Внутрибедренная инъекция гемопоэтических стволовых клеток и клеток-предшественников человека мышам с ослабленным иммунитетом

Резюме

Внутрибедренные инъекции позволяют приживить небольшое количество гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСК) путем размещения клеток непосредственно в полости костного мозга. В данной статье мы описываем экспериментальный протокол внутрибедренного введения человеческих ГСКС иммунодефицитным мышам.

Аннотация

Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) определяются их пожизненной способностью производить все типы клеток крови. Это было проверено на практике путем трансплантации клеточных популяций, содержащих ГСК, сингенным или иммунокомпрометированным мышам. Затем размер и многолинейный состав трансплантата измеряют с течением времени, обычно с помощью проточной цитометрии. Классически популяция, содержащая ГСК, вводится в кровоток животного, после чего ГСК попадают в костный мозг, где они оседают и начинают кровепродукцию. В качестве альтернативы, ГСК и/или клетки-предшественники (ГСК) могут быть размещены непосредственно в полости костного мозга.

В данной статье описан протокол внутрибедренной инъекции человеческих ГСКК иммунодефицитным мышам. Короче говоря, предварительно подготовленных мышей обезболивают, и с помощью иглы просверливают небольшое отверстие через колено в бедренной кости. С помощью инсулиновой иглы меньшего размера клетки затем вводятся непосредственно в тот же канал, созданный первой иглой. Этот метод трансплантации может быть применен в различных экспериментальных проектах, используя в качестве донорских клеток как мышиные, так и человеческие клетки. Он был наиболее широко использован для ксенотрансплантации, потому что в этом контексте считается, что он обеспечивает улучшенное приживление по сравнению с внутривенными инъекциями, тем самым улучшая статистическую мощность и уменьшая количество используемых мышей.

Введение

Кровь имеет одну из самых высоких скоростей регенерации в организме человека, производя 1 × 10¹² клеток в день в костном^мозге взрослого человека1. Гемопоэтические стволовые клетки (ГСК) гарантируют кроветворение на протяжении всей жизни в процессе кроветворения и определяются их способностью производить все типы клеток крови (мультипотенциальность) при сохранении себя (самообновление). Исторически сложилось так, что золотой стандарт проверки функции ГСК всегда основывался на трансплантации, проверке способности донорской популяции восстанавливать все кровные линии мыши в долгосрочной перспективе (обычно определяемой как минимум 20 недель)². Большой объем функциональной работы, охватывающей несколько десятилетий, продемонстрировал, что компартмент ГСК неоднороден как по выходу линии, так и по долгосрочному восстановлению. Инструментарий для изучения кроветворения значительно расширился за последние годы, благодаря появлению множества новых методов, включая функциональные анализы отдельных клеток in vitro , подходы к одомике одиночных клеток и отслеживание родословной³. Последние убедительно продемонстрировали, что вклады ГСК и мультипотентных предшественников в значительной степени различаются при нативном кроветворении и при стрессе, вызванном трансплантацией. Все эти методы дополняют анализы трансплантации, которые остаются важными для оценки долгосрочной способности ГСК к репопуляции. В контексте изучения кроветворения человека ксенотрансплантация является единственным методом экспериментальной оценки самообновления в условиях всего организма.

