Внутрибедренная инъекция гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников человека мышам с ослабленным иммунитетом

Резюме

Внутрибедренные инъекции позволяют приживить небольшое количество гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСК) путем размещения клеток непосредственно в полости костного мозга. В данной статье мы описываем экспериментальный протокол внутрибедренного введения человеческих ГСКС иммунодефицитным мышам.

Аннотация

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) определяются их пожизненной способностью производить все типы клеток крови. Это было проверено на практике путем трансплантации клеточных популяций, содержащих ГСК, сингенным или иммунокомпрометированным мышам. Затем размер и многолинейный состав трансплантата измеряют с течением времени, обычно с помощью проточной цитометрии. Классически популяция, содержащая ГСК, вводится в кровоток животного, после чего ГСК попадают в костный мозг, где они оседают и начинают кровепродукцию. В качестве альтернативы, ГСК и/или клетки-предшественники (ГСК) могут быть размещены непосредственно в полости костного мозга.

В данной статье описан протокол внутрибедренной инъекции человеческих ГСКК иммунодефицитным мышам. Короче говоря, предварительно подготовленных мышей обезболивают, и с помощью иглы просверливают небольшое отверстие через колено в бедренной кости. С помощью инсулиновой иглы меньшего размера клетки затем вводятся непосредственно в тот же канал, созданный первой иглой. Этот метод трансплантации может быть применен в различных экспериментальных проектах, используя в качестве донорских клеток как мышиные, так и человеческие клетки. Он был наиболее широко использован для ксенотрансплантации, потому что в этом контексте считается, что он обеспечивает улучшенное приживление по сравнению с внутривенными инъекциями, тем самым улучшая статистическую мощность и уменьшая количество используемых мышей.

Введение

Кровь имеет одну из самых высоких скоростей регенерации в организме человека, производя 1 × 10¹² клеток в день в костном^мозге взрослого человека1. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) гарантируют кроветворение на протяжении всей жизни в процессе кроветворения и определяются их способностью производить все типы клеток крови (мультипотенциальность) при сохранении себя (самообновление). Исторически сложилось так, что золотой стандарт проверки функции ГСК всегда основывался на трансплантации, проверке способности донорской популяции восстанавливать все кровные линии мыши в долгосрочной перспективе (обы....

протокол

Все исследования на животных, представленные здесь, соответствуют Положению о внесении поправок в Закон о животных (научные процедуры) 1986 года 2012 года и были проведены после этической экспертизы и одобрения Органа по благополучию животных и этической экспертизе Кембриджского университета (AWERB). Женский НОД. Для внутрибедренных инъекций использовали мышей Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) в возрасте от 12 до 16 недель (~21-30 г), выращенных в домашних условиях и содержащихся в животноводческих помещениях, свободных от специфических патогенов. Обезличенные образцы КБ были собраны у здоровых доноров после инф....

Результаты

Приживление интрафеморально введенных клеток может быть оценено в любой момент времени, начиная с 24 ч и далее, в зависимости от плана эксперимента. В конечной точке времени могут быть собраны ПЧ, БМ, ПБ и селезенка. Их можно обработать, а уровень приживления оценить с п?.......

Обсуждение

Внутрибедренные инъекции являются полезным инструментом при ксенотрансплантации, когда доступно лишь небольшое количество HSPC, обеспечивая улучшенное приживление по сравнению с внутривенными инъекциями. Однако техника требует сноровки и тренировки. При практике м?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169