免疫不全マウスへのヒト造血幹細胞および前駆細胞の大腿内注射

要約

大腿骨内注射は、少数の造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を骨髄腔に直接配置することにより、生着を可能にします。ここでは、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射の実験プロトコルについて説明します。

要約

造血幹細胞(HSC)は、生涯にわたってすべての血液細胞タイプを産生する能力によって定義されます。これは、HSCを含む細胞集団を同系マウスまたは免疫不全マウスに移植することにより、運用上テストされます。次に、移植片のサイズと多系統組成を、通常はフローサイトメトリーによって経時的に測定します。古典的には、HSCを含む集団が動物の循環に注入され、その後、HSCは骨髄に住み着き、そこでHSCは留まり、血液産生を開始します。あるいは、造血幹細胞および/または前駆細胞(HSPC)を骨髄腔内に直接配置することもできます。

この論文では、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射のプロトコルについて説明します。要するに、前処理されたマウスに麻酔をかけ、針を使用して膝から大腿骨に小さな穴を開けます。次に、より小さなインスリン針を使用して、最初の針によって作成されたのと同じ導管に細胞を直接注入します。この移植方法は、マウス細胞またはヒト細胞をドナー細胞として使用して、さまざまな実験デザインに適用できます。この文脈では、静脈内注射よりも生着が改善され、統計検出力が向上し、使用するマウスの数が減少すると考えられているため、異種移植に最も広く使用されています。

概要

血液は人体の中で最も高い再生率の1つであり、成人のヒト骨髄¹では1日あたり1×10¹²個の細胞が産生されます。造血幹細胞(HSC)は、造血の過程で生涯にわたって血液産生を保証し、自身を維持しながら(自己再生)すべての血液細胞タイプを生成する能力(多能性)によって定義されます。歴史的に、造血幹細胞の機能をテストするためのゴールドスタンダードは常に移植に依存しており、ドナー集団がマウスのすべての血統を長期間(一般的には最低20週間と定義)再構成する能力をテストし^{てきました2。}数十年にわたる大規模な機能的研究により、HSCコンパートメントは系統出力と長期再構成の両方で不均一であることが実証されています。造血を研究するためのツールキットは、in vitroシングルセル機能アッセイ、シングルセルオミクスアプローチ、系統追跡³など、多くの新しい技術によって、長年にわたって大幅に拡大してきました。後者は、HSCと多能性祖先の寄与が、ネイティブの造血と移植によって課せられるストレスの下で大きく異なることを決定的に示しています。これらの技術はすべて、HSCの長期的な再増殖能力を評価するために依然として重要である移植アッセイを補完します。ヒト造血の研究の文脈では、異種移植は、全生物環境での自己再生を実験....

プロトコル

ここで紹介するすべての動物研究は、1986年動物(科学的手続き)法、2012年改正規則に準拠しており、ケンブリッジ大学動物福祉倫理審査機関(AWERB)による倫理審査と承認を経て実施されました。女性はうなずく。Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) マウスを 12 週から 16 週齢 (~21-30 g) で飼育し、社内で飼育し、特異的病原体を含まない動物施設で飼育し、大腿内注射に使用しました。匿名化されたCBサンプルは、ケンブリッジシャー地方研究倫理委員会(18/EE/0199)によって承認された規制された手順に従って、ケンブリッジ血液幹細胞バイオバンク(CBSB)によるインフォームドコンセントの後、健康なドナーから収集されました。

1.マウスの準備

1. 照射前に、マウスの耳にノッチを付けて識別し、ベースライン体重の体重を量ります。
2. 細胞移植の24時間前に、マウスに2.4Gyの放射線を亜致死的に照射します。

2.細胞の調製

注:これらの注入では、新鮮または凍結サンプルから細胞を使用することができます。細胞の特定の亜集....

結果

大腿骨内に注入された細胞の生着は、実験デザインに応じて、24 時間以降の任意の時点で評価できます。終了時点では、IF、BM、PB、および脾臓を採取することができます。これらは処理でき、生着のレベルはフローサイトメトリーによって評価されます。低レベルでもヒトの生着を頑健に呼び出すために、ヒトCD45に対する2つの異なる抗体(クローンHI30とクローン2D1)?.......

ディスカッション

大腿骨内注射は、利用可能なHSPCの数が少ない異種移植において有用なツールであり、静脈内注射と比較して生着が改善されます。ただし、この技術には器用さとトレーニングが必要です。練習するときは、正しい体重範囲の新鮮な死体(下記参照)を使用し、色付きの染料(トリパンブルーなど)を注入して、解剖時に注射が大腿骨に入ったかどうかが明確になり、それ?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169