Ксенотрансплантация ГСК обычно выполняется с помощью внутривенного введения клеток мышам с ослабленным иммунитетом. Тем не менее, ГСК встречаются^редко4, и доступ к человеческим образцам, содержащим ГСК, ограничен. В 2003 году группа Джона Дика адаптировала протокол для аспирации костного мозга и внутрифеморального введения мышам с диабетом/тяжелым комбинированным иммунодефицитом (NOD-SCID) без ожирения с клетками пуповинной крови (CB) ^{Lin-CD34+ 5}. Насколько нам известно, не сообщалось о формальном сравнении внутривенных инъекций с внутрибедренными инъекциями в долгосрочных и серийных исходах трансплантации. Однако, по сравнению непосредственно с внутривенными инъекциями, внутрибедренные инъекции обеспечивают большие размеры трансплантата с тем же количеством трансплантированных^{клеток6}, по крайней мере, в краткосрочной перспективе. Кроме того, приживление может быть обнаружено при гораздо меньшем количестве трансплантированных гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (ГСК). Считается, что это связано с тем, что внутрибедренная доставка обходит необходимость размещения ГСК в костном мозге, что в контексте ксенотрансплантата является ограниченным из-за отсутствия межвидовой реактивности для ряда рецепторов и цитокинов. Используя внутрибедренные инъекции, Нотта и его коллеги были первыми, кто пересадил одиночные человеческие^ГСК7, хотя необходимо учитывать дополнительные соображения, описанные в их методах. Внутрибедренная доставка ТГСК также имеет ограничения. Сама инъекция нарушает и разрушает часть костного мозга, в связи с чем не показана для исследований перекрестных помех между ГСК и их микроокружением костного мозга. Кроме того, максимальное количество клеток ограничено объемом этой костной полости, и его может быть слишком мало для некоторых применений. Как и в случае с любым другим методом, его применение в конкретном эксперименте должно быть взвешено на основе преимуществ/недостатков и заданного вопроса. В контексте ксенотрансплантации, если целью эксперимента является проверка приживления небольшого количества ГСКК человека без оценки микроокружения, внутрибедренная доставка обычно предпочтительнее внутривенной инъекции.

протокол

Все исследования на животных, представленные здесь, соответствуют Положению о внесении поправок в Закон о животных (научные процедуры) 1986 года 2012 года и были проведены после этической экспертизы и одобрения Органа по благополучию животных и этической экспертизе Кембриджского университета (AWERB). Женский НОД. Для внутрибедренных инъекций использовали мышей Cg-Prkdc^{scidIl2rg tm1Wjl}/SzJ (NSG) в возрасте от 12 до 16 недель (~21-30 г), выращенных в домашних условиях и содержащихся в животноводческих помещениях, свободных от специфических патогенов. Обезличенные образцы КБ были собраны у здоровых доноров после информированного согласия Кембриджского биобанка крови и стволовых клеток (CBSB) в соответствии с регламентированными процедурами, утвержденными Местным комитетом по этике исследований Кембриджшира (18/EE/0199).

1. Подготовка мыши

1. Перед облучением сделайте надрезы в ушах мышей для идентификации и взвесьте их на предмет исходного веса.
2. За 24 часа до трансплантации клеток сублетально облучите мышей излучением 2,4 Гр.

2. Подготовка клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих инъекций можно использовать клетки из свежих или замороженных образцов. Специфические субпопуляции клеток могут быть отсортированы с помощью проточной цитометрии. В качестве альтернативы клетки могут быть культивированы в желаемых условиях перед трансплантацией. Для показанных экспериментов мы использовали замороженные клетки CB CD34⁺ .

1. Разморозьте клетки в пробирке объемом 50 мл путем добавления по каплям в 10 раз больше объема предварительно подогретой IMDM + 50% фетальной бычьей сыворотки (FBS) + 0,1 мг/мл ДНКазы, одновременно перемешивая пробирку вручную. Центрифугируйте клетки при 500 × г в течение 5 мин.
2. Ресуспендируйте клетки в 20-40 мкл (в идеале 25 мкл) PBS + пенициллин-стрептомицин (10 ЕД/мл или 0,1%) на мышь. По возможности допускайте дополнительные ячейки для мертвого объема при наборе клеток в шприц для инъекций. Храните клетки на льду до момента инъекций. Максимальное количество клеток за одну инъекцию составляет 4 миллиона клеток.

3. Подготовка к внутрибедренной инъекции в животноводческом помещении

1. Подготовьте следующие три иглы, необходимые для этой процедуры:
   1. Приготовьте шприц объемом 3 мл с иглой 27 G 1/2".
   2. Приготовьте инсулиновый шприц объемом 0,5 мл с иглой 29 г x 12,7 мм, содержащей клеточную суспензию.
   3. Приготовьте инсулиновый шприц объемом 1 мл с иглой 29 г x 0,5 дюйма с 0,1 мг/кг бупренорфина (100 μл).
2. Обезболивайте мышей в анестезиологической коробке (путем ингаляции изофлурана 2% (v/v) и кислорода 2 л/мин). Перенесите мышь в носовой конус и подтвердите ее готовность к процедуре ущипыванием пальца ноги. Нанесите офтальмологическую мазь на глаза, чтобы предотвратить сухость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура проводится в капюшоне с уровнем биобезопасности 2 и в стерильных условиях.

