Iniezione intrafemorale di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane in topi immunocompromessi

Riepilogo

Le iniezioni intrafemorali consentono l'attecchimento di un piccolo numero di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC), posizionando le cellule direttamente nella cavità del midollo osseo. Qui descriviamo un protocollo sperimentale di iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti.

Abstract

Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sono definite dalla loro capacità di produrre tutti i tipi di cellule del sangue per tutta la vita. Questo viene testato operativamente trapiantando popolazioni cellulari contenenti HSC in topi singenici o immunocompromessi. Le dimensioni e la composizione multilineage dell'innesto vengono quindi misurate nel tempo, solitamente mediante citometria a flusso. Classicamente, una popolazione contenente HSC viene iniettata nella circolazione dell'animale, dopodiché le HSC ospitano il midollo osseo, dove si depositano e iniziano la produzione di sangue. In alternativa, le HSC e/o le cellule progenitrici (HSPC) possono essere posizionate direttamente nella cavità del midollo osseo.

Questo articolo descrive un protocollo per l'iniezione intrafemorale di HSPC umane in topi immunodeficienti. In breve, i topi precondizionati vengono anestetizzati e viene praticato un piccolo foro attraverso il ginocchio nel femore usando un ago. Utilizzando un ago da insulina più piccolo, le cellule vengono quindi iniettate direttamente nello stesso condotto creato dal primo ago. Questo metodo di trapianto può essere applicato in vari disegni sperimentali, utilizzando cellule di topo o umane come cellule donatrici. È stato ampiamente utilizzato per lo xenotrapianto, perché in questo contesto si ritiene che fornisca un migliore attecchimento rispetto alle iniezioni endovenose, migliorando così la potenza statistica e riducendo il numero di topi da utilizzare.

Introduzione

Il sangue ha uno dei più alti tassi di rigenerazione nel corpo umano, producendo 1 × 10¹² cellule al giorno nel midollo osseo umano adulto¹. Le cellule staminali ematopoietiche (HSC) garantiscono la produzione di sangue per tutta la durata della vita attraverso il processo di emopoiesi e sono definite dalla loro capacità di produrre tutti i tipi di cellule del sangue (multipotenzialità) mantenendosi (autorinnovamento). Storicamente, il gold standard per testare la funzione di una HSC si è sempre basato sul trapianto, testando la capacità di una popolazione di donatori di ricostituire tutte le linee di sangue di un topo a lungo termine (comunemente definito come un minimo di 20 settimane)². Un ampio corpus di lavori funzionali che abbracciano diversi decenni ha dimostrato che il compartimento HSC è eterogeneo sia nell'output di linea che nella ricostituzione a lungo termine. Il kit di strumenti per studiare l'emopoiesi si è ampliato notevolmente nel corso degli anni, con molte nuove tecniche, tra cui saggi funzionali in vitro su singola cellula, approcci -omici su singola cellula e tracciamento del lignaggio³. Questi ultimi hanno dimostrato in modo conclusivo che i contributi delle HSC e dei progenitori multipotenti differiscono in gran parte nell'emopoiesi nativa e sotto lo stress imposto dal trapianto. Tutte queste tecniche completano i test di trapianto, che rimangono importanti per valutare la capacità di ripopolamento a lungo termine delle HSC. Nel contesto dello studio dell'emopoiesi umana, lo xenotrapianto fornisce l'unico metodo per valutare sperimentalmente l'auto-rinnovamento in un contesto di intero organismo.

