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要約

大腿骨内注射は、少数の造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)を骨髄腔に直接配置することにより、生着を可能にします。ここでは、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射の実験プロトコルについて説明します。

要約

造血幹細胞(HSC)は、生涯にわたってすべての血液細胞タイプを産生する能力によって定義されます。これは、HSCを含む細胞集団を同系マウスまたは免疫不全マウスに移植することにより、運用上テストされます。次に、移植片のサイズと多系統組成を、通常はフローサイトメトリーによって経時的に測定します。古典的には、HSCを含む集団が動物の循環に注入され、その後、HSCは骨髄に住み着き、そこでHSCは留まり、血液産生を開始します。あるいは、造血幹細胞および/または前駆細胞(HSPC)を骨髄腔内に直接配置することもできます。

この論文では、免疫不全マウスへのヒトHSPCの大腿内注射のプロトコルについて説明します。要するに、前処理されたマウスに麻酔をかけ、針を使用して膝から大腿骨に小さな穴を開けます。次に、より小さなインスリン針を使用して、最初の針によって作成されたのと同じ導管に細胞を直接注入します。この移植方法は、マウス細胞またはヒト細胞をドナー細胞として使用して、さまざまな実験デザインに適用できます。この文脈では、静脈内注射よりも生着が改善され、統計検出力が向上し、使用するマウスの数が減少すると考えられているため、異種移植に最も広く使用されています。

概要

血液は人体の中で最も高い再生率の1つであり、成人のヒト骨髄1では1日あたり1×1012個の細胞が産生されます。造血幹細胞(HSC)は、造血の過程で生涯にわたって血液産生を保証し、自身を維持しながら(自己再生)すべての血液細胞タイプを生成する能力(多能性)によって定義されます。歴史的に、造血幹細胞の機能をテストするためのゴールドスタンダードは常に移植に依存しており、ドナー集団がマウスのすべての血統を長期間(一般的には最低20週間と定義)再構成する能力をテストしてきました2。数十年にわたる大規模な機能的研究により、HSCコンパートメントは系統出力と長期再構成の両方で不均一であることが実証されています。造血を研究するためのツールキットは、in vitroシングルセル機能アッセイ、シングルセルオミクスアプローチ、系統追跡3など、多くの新しい技術によって、長年にわたって大幅に拡大してきました。後者は、HSCと多能性祖先の寄与が、ネイティブの造血と移植によって課せられるストレスの下で大きく異なることを決定的に示しています。これらの技術はすべて、HSCの長期的な再増殖能力を評価するために依然として重要である移植アッセイを補完します。ヒト造血の研究の文脈では、異種移植は、全生物環境での自己再生を実験的に評価する唯一の方法を提供します。

造血幹細胞の異種移植は、免疫不全マウスに細胞を静脈内注射して行うのが一般的です。しかし、造血幹細胞はまれであり4、造血幹細胞を含むヒト試料へのアクセスは限られています。2003 年、John Dick のグループは、骨髄吸引と大腿内注射のプロトコルを適応させました 非肥満性糖尿病/重症複合免疫不全症 (NOD-SCID) マウスに Lin-CD34+ 臍帯血 (CB) 細胞5.私たちの知る限り、長期および連続移植の結果における静脈内注射と大腿骨内注射の正式な比較は報告されていません。しかし、静脈内注射と直接比較すると、大腿内注射は、少なくとも短期的には、移植された細胞の数が同じ6でより大きな移植片サイズを提供します。さらに、移植された造血幹細胞および前駆細胞(HSPC)の数がはるかに少ない場合、生着を検出できます。これは、大腿骨内送達がHSCを骨髄に住まわせる必要性を回避するためと考えられており、異種移植片の文脈では、多くの受容体やサイトカインに対する種間反応性の欠如により制限されています。大腿内注射により、Notta氏らは初めてヒトの造血幹細胞7を移植したが、彼らの方法で説明されているように、追加の考慮が必要である。HSPCの大腿骨内分娩にも制限があります。注射自体が骨髄の一部を破壊し破壊するため、HSCとその骨髄微小環境との間のクロストークの研究には適応されません。さらに、細胞の最大数はその骨腔の体積によって制限され、アプリケーションによっては少なすぎる場合があります。すべての手法と同様に、特定の実験への適用は、利点/欠点と問われる問題に基づいて比較検討する必要があります。異種移植の文脈では、実験の目的が微小環境の評価なしに少数のヒトHSPCの生着をテストすることである場合、通常、静脈内注射よりも大腿骨内送達が好まれます。

