İnsan Hematopoietik Kök ve Progenitör Hücrelerinin İmmün Kuvvetlenmiş Farelere İntrafemoral Enjeksiyonu

Özet

İntrafemoral enjeksiyonlar, hücreleri doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirerek az sayıda hematopoietik kök ve progenitör hücrenin (HSPC'ler) aşılanmasına izin verir. Burada, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonunun deneysel bir protokolünü açıklıyoruz.

Özet

Hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), yaşam boyu tüm kan hücresi tiplerini üretme yetenekleri ile tanımlanır. Bu, HSC'leri içeren hücre popülasyonlarının sinjeneik veya immün sistemi baskılanmış farelere nakledilmesiyle operasyonel olarak test edilir. Greftin boyutu ve çok soylu bileşimi daha sonra zaman içinde, genellikle akış sitometrisi ile ölçülür. Klasik olarak, HSC'leri içeren bir popülasyon, hayvanın dolaşımına enjekte edilir, daha sonra HSC'ler kemik iliğine ev sahipliği yapar, burada yerleşirler ve kan üretimine başlarlar. Alternatif olarak, HSC'ler ve/veya progenitör hücreler (HSPC'ler) doğrudan kemik iliği boşluğuna yerleştirilebilir.

Bu makale, insan HSPC'lerinin immün yetmezliği olan farelere intrafemoral enjeksiyonu için bir protokolü açıklamaktadır. Kısacası, önceden şartlandırılmış fareler uyuşturulur ve bir iğne kullanılarak dizden uyluk kemiğine küçük bir delik açılır. Daha küçük bir insülin iğnesi kullanılarak, hücreler daha sonra doğrudan ilk iğne tarafından oluşturulan aynı kanala enjekte edilir. Bu nakil yöntemi, donör hücreler olarak fare veya insan hücreleri kullanılarak çeşitli deneysel tasarımlarda uygulanabilir. En yaygın olarak ksenotransplantasyon için kullanılmıştır, çünkü bu bağlamda, intravenöz enjeksiyonlara göre daha iyi aşılama sağladığı, dolayısıyla istatistiksel gücü iyileştirdiği ve kullanılacak fare sayısını azalttığı düşünülmektedir.

Giriş

Kan, insan vücudundaki en yüksek yenilenme oranlarından birine sahiptir ve yetişkin insan kemik iliğinde günde 1 ×^{10 12} hücre üretir¹. Hematopoetik kök hücreler (HSC'ler), hematopoez süreci ile yaşam boyu kan üretimini garanti eder ve kendilerini korurken (kendini yenileme) tüm kan hücresi tiplerini üretme kapasiteleri (çok potansiyelli) ile tanımlanır. Tarihsel olarak, bir HSC'nin işlevini test etmek için altın standart her zaman transplantasyona dayanmıştır ve bir donör popülasyonunun bir farenin tüm kan soylarını uzun vadede (genellikle en az 20 hafta olarak tanımlanır) yeniden oluşturma yeteneğini test ^etmiştir2. Birkaç on yıla yayılan geniş bir fonksiyonel çalışma grubu, HSC bölmesinin hem soy çıktısında hem de uzun vadeli sulandırmada heterojen olduğunu göstermiştir. Hematopoezi incelemek için kullanılan araç seti, in vitro tek hücreli fonksiyonel tahliller, tek hücreli -omik yaklaşımlar ve soy takibi³ dahil olmak üzere birçok yeni teknikle yıllar içinde önemli ölçüde genişlemiştir. Sonuncusu, HSC ve multipotent progenitörlerin katkılarının, doğal hematopoezde ve transplantasyonun getirdiği stres altında büyük ölçüde farklılık gösterdiğini kesin olarak göstermiştir. Tüm bu teknikler, HSC'lerin uzun vadeli repopülasyon kapasitesini değerlendirmek için önemini koruyan transplantasyon testlerini tamamlar. İnsan hematopoezi çalışması bağlamında, ksenotransplantasyon, tüm organizma ortamında kendini yenilemeyi deneysel olarak değerlendirmek için tek yöntemi sağlar.