Lo xenotrapianto di HSC viene comunemente eseguito utilizzando l'iniezione endovenosa di cellule in topi immunocompromessi. Tuttavia, le HSC sono rare⁴ e l'accesso ai campioni umani contenenti HSC è limitato. Nel 2003, il gruppo di John Dick ha adattato un protocollo per l'aspirazione del midollo osseo e ha iniettato per via intrafemorale topi diabetici/immunodeficienza combinata grave (NOD-SCID) con cellule del sangue del cordone ombelicale (CB) ^{Lin-CD34+ 5}. Per quanto ne sappiamo, non è stato riportato alcun confronto formale tra iniezioni endovenose e intrafemorali negli esiti di trapianto a lungo termine e seriali. Tuttavia, rispetto alle iniezioni endovenose, le iniezioni intrafemorali forniscono innesti di dimensioni maggiori con lo stesso numero di cellule trapiantate⁶, almeno a breve termine. Inoltre, l'attecchimento può essere rilevato con un numero molto inferiore di cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) trapiantate. Si ritiene che ciò sia dovuto al fatto che la somministrazione intrafemorale bypassa la necessità di ospitare le HSC nel midollo osseo, che nel contesto degli xenotrapianti è limitante a causa della mancanza di reattività cross-species per un certo numero di recettori e citochine. Attraverso l'uso di iniezioni intrafemorali, Notta e colleghi sono stati i primi a trapiantare singole HSC^{umane 7}, anche se è necessario prendere ulteriori considerazioni, come descritto nei loro metodi. Anche la somministrazione intrafemorale di HSPC presenta dei limiti. L'iniezione stessa interrompe e distrugge parte del midollo osseo e quindi non è indicata per gli studi sul crosstalk tra le HSC e il loro microambiente midollare. Inoltre, il numero massimo di cellule è limitato dal volume di quella cavità ossea e questo potrebbe essere troppo poco per alcune applicazioni. Come per ogni tecnica, la sua applicazione in un esperimento specifico deve essere ponderata in base ai benefici/svantaggi e alla domanda che ci si pone . Nel contesto dello xenotrapianto, se lo scopo dell'esperimento è testare l'attecchimento di un basso numero di HSPC umane senza alcuna valutazione del microambiente, la somministrazione intrafemorale è solitamente preferita all'iniezione endovenosa.

Protocollo

Tutta la ricerca sugli animali qui presentata aderisce all'Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012 ed è stata eseguita dopo la revisione etica e l'approvazione da parte dell'Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) dell'Università di Cambridge. Femmina NOD. I topi Cg-Prkdc^{scid Il2rgtm1Wjl}/SzJ (NSG), di età compresa tra 12 e 16 settimane (~21-30 g), allevati internamente e mantenuti in una struttura per animali priva di patogeni specifici, sono stati utilizzati per iniezioni intrafemorali. I campioni di CB anonimizzati sono stati raccolti da donatori sani dopo il consenso informato della Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB) in conformità con le procedure regolamentate approvate dal Cambridgeshire Local Research Ethics Committee (18/EE/0199).

1. Preparazione del mouse

1. Prima dell'irradiazione, incidere le orecchie dei topi per l'identificazione e pesarle per il peso basale.
2. Ventiquattro ore prima del trapianto delle cellule, irradiare sub-letale i topi con radiazioni da 2,4 Gy.

2. Preparazione delle cellule

NOTA: Per queste iniezioni, le cellule possono essere utilizzate da campioni freschi o congelati. Specifiche sottopopolazioni di cellule possono essere ordinate mediante citometria a flusso. In alternativa, le cellule possono essere coltivate nelle condizioni desiderate prima del trapianto. Per gli esperimenti mostrati, stiamo utilizzando cellule CB CD34⁺ congelate.

1. Scongelare le cellule in una provetta da 50 mL con l'aggiunta goccia a goccia di 10 volte il volume della cellula di IMDM preriscaldato + 50% di siero fetale bovino (FBS) + 0,1 mg/mL di DNasi agitando manualmente la provetta. Centrifugare le celle a 500 × g per 5 min.
2. Risospendere le cellule in 20-40 μL (idealmente 25 μL) di PBS + Penicillina-Streptomicina (10 U/mL o 0,1%) per topo. Se possibile, lasciare che le cellule in eccesso abbiano un volume morto quando si aspirano le cellule nella siringa per le iniezioni. Conservare le cellule in ghiaccio fino alle iniezioni. Il numero massimo di cellule per iniezione è di 4 milioni di cellule.

3. Preparazione per l'iniezione intrafemorale nella struttura per animali

1. Preparare i seguenti tre aghi necessari per questa procedura:
   1. Preparare una siringa da 3 ml con un ago da 27 G 1/2".
   2. Preparare una siringa da insulina da 0,5 ml con ago da 29 G x 12,7 mm contenente la sospensione cellulare.
   3. Preparare una siringa da insulina da 1 ml con ago da 29 g x 0,5" con 0,1 mg/kg di buprenorfina (100 μl).
2. Anestetizzare i topi in una scatola di anestesia (attraverso l'inalazione di isoflurano 2% (v/v) e ossigeno 2 L/min). Trasferisci il mouse su un cono e conferma la sua prontezza per la procedura pizzicando le dita dei piedi. Applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza.
   NOTA: Questa procedura viene eseguita in una cappa di biosicurezza di livello 2 di contenimento e vengono utilizzate condizioni sterili.