プロトコル

ここで紹介するすべての動物研究は、1986年動物(科学的手続き)法、2012年改正規則に準拠しており、ケンブリッジ大学動物福祉倫理審査機関(AWERB)による倫理審査と承認を経て実施されました。女性はうなずく。Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) マウスを 12 週から 16 週齢 (~21-30 g) で飼育し、社内で飼育し、特異的病原体を含まない動物施設で飼育し、大腿内注射に使用しました。匿名化されたCBサンプルは、ケンブリッジシャー地方研究倫理委員会(18/EE/0199)によって承認された規制された手順に従って、ケンブリッジ血液幹細胞バイオバンク(CBSB)によるインフォームドコンセントの後、健康なドナーから収集されました。

1.マウスの準備

  1. 照射前に、マウスの耳にノッチを付けて識別し、ベースライン体重の体重を量ります。
  2. 細胞移植の24時間前に、マウスに2.4Gyの放射線を亜致死的に照射します。

2.細胞の調製

注:これらの注入では、新鮮または凍結サンプルから細胞を使用することができます。細胞の特定の亜集団は、フローサイトメトリーによって選別できます。あるいは、移植前に細胞を所望の条件で培養することもできる。示されている実験では、凍結CB CD34+ 細胞を使用しています。

  1. 50 mLチューブ内で、温めたIMDM + 50%ウシ胎児血清(FBS)+ 0.1 mg/mL DNaseの細胞容量の10倍を滴下し、チューブを手動で撹拌しながら細胞を解凍します。細胞を500 × g で5分間遠心分離します。
  2. マウスあたり20-40 μL(理想的には25 μL)のPBS + ペニシリン-ストレプトマイシン(10 U/mLまたは0.1%)に細胞を再懸濁します。可能であれば、細胞を注射用のシリンジに取り込むときに、デッドボリュームのために余分な細胞を許可します。注射まで細胞を氷上に保存します。注入あたりの最大細胞数は400万細胞です。

3. 動物施設での大腿骨内注射の準備

  1. この手順に必要な次の3本の針を準備します。
    1. 27 G 1/2 インチの針で 3 mL のシリンジを準備します。
    2. 細胞懸濁液を含む29 G x 12.7 mmの針で0.5 mLのインスリンシリンジを準備します。
    3. 0.1 mg / kgブプレノルフィン(100 μL)を含む29 G x 0.5インチ針で1 mLインスリンシリンジを準備します。.
  2. 麻酔ボックス内でマウスに麻酔をかけます (イソフルラン 2% (v/v) と酸素 2 L/min の吸入による)。マウスをノーズコーンに移し、つま先をつまんで手順の準備ができていることを確認します。眼科用軟膏を目に塗布して乾燥を防ぎます。
    注:この手順は、封じ込めレベル2のバイオセーフティフードで実施され、無菌状態が使用されます。

4. 大腿骨内注射

  1. マウスを仰向けに置き、後ろ足を曲げます。親指を足に、中指を腰に、人差し指を大腿骨の外側に置いて、利き手ではない手で後ろ足を固定します。
  2. 膝蓋骨の周りの髪をやさしく剃るか抜いて、アルコール綿棒を使ってその部分を拭きます。
  3. 27 G 1/2 インチの針が付いた 3 mL シリンジを使用し、膝蓋骨の上部内側の角を目指して、大腿骨に向かって皮膚にそっと穴を開けます。針は最初は前後に回転させることができますが、針全体が骨に入るまで、骨に一度だけ時計回りに動かしてください。
    注:このステップの目標は、細胞送達用の導管を生成することです。(オプション)針が骨に正しく入っているかどうかを確認するには、脚を放し、シリンジを左右に回転させます。それが骨に正しくある場合、脚全体が回転とともに動くはずです。親指を足に、中指を腰に、人差し指を大腿骨の外側に置いて、利き手ではない手で脚を固定し直してから、続行します。誤って挿入すると、針が筋肉や腱にある可能性が高く、脚が注射器と一緒に回転せず、針が皮膚の下に感じられる場合があります。
  4. 針が半分出るまで反時計回りに回転させて針を取り外します。この時点で、アルコール綿棒を使用して針の周りを拭き(血液が少し滴落ちる場合があります)、針を反時計回りに回し続けて針を取り外します。
  5. 同じ導管を介して大腿骨シャフトの細胞を含む0.5 mLインスリン注射器を挿入します。.針が挿入されたら、正しい位置を示す引っかき傷を感じることを書き留めてください。このとき、脚のグリップを緩めますが、針を脚から外さないように注意してください。次に、25μLの細胞懸濁液を大腿骨に穏やかに注入し、針を抜く。
    注:説明されている「引っかき傷」は、ざらざらした表面を打つようなものであり、針がざらざらせずにスムーズに入ったと感じた場合は、正しい場所にありません。ほとんどのユーザーは、自分の診療で成功すると、これを明確に理解します。