HSC'lerin ksenotransplantasyonu yaygın olarak, immün sistemi baskılanmış farelere intravenöz hücre enjeksiyonu kullanılarak gerçekleştirilir. Bununla birlikte, HSC'ler nadirdir⁴ ve HSC içeren insan örneklerine erişim sınırlıdır. 2003 yılında, John Dick grubu, kemik iliği aspirasyonu için bir protokol uyarladı ve intrafemoral olarak enjekte edilen obez olmayan diyabetik / şiddetli kombine immün yetmezlik (NOD-SCID) fareleri ile ^{Lin-CD34 +} göbek kordonu kanı (CB) hücreleri⁵. Bildiğimiz kadarıyla, uzun süreli ve seri transplantasyon sonuçlarında intravenöz ve intrafemoral enjeksiyonların resmi bir karşılaştırması bildirilmemiştir. Bununla birlikte, doğrudan intravenöz enjeksiyonlarla karşılaştırıldığında, intrafemoral enjeksiyonlar, en azından kısa vadede, aynı sayıda nakledilen hücre⁶ ile daha büyük greft boyutları sağlar. Ek olarak, nakledilen çok daha az hematopoietik kök ve progenitör hücre (HSPC) ile aşılama tespit edilebilir. Bunun nedeninin, intrafemoral doğumun, HSC'lerin kemik iliğine ev sahipliği yapma ihtiyacını atladığı düşünülmektedir, bu da ksenogreft bağlamında bir dizi reseptör ve sitokin için türler arası reaktivite eksikliği nedeniyle sınırlayıcıdır. İntrafemoral enjeksiyonların kullanılmasıyla, Notta ve meslektaşları, tek insan HSC'lerini⁷ nakleden ilk kişilerdi, ancak yöntemlerinde açıklandığı gibi ekstra hususlar alınması gerekiyor. HSPC'lerin intrafemoral doğumunun da sınırlamaları vardır. Enjeksiyonun kendisi kemik iliğinin bir kısmını bozar ve yok eder ve bu nedenle HSC'ler ile kemik iliği mikro çevresi arasındaki karışma çalışmaları için endike değildir. Ek olarak, maksimum hücre sayısı o kemik boşluğunun hacmi ile sınırlıdır ve bu, bazı uygulamalar için çok az olabilir. Her teknikte olduğu gibi, belirli bir deneydeki uygulamasının, yararlarına/dezavantajlarına ve sorulan soruya göre tartılması gerekir. Ksenotransplantasyon bağlamında, deneyin amacı, mikroçevre değerlendirmesi yapılmadan az sayıda insan HSPC'sinin aşılanmasını test etmekse, intrafemoral doğum genellikle intravenöz enjeksiyona tercih edilir.

Protokol

Burada sunulan tüm hayvan araştırmaları, 1986 tarihli Hayvanlar (Bilimsel Prosedürler) Yasası, 2012 Değişiklik Yönetmeliklerine uygundur ve Cambridge Üniversitesi Hayvan Refahı ve Etik İnceleme Kurumu (AWERB) tarafından etik inceleme ve onaydan sonra gerçekleştirilmiştir. Kadın BAŞINI BALLADI. Yaşları 12 ila 16 hafta (~ 21-30 g) arasında değişen, kurum içinde yetiştirilen ve Spesifik Patojen İçermeyen bir hayvan tesisinde tutulan Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) fareleri, intrafemoral enjeksiyonlar için kullanıldı. Tanımlanmamış CB örnekleri, Cambridgeshire Yerel Araştırma Etik Komitesi (18/EE/0199) tarafından onaylanan düzenlenmiş prosedürlere uygun olarak Cambridge Kan ve Kök Hücre Biyobankası (CBSB) tarafından bilgilendirilmiş onam alındıktan sonra sağlıklı bağışçılardan toplanmıştır.

1. Farenin hazırlanması

1. Işınlamadan önce, tanımlama için farelerin kulaklarına çentik açın ve temel ağırlık için tartın.
2. Hücrelerin transplantasyonundan yirmi dört saat önce, fareleri 2.4 Gy radyasyonla sub-letoral olarak ışınlayın.