4. Iniezione intrafemorale

1. Appoggia il topo sulla schiena e piega la zampa posteriore. Fissare la zampa posteriore usando la mano non dominante posizionando il pollice sul piede, il medio sull'anca e l'indice all'esterno del femore.
2. Radersi delicatamente o strappare i peli intorno alla rotula e utilizzare un tampone imbevuto di alcol per pulire l'area.
3. Utilizzare la siringa da 3 ml con un ago da 27 G 1/2" e puntare verso l'angolo interno superiore della rotula per praticare delicatamente un foro attraverso la pelle verso il femore. Sebbene all'inizio l'ago possa essere ruotato avanti e indietro, utilizzare un movimento in senso orario solo una volta nell'osso, fino a quando l'intero ago non si trova nell'osso.
   NOTA: L'obiettivo di questo passaggio è generare un condotto per l'erogazione delle celle. (Facoltativo) Per verificare se l'ago è correttamente nell'osso, rilasciare la gamba e ruotare la siringa da un lato all'altro; Se è correttamente nell'osso, l'intera gamba dovrebbe muoversi con la rotazione. Fissare nuovamente la gamba utilizzando la mano non dominante posizionando il pollice sul piede, il medio sull'anca e l'indice all'esterno del femore, prima di continuare. Se inserito in modo errato, l'ago sarà probabilmente nel muscolo o nel tendine, la gamba non ruoterà con la siringa e potresti sentire l'ago sotto la pelle.
4. Rimuovere l'ago ruotandolo in senso antiorario fino a metà corsa. A questo punto, usa un tampone imbevuto di alcol per pulire intorno all'ago (potrebbe esserci una piccola goccia di sangue) e poi continua a girare l'ago in senso antiorario e rimuovi l'ago.
5. Inserire la siringa da insulina da 0,5 ml contenente le cellule nello sfizio femorale attraverso lo stesso condotto. Una volta inserito l'ago, prendi nota di sentire un graffio indicando la posizione corretta. A questo punto, rilascia la presa sulla gamba, ma fai attenzione a non rimuovere l'ago dalla gamba. Quindi, delicatamente, iniettare i 25 μL di sospensione cellulare nel femore e rimuovere l'ago.
   NOTA: Il "graffio" descritto è come colpire una superficie ruvida e se l'ago sente di essere entrato senza intoppi senza alcuna sensazione ruvida, non è nel posto corretto. La maggior parte degli utenti lo capisce chiaramente una volta che ha successo nella propria pratica.

5. Cura post-iniezione

1. Iniettare nel topo per via sottocutanea Buprenorfina (0,1 mg/kg, 100 μL) prima di rimetterlo nella gabbia e monitorare il recupero dall'anestetico.
   NOTA: Il topo non deve essere lasciato incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubita sternale e non viene restituito alla compagnia di altri animali fino a quando non si è completamente ripreso. È improbabile che i topi mostrino effetti avversi all'iniezione intrafemorale; Tuttavia, l'iniezione intrafemorale può causare una riduzione dell'attività e dolore nell'area operata.
2. Valutare il gonfiore del garretto, il dolore e la mobilità dopo la procedura.
   NOTA: I topi dovrebbero riacquistare la normale mobilità degli arti entro 24 ore dall'iniezione.