4. Внутрибедренная инъекция

1. Положите мышь на спину и согните заднюю лапу. Закрепите заднюю ногу, используя недоминантную руку, поместив большой палец на ступню, средний палец на бедро, а указательный палец на внешнюю сторону бедренной кости.
2. Аккуратно сбрейте или выщипывайте волосы вокруг коленной чашечки и протрите эту область спиртовым тампоном.
3. Используйте шприц объемом 3 мл с иглой 27 G 1/2" и направьтесь в верхний внутренний угол коленной чашечки, чтобы аккуратно просверлить отверстие через кожу по направлению к бедренной кости. Хотя сначала иглу можно вращать вперед и назад, используйте только одно движение по часовой стрелке в кость, пока вся игла не окажется в кости.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целью этого шага является создание канала для доставки клеток. (Дополнительный) Чтобы проверить, правильно ли игла находится в кости, отпустите ножку и вращайте шприц из стороны в сторону; Если она правильно находится в кости, то вся нога должна двигаться с вращением. Зафиксируйте ногу с помощью недоминирующей руки, поместив большой палец на ступню, средний палец на бедро, а указательный палец на внешнюю сторону бедренной кости, прежде чем продолжить. При неправильном введении игла, скорее всего, окажется в мышце или сухожилии, нога не будет вращаться вместе со шприцем, и вы можете почувствовать иглу под кожей.
4. Извлеките иглу, вращая ее против часовой стрелки, пока она не выйдет наполовину. На этом этапе с помощью спиртового тампона протрите вокруг иглы (может быть небольшая капля крови), а затем продолжайте поворачивать иглу против часовой стрелки и извлеките иглу.
5. Введите инсулиновый шприц объемом 0,5 мл с клетками бедренной кости через тот же канал. Как только игла будет вставлена, обратите внимание на царапину, указывающую на правильное местоположение. На этом этапе ослабьте хват на ноге, но будьте осторожны, чтобы не вытащить иглу из ноги. Затем осторожно введите 25 мкл клеточной суспензии в бедренную клетку и удалите иглу.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная «царапина» похожа на удар о шероховатую поверхность, и если игла чувствует, что она вошла плавно без ощущения шероховатости, она находится не в том месте. Большинство пользователей ясно понимают это, как только они добиваются успеха в своей практике.

5. Постинъекционный уход

1. Подкожно вводите мышке бупренорфин (0,1 мг/кг, 100 мкл) перед тем, как вернуть ее в клетку и контролировать восстановление после приема анестетика.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь не следует оставлять без присмотра до тех пор, пока она не придет в сознание, достаточное для поддержания лежачего состояния грудины, и не должна возвращаться в компанию других животных до полного выздоровления. У мышей вряд ли проявятся какие-либо побочные эффекты при внутрибедренной инъекции; Однако внутрибедренная инъекция может привести к снижению активности и боли в оперированной области.
2. Оцените отек скакательного сустава, боль и подвижность после процедуры.
   Примечание: Мыши должны восстановить нормальную подвижность конечностей в течение 24 часов после инъекции.