5. 注射後のケア

  1. マウスにブプレノルフィン(0.1 mg / kg、100 μL)を皮下注射してから、マウスをケージに戻し、麻酔薬からの回復を監視します。.
    注:マウスは、胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで放置せず、完全に回復するまで他の動物の会社に戻さないでください。マウスが大腿内注射に悪影響を示す可能性は低いです。ただし、大腿骨内注射は、手術部位の活動や痛みの低下を引き起こす可能性があります。
  2. 手技後のホックの腫れ、痛み、可動性を評価します。
    注:マウスは、注射後24時間以内に正常な四肢の可動性を取り戻す必要があります。

6. データの分析

  1. 子宮頸部脱臼または任意の承認された方法、例えば、ホーミング実験の場合は24〜48時間、短期のHSC活性の場合は4〜12週間、長期の生着の場合は>18週間など、注射後に任意の方法でマウスを安楽死させます。末梢血(PB)の分析を計画している場合は、許可された方法で犠牲になる前にマウスを出血させ、理想的には50〜100μLの血液(総量の10%以下)を生成します。標準的な解剖プロトコルに従って、後脚の骨と脾臓を切除します。
  2. 骨髄の場合:
    1. 注入された大腿骨(IF)と注入されなかった骨(後脚の脛骨と注入されていない大腿骨、BMと呼ばれる)を別々に保管してください。1 mLのIMDM + 5%FBSと36 G x 3/4インチの針を使用して骨を洗い流し、500 × gで5分間遠心分離します。
    2. ペレットを500μLのPBS + 3%FBSに再懸濁し、次に50μLを96丸底プレートのウェルに移して染色します。
    3. 残っている骨髄を凍結し、液体窒素で保存して、さらに ex vivo または二次 的なin vivo 実験を行います。
  3. PBの場合:
    1. 100 μL の PBS + 3% FBS でコレクション チューブを洗い流し、血液を 5 mL の FACS チューブに移し、PBS + 3% FBS で容量を 2.5 mL にします。
    2. 1mLのPancollをFACSチューブの底に慎重にピペットで移し、ブレーキをオフにした状態で500× g で25分間遠心分離します。
    3. バフィーコート層を採取し、1.5mLチューブに移し、PBS+3%FBSを1.5mLまで補充します。500 × gで5分間遠心分離します。
    4. ペレットを50 μLのPBS + 3% FBSに再懸濁し、染色のために96丸底プレートのウェルに移します。
  4. 脾臓の場合:
    1. 50 mLチューブに載せたセルストレーナーに脾臓を入れ、3 mLシリンジのプランジャーで粉砕します。
    2. 一度に1ミリリットルずつ、5 mLのIMDM + 5% FBSを加えて細胞を洗い流します。染色のために96丸底プレートのウェルに50μLを取ります。
  5. 抗体マスターミックスを調製します。10 個のサンプルの例を次に示します。
    1. 550 μL の PBS + 3% FBS (50 μL/サンプルあたり + 10% 追加) を 1.5 mL または 2 mL チューブに分注します。
    2. 滴定に基づいて最終濃度が2倍になるように、個々の抗体を添加します(例:1:100の滴定抗体の場合、11 μLを添加します)。
      注:関心のあるすべての血液系統(CD19 / FITC、GlyA / PE、CD45 / PECy5、CD14 / PECy7、CD33 / APC、CD19 / Alexa 700、CD45 / BV510、CD3 / APCCy7など)にわたる潜在的な分化を評価する抗体パネルを選択します。
  6. 染色:染色するサンプルを含む96丸底プレートの各ウェルに50 μLの抗体マスターミックスを加えます。室温で20分間染色し、PBS+3%FBSを100μL加えて細胞を洗浄し、500 × gで5分間遠心分離します。上清を取り除きます。
  7. ペレットを200μLのPBS + 3% FBSに再懸濁し、各サンプルをセルストレーナーキャップ付きのFACSチューブに通します。骨髄および脾臓サンプルに、さらに200 μLのPBS + 3% FBSを加えます。
  8. フローサイトメトリーコントロール:100 μLのPBS、1滴のポジティブビーズ、1滴のネガティブビーズ、および1 μLの抗体をFACSチューブに添加することにより、コンペンセーションビーズを使用してシングルステインコントロールを作成します。室温で5分間放置した後、PBSを300μL加えます。未染色コントロールとして、PBS + 3% FBSで最大400 μLまで調製した未染色の骨髄細胞50 μLを採取します。
  9. フローサイトメトリーでサンプルを解析します。
    1. シングルステインコントロールを実行し、使用するサイトメーターに推奨されているように、未染色でコンペンセーションします。 図 3A のようにゲートを設定します。
    2. PBの場合はすべての細胞を実行し、骨髄と脾臓の場合は、ヒトの生着レベルに応じて、サンプルあたり最低50,000イベントを実行します。

