Injection intrafémorale de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques humaines chez des souris immunodéprimées

Résumé

Les injections intrafémorales permettent la greffe d’un petit nombre de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC), en plaçant les cellules directement dans la cavité de la moelle osseuse. Nous décrivons ici un protocole expérimental d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes.

Résumé

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines tout au long de leur vie. Ceci est testé opérationnellement en transplantant des populations cellulaires contenant des CSH dans des souris syngéniques ou immunodéprimées. La taille et la composition multilignage du greffon sont ensuite mesurées au fil du temps, généralement par cytométrie en flux. Classiquement, une population contenant des CSH est injectée dans la circulation de l’animal, après quoi les CSH abritent la moelle osseuse, où elles se logent et commencent la production de sang. Alternativement, les CSH et/ou les cellules progénitrices (HSPC) peuvent être placées directement dans la cavité de la moelle osseuse.

Cet article décrit un protocole d’injection intrafémorale de HSPC humaines chez des souris immunodéficientes. En bref, les souris préconditionnées sont anesthésiées et un petit trou est percé à travers le genou dans le fémur à l’aide d’une aiguille. À l’aide d’une aiguille à insuline plus petite, les cellules sont ensuite injectées directement dans le même conduit créé par la première aiguille. Cette méthode de transplantation peut être appliquée dans des conceptions expérimentales variées, en utilisant des cellules de souris ou humaines comme cellules donneuses. Il a été le plus largement utilisé pour la xénotransplantation, car dans ce contexte, on pense qu’il permet une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses, améliorant ainsi la puissance statistique et réduisant le nombre de souris à utiliser.

Introduction

Le sang a l’un des taux de régénération les plus élevés du corps humain, produisant 1 ×^{10 12} cellules par jour dans la moelle osseuse humaine adulte¹. Les cellules souches hématopoïétiques (CSH) garantissent la production de sang tout au long de la vie par le processus d’hématopoïèse et sont définies par leur capacité à produire tous les types de cellules sanguines (multipotentialité) tout en se maintenant (auto-renouvellement). Historiquement, l’étalon-or pour tester la fonction d’une CSH a toujours reposé sur la transplantation, testant la capacité d’une population de donneurs à reconstituer toutes....

Protocole

Toutes les recherches sur les animaux présentées ici sont conformes au règlement d’amendement de 2012 de la loi de 1986 sur les animaux (procédures scientifiques) et ont été effectuées après examen éthique et approbation par l’organisme d’examen et d’examen éthique des animaux de l’Université de Cambridge (AWERB). Hochement de tête féminin. Des souris Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), âgées de 12 à 16 semaines (~21-30 g), élevées en interne et maintenues dans une animalerie exempte d’agents pathogènes spécifiques, ont été utilisées pour des injections intrafémorales. Des échantillons de CB anonymisés ont été pré....

Discussion

Les injections intrafémorales sont un outil utile dans la xénotransplantation lorsque seul un petit nombre de HSPC sont disponibles, offrant une meilleure prise de greffe par rapport aux injections intraveineuses. Cependant, la technique demande de la dextérité et de l’entraînement. Lors de la pratique, nous recommandons d’utiliser des cadavres frais de la bonne gamme de poids (voir ci-dessous) et d’injecter un colorant coloré (comme le bleu trypan) afin qu’après la dissec.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169