Inyección intrafemoral de células madre y progenitoras hematopoyéticas humanas en ratones inmunocomprometidos

Resumen

Las inyecciones intrafemorales permiten el injerto de un pequeño número de células madre y progenitoras hematopoyéticas (HSPC), colocando las células directamente en la cavidad de la médula ósea. En este trabajo describimos un protocolo experimental de inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes.

Resumen

Las células madre hematopoyéticas (HSC, por sus siglas en inglés) se definen por su capacidad de producir todos los tipos de células sanguíneas a lo largo de su vida. Esto se prueba operativamente mediante el trasplante de poblaciones celulares que contienen HSC en ratones singénicos o inmunocomprometidos. A continuación, se mide el tamaño y la composición multilinaje del injerto a lo largo del tiempo, normalmente mediante citometría de flujo. Clásicamente, una población que contiene HSC se inyecta en la circulación del animal, después de lo cual las HSC se dirigen a la médula ósea, donde se alojan y comienzan a producir sangre. Alternativamente, las HSC y/o las células progenitoras (HSPC) pueden colocarse directamente en la cavidad de la médula ósea.

En este artículo se describe un protocolo para la inyección intrafemoral de HSPCs humanas en ratones inmunodeficientes. En resumen, se anestesia a los ratones preacondicionados y se perfora un pequeño orificio a través de la rodilla hasta el fémur con una aguja. Usando una aguja de insulina más pequeña, las células se inyectan directamente en el mismo conducto creado por la primera aguja. Este método de trasplante se puede aplicar en diversos diseños experimentales, utilizando células de ratón o humanas como células donantes. Ha sido el más utilizado para el xenotrasplante, porque en este contexto, se cree que proporciona un mejor injerto sobre las inyecciones intravenosas, mejorando así el poder estadístico y reduciendo el número de ratones a utilizar.

Introducción

La sangre tiene una de las tasas de regeneración más altas del cuerpo humano, produciendo 1 × 10¹² células por día en^{la médula} ósea humana adulta. Las células madre hematopoyéticas (HSC) garantizan la producción de sangre a lo largo de la vida mediante el proceso de hematopoyesis y se definen por su capacidad para producir todos los tipos de células sanguíneas (multipotencialidad) mientras se mantienen (autorrenovación). Históricamente, el estándar de oro para probar la función de un HSC siempre se ha basado en el trasplante, probando la capacidad de una población de donantes para reconstituir todos ....

Protocolo

Toda la investigación con animales presentada aquí se adhiere a las Regulaciones de Enmienda de la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 de 2012 y se realizó después de la revisión ética y la aprobación del Organismo de Revisión Ética y Bienestar Animal de la Universidad de Cambridge (AWERB). CABECEO femenino. Se utilizaron para las inyecciones intrafemorales ratones Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG), de entre 12 y 16 semanas (~21-30 g), criados internamente y mantenidos en un centro de animales libres de patógenos específicos. Se recogieron muestras de CB no identificadas de donantes sanos tras e....

Resultados

El injerto de las células inyectadas intrafemoralmente puede evaluarse en cualquier momento a partir de las 24 h en función del diseño experimental. En el punto de tiempo final, se pueden recolectar IF, BM, PB y bazos. Estos se pueden procesar y evaluar el nivel de injerto mediante citometría de flujo. Para denominar de forma robusta al injerto humano incluso a niveles bajos, teñimos con dos anticuerpos distintos contra CD45 humano (clon HI30 y clon 2D1). Solo las células positivas.......

Discusión

Las inyecciones intrafemorales son una herramienta útil en el xenotrasplante cuando solo se dispone de un pequeño número de HSPC, lo que proporciona un mejor injerto en comparación con las inyecciones intravenosas. Sin embargo, la técnica requiere destreza y entrenamiento. Al practicar, recomendaríamos usar cadáveres frescos del rango de peso correcto (ver más abajo) e inyectar un tinte de color (como el azul tripán) para que en la disección, quede claro si la inyección entró.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169