結果

大腿骨内に注入された細胞の生着は、実験デザインに応じて、24 時間以降の任意の時点で評価できます。終了時点では、IF、BM、PB、および脾臓を採取することができます。これらは処理でき、生着のレベルはフローサイトメトリーによって評価されます。低レベルでもヒトの生着を頑健に呼び出すために、ヒトCD45に対する2つの異なる抗体(クローンHI30とクローン2D1)?...

ディスカッション

大腿骨内注射は、利用可能なHSPCの数が少ない異種移植において有用なツールであり、静脈内注射と比較して生着が改善されます。ただし、この技術には器用さとトレーニングが必要です。練習するときは、正しい体重範囲の新鮮な死体(下記参照)を使用し、色付きの染料(トリパンブルーなど)を注入して、解剖時に注射が大腿骨に入ったかどうかが明確になり、それ?...

開示事項

著者は、利益相反を宣言しません。

謝辞

著者らは、この方法に関する以前の研究についてJohn Dick博士のグループを、トレーニングについてMonica Doedensのグループに感謝します。私たちは、ケンブリッジ血液幹細胞バイオバンク(CBSB)、特にジョアンナ・バクスター博士とCBSBの看護師チームが同意し、臍帯血サンプルを収集してくれたことに感謝しています。私たちのサンプルドナー。大学生物医学サービス、特にニコラス・ラムリーとアン・マクラーレン・ビルディングのスタッフは、マウス系統のメンテナンスと in vivo 実験のサポートを担当しています。原稿の編集のためのShaaezmeen Basheer。

E.L.は、ウェルカム・トラストと王立協会(107630/Z/15/A)が共同で資金提供するサー・ヘンリー・デール・フェローシップから資金提供を受けています。L.M.は、Sofinter - HR Welfare Programの支援を受けています。この研究は、ウェルカムトラスト(203151/Z/16/Z、203151/A/16/Z、215116/Z/18/Z)およびUKRI医学研究評議会(MC_PC_17230)によって全体または一部が資金提供されました。オープンアクセスの目的で、著者は、この提出物から生じる著者受理原稿バージョンにCC BY公開著作権ライセンスを適用しています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm NeedleBD324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" NeedleBD324827
1.5 mL tubeFisherbrand509-GRD-PFB
3 mL syringe HENKE SASS WOLF GMBH4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mmFalcon352235FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mmFalcon352058FACS tube
27 G 1/2" needle BD 300635
40 µm cell strainer for 50 mL tubeGreiner Bio-one542040
50 mL tubeSarstedt Ltd62.547.254
96 well round-bottom plate Falcon351177
Alcohol SwabVITREX MEDICAL A/S520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer BDflow cytometer
BuphrenorphineAnimalcareXVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)biolegend301814Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)biolegend302226Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)biolegend302206Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)biolegend300318Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)BD345800Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)biolegend304036Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)biolegend368526Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles SetBD552843
Dnase 1Worthington BiochemicalLS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)PAN-BiotechP40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)BD340947Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)PAN-BiotechP04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)Zoetis115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µLSarstedt Ltd20.1309Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice Charles River 
Pancoll human, Density: 1.077 g/mLPAN-BiotechP04-60500
Penicillin-Streptomycin Gibco15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)Gibco14190169

参考文献

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