como control sin teñir.
9. Análisis de las muestras por citometría de flujo.
   1. Ejecute controles de una sola mancha y sin tinción para la compensación según lo aconsejado para el citómetro utilizado. Configure la compuerta como se muestra en la Figura 3A.
   2. En el caso del PB, se ejecutan todas las células y en el caso de la médula ósea y el bazo, se ejecuta un mínimo de 50.000 eventos por muestra, en función de los niveles de injerto humano.

Resultados

El injerto de las células inyectadas intrafemoralmente puede evaluarse en cualquier momento a partir de las 24 h en función del diseño experimental. En el punto de tiempo final, se pueden recolectar IF, BM, PB y bazos. Estos se pueden procesar y evaluar el nivel de injerto mediante citometría de flujo. Para denominar de forma robusta al injerto humano incluso a niveles bajos, teñimos con dos anticuerpos distintos contra CD45 humano (clon HI30 y clon 2D1). Solo las células positivas...

Discusión

Las inyecciones intrafemorales son una herramienta útil en el xenotrasplante cuando solo se dispone de un pequeño número de HSPC, lo que proporciona un mejor injerto en comparación con las inyecciones intravenosas. Sin embargo, la técnica requiere destreza y entrenamiento. Al practicar, recomendaríamos usar cadáveres frescos del rango de peso correcto (ver más abajo) e inyectar un tinte de color (como el azul tripán) para que en la disección, quede claro si la inyección entró...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169