Iniezione intrafemorale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane in topi immunocompromessi

Riepilogo

Le iniezioni intrafemorali consentono l'attecchimento di un piccolo numero di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), posizionando le cellule direttamente nella cavità del midollo osseo. Qui descriviamo un protocollo sperimentale di iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono definite dalla loro capacità di produrre tutti i tipi di cellule del sangue per tutta la vita. Questo viene testato operativamente trapiantando popolazioni cellulari contenenti HSC in topi singenici o immunocompromessi. Le dimensioni e la composizione multilineage dell'innesto vengono quindi misurate nel tempo, solitamente mediante citometria a flusso. Classicamente, una popolazione contenente HSC viene iniettata nella circolazione dell'animale, dopodiché le HSC ospitano il midollo osseo, dove si depositano e iniziano la produzione di sangue. In alternativa, le HSC e/o le cellule progenitrici (HSPC) possono essere posizionate direttamente nella cavità del midollo osseo.

Questo articolo descrive un protocollo per l'iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti. In breve, i topi precondizionati vengono anestetizzati e viene praticato un piccolo foro attraverso il ginocchio nel femore usando un ago. Utilizzando un ago da insulina più piccolo, le cellule vengono quindi iniettate direttamente nello stesso condotto creato dal primo ago. Questo metodo di trapianto può essere applicato in vari disegni sperimentali, utilizzando cellule di topo o umane come cellule donatrici. È stato ampiamente utilizzato per lo xenotrapianto, perché in questo contesto si ritiene che fornisca un migliore attecchimento rispetto alle iniezioni endovenose, migliorando così la potenza statistica e riducendo il numero di topi da utilizzare.

Introduzione

Il sangue ha uno dei più alti tassi di rigenerazione nel corpo umano, producendo 1 × 10¹² cellule al giorno nel midollo osseo umano adulto¹. Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) garantiscono la produzione di sangue per tutta la durata della vita attraverso il processo di emopoiesi e sono definite dalla loro capacità di produrre tutti i tipi di cellule del sangue (multipotenzialità) mantenendosi (autorinnovamento). Storicamente, il gold standard per testare la funzione di una HSC si è sempre basato sul trapianto, testando la capacità di una popolazione di donatori di ricostituire tutte le linee d....

Protocollo

Tutta la ricerca sugli animali qui presentata aderisce all'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012 ed è stata eseguita dopo la revisione etica e l'approvazione da parte dell'Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) dell'Università di Cambridge. Femmina NOD. I topi Cg-Prkdc^{scid Il2rgtm1Wjl}/SzJ (NSG), di età compresa tra 12 e 16 settimane (~21-30 g), allevati internamente e mantenuti in una struttura per animali priva di patogeni specifici, sono stati utilizzati per iniezioni intrafemorali. I campioni di CB anonimizzati sono stati raccolti da donatori sani dopo il consenso informat....

Discussione

Le iniezioni intrafemorali sono uno strumento utile nello xenotrapianto quando è disponibile solo un piccolo numero di HSPC, fornendo un attecchimento migliore rispetto alle iniezioni endovenose. Tuttavia, la tecnica richiede destrezza e allenamento. Durante la pratica, si consiglia di utilizzare cadaveri freschi dell'intervallo di peso corretto (vedi sotto) e di iniettare un colorante colorato (come il blu di tripano) in modo che, al momento della dissezione, sia chiaro se l'iniezione .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169