2. Hücrelerin hazırlanması

NOT: Bu enjeksiyonlar için taze veya donmuş numunelerden hücreler kullanılabilir. Hücrelerin spesifik alt popülasyonları akış sitometrisi ile sıralanabilir. Alternatif olarak, hücreler transplantasyondan önce istenen koşullarda kültürlenebilir. Gösterilen deneyler için donmuş CB CD34 ⁺ hücreleri kullanıyoruz.

1. Tüpü manuel olarak çalkalarken, hücrenin hacminin 10 katı önceden ısıtılmış IMDM +% 50 fetal sığır serumu (FBS) + 0.1 mg / mL DNaz'ın damla damla eklenmesiyle hücreleri 50 mL'lik bir tüpte çözün. Hücreleri 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
2. Hücreleri fare başına 20-40 μL (ideal olarak 25 μL) PBS + Penisilin-Streptomisin (10 U / mL veya% 0.1) içinde yeniden süspanse edin. Mümkünse, hücreleri enjeksiyonlar için şırıngaya alırken ölü bir hacim için ekstra hücrelere izin verin. Hücreleri enjeksiyonlara kadar buz üzerinde saklayın. Enjeksiyon başına maksimum hücre sayısı 4 milyon hücredir.

3. Hayvan tesisinde intrafemoral enjeksiyon için hazırlık

1. Bu prosedür için gerekli olan aşağıdaki üç iğneyi hazırlayın:
   1. 27 G 1/2" iğne ile 3 mL'lik bir şırınga hazırlayın.
   2. Hücre süspansiyonunu içeren 29 G x 12,7 mm iğneli 0,5 mL'lik bir İnsülin Şırıngası hazırlayın.
   3. 0,1 mg/kg buprenorfin (100 μL) içeren 29 G x 0,5" iğneli 1 mL İnsülin Şırıngası hazırlayın.
2. Fareleri anestezik bir kutuda uyuşturun (izofluran% 2 (h / h) ve oksijen 2 L / dak solunması yoluyla). Fareyi bir burun konisine aktarın ve ayak parmağınızı sıkıştırarak prosedüre hazır olduğunu onaylayın. Kuruluğu önlemek için gözlere oftalmik merhem sürün.
   NOT: Bu prosedür, muhafaza seviyesi 2 biyogüvenlik başlığında gerçekleştirilir ve steril koşullar kullanılır.

4. İntrafemoral enjeksiyon

1. Fareyi sırt üstü yatırın ve arka bacağını esnetin. Başparmağınızı ayağınıza, orta parmağınızı kalçaya ve işaret parmağınızı uyluk kemiğinin dışına yerleştirerek baskın olmayan elinizi kullanarak arka bacağı sabitleyin.
2. Diz kapağının etrafındaki tüyleri nazikçe tıraş edin veya koparın ve bölgeyi silmek için alkollü bir bez kullanın.
3. 3 mL'lik şırıngayı 27 G 1/2" iğne ile kullanın ve ciltten uyluk kemiğine doğru nazikçe bir delik açmak için diz kapağının üst iç köşesini hedefleyin. İğne ilk başta ileri geri döndürülebilse de, tüm iğne kemiğe girene kadar kemiğe yalnızca bir kez saat yönünde hareket ettirin.
   NOT: Bu adımın amacı, hücre iletimi için bir kanal oluşturmaktır. (İsteğe bağlı) İğnenin kemikte doğru olup olmadığını kontrol etmek için bacağı serbest bırakın ve şırıngayı yan yana döndürün; Kemikte doğru bir şekilde ise, tüm bacak rotasyonla birlikte hareket etmelidir. Devam etmeden önce başparmağınızı ayağınıza, orta parmağınızı kalçaya ve işaret parmağını uyluk kemiğinin dışına yerleştirerek baskın olmayan eli kullanarak bacağı yeniden sabitleyin. Yanlış yerleştirilirse, iğne muhtemelen kas veya tendon içinde olacaktır, bacak şırınga ile dönmeyecektir ve iğneyi cilt altında hissedebilirsiniz.
4. Yarıya gelene kadar saat yönünün tersine çevirerek iğneyi çıkarın. Bu noktada, iğnenin etrafını silmek için alkollü bir bez kullanın (küçük bir damla kan olabilir) ve ardından iğneyi saat yönünün tersine çevirmeye devam edin ve iğneyi çıkarın.
5. Femur şaftındaki hücreleri içeren 0.5 mL insülin şırıngasını aynı kanaldan yerleştirin. İğne içeri girdikten sonra, doğru yeri gösteren bir çizik hissettiğini not edin. Bu noktada, bacaktaki tutamağı serbest bırakın, ancak iğneyi bacağından çıkarmamaya dikkat edin. Ardından, nazikçe 25 μL hücre süspansiyonunu uyluk kemiğine enjekte edin ve iğneyi çıkarın.
   NOT: Açıklanan 'çizik' pürüzlü bir yüzeye çarpmak gibidir ve iğne pürüz hissi olmadan düzgün bir şekilde girdiğini hissediyorsa, doğru yerde değildir. Çoğu kullanıcı, uygulamalarında başarılı olduklarında bunu net bir şekilde anlar.