6. Analisi dei dati

1. Eutanasia dei topi mediante lussazione cervicale o qualsiasi metodo approvato dopo l'iniezione in qualsiasi momento, ad esempio 24-48 ore per esperimenti di homing, 4-12 settimane per l'attività HSC a breve termine, >18 settimane per l'attecchimento a lungo termine. Se è prevista l'analisi del sangue periferico (PB), dissanguare i topi prima del sacrificio con qualsiasi metodo autorizzato, producendo idealmente 50-100 μL di sangue (non più del 10% del volume totale). Rimuovere le ossa della gamba posteriore e la milza secondo i protocolli di dissezione standard.
2. Per il midollo osseo:
   1. Tenere separati il femore iniettato (IF) e le ossa non iniettate (tibie della zampa posteriore e femori non iniettati, denominati BM). Sciacquare le ossa utilizzando 1 mL di IMDM + 5% FBS e un ago da 36 G x 3/4" e centrifugare per 5 minuti a 500 × g.
   2. Risospendere il pellet in 500 μl di PBS + 3% FBS e quindi trasferire 50 μl in un pozzetto di una piastra a fondo tondo 96 per la colorazione.
   3. Congelare il midollo osseo rimanente e conservarlo in azoto liquido per ulteriori esperimenti ex vivo o secondari in vivo .
3. Per il PB:
   1. Lavare la provetta di raccolta con 100 μL di PBS + 3% FBS, trasferire il sangue in una provetta FACS da 5 mL e portare il volume a 2,5 mL con PBS + 3% FBS.
   2. Pipettare con cautela 1 mL di Pancoll sul fondo delle provette FACS e centrifugare per 25 minuti a 500 × g senza freno.
   3. Raccogliere lo strato di buffy coat, trasferirlo in provette da 1,5 mL e rabboccare fino a 1,5 mL con PBS + 3% FBS. Centrifugare per 5 min a 500 × g.
   4. Risospendere il pellet in 50 μL di PBS + 3% FBS e trasferire in un pozzetto di una piastra a fondo tondo 96 per la colorazione.
4. Per la milza:
   1. Mettere la milza in un colino cellulare posto su una provetta da 50 ml e frantumare con lo stantuffo di una siringa da 3 ml.
   2. Un millilitro alla volta, aggiungere 5 ml di IMDM + 5% FBS per lavare le cellule. Portare 50 μl in un pozzetto di una piastra a fondo rotondo 96 per la colorazione.
5. Preparare un mastermix di anticorpi; Di seguito è riportato un esempio per 10 campioni:
   1. Aliquotare 550 μL di PBS + 3% FBS (50 μL/campione + 10% extra) in una provetta da 1,5 o 2 mL.
   2. Aggiungere i singoli anticorpi in modo che la loro concentrazione finale sia 2x in base alla loro titolazione (ad esempio, per un anticorpo titolato 1:100, aggiungere 11 μl).
      NOTA: Scegliere un pannello di anticorpi che valuti la potenziale differenziazione in tutte le linee di sangue di interesse, ad esempio CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 e CD3/APCCy7.
6. Colorazione: aggiungere 50 μL di mastermix di anticorpi a ciascuno dei pozzetti della piastra a fondo tondo 96 contenente i campioni da colorare. Colorare per 20 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 100 μL di PBS + 3% FBS per lavare le celle e centrifugare per 5 minuti a 500 × g. Rimuovere il surnatante.
7. Risospendere il pellet in 200 μL di PBS + 3% FBS e far passare ogni campione attraverso una provetta FACS con un tappo filtrante per cellule. Ai campioni di midollo osseo e milza, aggiungere altri 200 μL di PBS + 3% FBS.
8. Controlli della citometria a flusso: Effettuare controlli a colorazione singola utilizzando le microsfere di compensazione aggiungendo 100 μl di PBS, 1 goccia di microsfere positive, 1 goccia di microsfere negative e 1 μl di anticorpo a una provetta FACS. Lasciare agire per 5 minuti a temperatura ambiente e poi aggiungere 300 μL di PBS. Prelevare 50 μL di cellule del midollo osseo non colorate fino a 400 μL con PBS + 3% FBS come controllo non colorato.
9. Analizzare i campioni mediante citometria a flusso.
   1. Eseguire controlli a colorazione singola e non colorare per la compensazione come consigliato per il citometro utilizzato. Impostare il gating come nella Figura 3A.
   2. Per il PB, eseguire l'analisi di tutte le cellule e per il midollo osseo e la milza, eseguire un minimo di 50.000 eventi per campione a seconda dei livelli di attecchimento umano.

Risultati

L'attecchimento delle cellule iniettate per via intrafemorale può essere valutato in qualsiasi momento a partire da 24 ore a seconda del disegno sperimentale. Al momento finale, possono essere raccolti IF, BM, PB e milza. Questi possono essere elaborati e il livello di attecchimento valutato tramite citometria a flusso. Per definire in modo robusto l'attecchimento umano anche a bassi livelli, abbiamo colorato con due anticorpi distinti contro il CD45 umano (clone HI30 e clone 2D1). Solo...

Discussione

Le iniezioni intrafemorali sono uno strumento utile nello xenotrapianto quando è disponibile solo un piccolo numero di HSPC, fornendo un attecchimento migliore rispetto alle iniezioni endovenose. Tuttavia, la tecnica richiede destrezza e allenamento. Durante la pratica, si consiglia di utilizzare cadaveri freschi dell'intervallo di peso corretto (vedi sotto) e di iniettare un colorante colorato (come il blu di tripano) in modo che, al momento della dissezione, sia chiaro se l'iniezione ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169