6. Анализ данных

1. Усыпляйте мышей путем вывиха шейки матки или любым другим одобренным методом после инъекции в любое время, например, через 24-48 часов для экспериментов по хоумингу, через 4-12 недель для кратковременной активности ГСК, >18 недель для долгосрочного приживления. Если планируется анализ периферической крови (ПГ), перед умерщвлением мышей следует провести обескровливание любым разрешенным методом, дав в идеале 50-100 мкл крови (не более 10% от общего объема). Удалите кости задней ноги и селезенку в соответствии со стандартными протоколами вскрытия.
2. Для костного мозга:
   1. Держите инъецированную бедренную кость (ИФ) и неинъецированные кости (голени задней ноги и неинъецированные бедренные кости, называемые БМ) отдельно. Промойте кости с помощью 1 мл IMDM + 5% FBS и иглы 36 г x 3/4 дюйма и центрифугируйте в течение 5 минут при 500 × г.
   2. Повторно суспендируйте гранулу в 500 мкл PBS + 3% FBS, а затем перенесите 50 мкл в лунку пластины с круглым дном 96 для окрашивания.
   3. Заморозьте оставшийся костный мозг и храните его в жидком азоте для дальнейших экспериментов ex vivo или вторичных in vivo .
3. Для ПБ:
   1. Промыть пробирку для сбора 100 мкл PBS + 3% FBS, переложить кровь в пробирку FACS объемом 5 мл и восполнить объем до 2,5 мл PBS + 3% FBS.
   2. Осторожно нанесите пипеткой 1 мл Pancoll на дно пробирок FACS и центрифугируйте в течение 25 мин при давлении 500 × г при выключенном тормозе.
   3. Соберите охристый слой шерсти, переложите его в пробирки объемом 1,5 мл и долейте до 1,5 мл PBS + 3% FBS. Центрифуга в течение 5 мин при 500 × г.
   4. Повторно суспендируйте гранулу в 50 мкл PBS + 3% FBS и переложите в лунку 96 кругло-донной пластины для окрашивания.
4. Для селезенки:
   1. Поместите селезенку в клеточное ситечко, помещенное в трубку объемом 50 мл, и раздавите поршенем из шприца объемом 3 мл.
   2. По одному миллилитру за раз добавляйте 5 мл IMDM + 5% FBS, чтобы промыть клетки. Наберите 50 мкл в лунку пластины с круглым дном 96 для окрашивания.
5. Приготовьте мастермикс антител; Вот пример для 10 образцов:
   1. Аликвота 550 мкл PBS + 3% FBS (50 мкл/образец + 10% экстра) в пробирке объемом 1,5 или 2 мл.
   2. Добавьте отдельные антитела так, чтобы их конечная концентрация была в 2 раза в зависимости от их титрования (например, для антитела, титруемого 1:100, добавьте 11 мкл).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите панель антител, которая оценивает потенциальную дифференцировку по всем представляющим интерес линиям крови, например, CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 и CD3/APCCy7.
6. Окрашивание: добавить 50 мкл мастермикса антител в каждую из лунок 96 пластины с круглым дном, содержащей образцы для окрашивания. Окрашиваем в течение 20 мин при комнатной температуре, добавляем 100 мкл PBS + 3% FBS для промывания ячеек и центрифугируем в течение 5 мин при 500 × г. Удалите надосадочную жидкость.
7. Повторно суспендируйте гранулу в 200 мкл PBS + 3% FBS и пропустите каждый образец через пробирку FACS с крышкой сетчатого фильтра. К образцам костного мозга и селезенки добавьте еще 200 мкл PBS + 3% FBS.
8. Контроль проточной цитометрии: Выполните контроль одиночного окрашивания с помощью компенсационных шариков, добавив 100 мкл PBS, 1 каплю положительных шариков, 1 каплю отрицательных шариков и 1 л антитела в пробирку FACS. Оставьте на 5 минут при комнатной температуре, а затем добавьте 300 μL PBS. Возьмите 50 мкл неокрашенных клеток костного мозга, полученных до 400 мкл с PBS + 3% FBS в качестве неокрашенного контроля.
9. Проанализируйте образцы с помощью проточной цитометрии.
   1. Используйте контроль с одним окрашиванием и неокрашенным для компенсации в соответствии с рекомендациями для используемого цитометра. Настройте стробирование, как показано на рисунке 3A.
   2. Для PB прогоните все клетки, а для костного мозга и селезенки проведите минимум 50 000 событий на образец в зависимости от уровня приживления человека.

Результаты

Приживление интрафеморально введенных клеток может быть оценено в любой момент времени, начиная с 24 ч и далее, в зависимости от плана эксперимента. В конечной точке времени могут быть собраны ПЧ, БМ, ПБ и селезенка. Их можно обработать, а уровень приживления оценить с п?...

Обсуждение

Внутрибедренные инъекции являются полезным инструментом при ксенотрансплантации, когда доступно лишь небольшое количество HSPC, обеспечивая улучшенное приживление по сравнению с внутривенными инъекциями. Однако техника требует сноровки и тренировки. При практике м?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169