5. Enjeksiyon sonrası bakım

1. Fareyi kafesine geri koymadan ve anesteziden iyileşme için izlemeden önce deri altına Buprenorfin (0.1 mg / kg, 100 μL) enjekte edin.
   NOT: Fare, sternal yaslanmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmamalı ve tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların yanına geri gönderilmemelidir. Farelerin intrafemoral enjeksiyona herhangi bir olumsuz etki göstermesi olası değildir; Bununla birlikte, intrafemoral enjeksiyon, ameliyat edilen bölgede aktivitenin azalmasına ve ağrıya neden olabilir.
2. İşlemi takiben diz şişmesini, ağrıyı ve hareketliliği değerlendirin.
   NOT: Fareler, enjeksiyondan sonraki 24 saat içinde normal uzuv hareketliliğini yeniden kazanmalıdır.

6. Verilerin analiz edilmesi

1. Fareleri herhangi bir zamanda servikal çıkık veya enjeksiyondan sonra onaylanmış herhangi bir yöntemle ötenazi yapın, ör., hedef arama deneyleri için 24-48 saat, kısa süreli HSC aktivitesi için 4-12 hafta, uzun süreli aşılama için >18 hafta. Periferik kan (PB) analizi planlanıyorsa, fareleri herhangi bir yetkili yöntemle kurban etmeden önce kanayın, ideal olarak 50-100 μL kan verin (toplam hacmin% 10'undan fazla değil). Arka bacak kemiklerini ve dalağı standart diseksiyon protokollerine göre çıkarın.
2. Kemik iliği için:
   1. Enjekte edilen uyluk kemiğini (IF) ve enjekte edilmeyen kemikleri (arka bacak tibiasları ve BM olarak adlandırılan enjekte edilmemiş uyluk kemikleri) ayrı tutun. Kemikleri 1 mL IMDM +% 5 FBS ve 36 G x 3/4 "iğne kullanarak yıkayın ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   2. Peleti 500 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve ardından 50 μL'yi boyama için 96 yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyusuna aktarın.
   3. Kalan kemik iliğini dondurun ve daha fazla ex vivo veya ikincil in vivo deneyler için sıvı nitrojen içinde saklayın.
3. PB için:
   1. Toplama tüpünü 100 μL PBS +% 3 FBS ile yıkayın, kanı 5 mL'lik bir FACS tüpüne aktarın ve PBS +% 3 FBS ile hacmi 2,5 mL'ye kadar tamamlayın.
   2. FACS tüplerinin dibine dikkatlice 1 mL Pancoll pipetleyin ve fren kapalıyken 500 × g'da 25 dakika santrifüjleyin.
   3. Buffy coat tabakasını toplayın, 1,5 mL'lik tüplere aktarın ve PBS +% 3 FBS ile 1,5 mL'ye kadar doldurun. 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin.
   4. Peleti 50 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve boyama için 96 yuvarlak tabanlı plakanın bir kuyusuna aktarın.
4. Dalak için:
   1. Dalağı 50 mL'lik bir tüpe yerleştirilmiş bir hücre süzgecine yerleştirin ve 3 mL'lik bir şırıngadan piston ile ezin.
   2. Bir seferde bir mililitre, hücreleri yıkamak için 5 mL IMDM +% 5 FBS ekleyin. Boyama için 96 yuvarlak tabanlı bir plakanın kuyusuna 50 μL alın.
5. Bir antikor mastermix hazırlayın; İşte 10 örnek için bir örnek:
   1. 1,5 veya 2 mL'lik bir tüpte 550 μL PBS + %3 FBS (50 μL/numune + %10 ekstra) ekleyin.
   2. Titrasyonlarına bağlı olarak nihai konsantrasyonları 2x olacak şekilde tek tek antikorlar ekleyin (örneğin, 1:100 titre edilmiş bir antikor için 11 μL ekleyin).
      NOT: İlgilenilen tüm kan soylarında potansiyel farklılaşmayı değerlendiren bir antikor paneli seçin, örneğin, CD19 / FITC, GlyA / PE, CD45 / PECy5, CD14 / PECy7, CD33 / APC, CD19 / Alexa 700, CD45 / BV510 ve CD3 / APCCy7.
6. Boyama: Boyanacak numuneleri içeren 96 yuvarlak tabanlı plakanın her bir oyuğuna 50 μL antikor mastermix ekleyin. Oda sıcaklığında 20 dakika boyayın, hücreleri yıkamak için 100 μL PBS +% 3 FBS ekleyin ve 500 × g'da 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın.
7. Peleti 200 μL PBS +% 3 FBS içinde yeniden süspanse edin ve her numuneyi bir hücre süzgeci kapağı olan bir FACS tüpünden geçirin. Kemik iliği ve dalak örneklerine 200 μL daha PBS +% 3 FBS ekleyin.
8. Akış sitometrisi kontrolleri: Bir FACS tüpüne 100 μL PBS, 1 damla pozitif boncuk, 1 damla negatif boncuk ve 1 μL antikor ekleyerek kompanzasyon boncukları kullanarak tek leke kontrolleri yapın. Oda sıcaklığında 5 dakika bekletin ve ardından 300 μL PBS ekleyin. Boyanmamış bir kontrol olarak PBS +% 3 FBS ile 400 μL'ye kadar yapılmış 50 μL boyanmamış kemik iliği hücresi alın.
9. Numuneleri akış sitometrisi ile analiz edin.
   1. Kullanılan sitometre için tavsiye edildiği gibi telafi için tek leke kontrollerini ve lekesiz çalıştırın. Kapıyı Şekil 3A'daki gibi ayarlayın.
   2. PB için tüm hücreleri çalıştırın ve kemik iliği ve dalak için, insan aşılama seviyelerine bağlı olarak numune başına en az 50.000 olay çalıştırın.

Sonuçlar

İntrafemoral olarak enjekte edilen hücrelerin aşılanması, deneysel tasarıma bağlı olarak 24 saatten itibaren herhangi bir zaman noktasında değerlendirilebilir. Bitiş zaman noktasında IF, BM, PB ve dalaklar toplanabilir. Bunlar işlenebilir ve engraftman seviyesi akış sitometrisi ile değerlendirilebilir. Düşük seviyelerde bile insan aşılamasını sağlam bir şekilde adlandırmak için, insan CD45'e (klon HI30 ve klon 2D1) karşı iki farklı antikorla boyadık. Sadece...

Tartışmalar

İntrafemoral enjeksiyonlar, sadece az sayıda HSPC'nin mevcut olduğu durumlarda ksenotransplantasyonda yararlı bir araçtır ve intravenöz enjeksiyonlara kıyasla daha iyi engraftman sağlar. Bununla birlikte, teknik el becerisi ve eğitim gerektirir. Pratik yaparken, doğru ağırlık aralığında taze kadavralar kullanmanızı (aşağıya bakınız) ve renkli bir boya (tripan mavisi gibi) enjekte etmenizi öneririz, böylece diseksiyon sırasında enjeksiyonun uyluk kemiğine giri...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169