면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입

요약

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

조혈모세포(HSC)는 모든 유형의 혈액 세포를 평생 생산할 수 있는 능력으로 정의됩니다. 이는 HSC를 포함하는 세포 집단을 합성 유전자 또는 면역 저하 마우스에 이식하여 운영상 테스트됩니다. 그런 다음 이식편의 크기와 다중 계통 조성을 일반적으로 유세포 분석을 통해 시간이 지남에 따라 측정합니다. 전통적으로 HSC를 함유한 개체군이 동물의 순환에 주입된 후 HSC는 골수의 본거지로 이동하여 머물고 혈액 생산을 시작합니다. 또는 HSC 및/또는 전구 세포(HSPC)를 골수강에 직접 배치할 수 있습니다.

이 논문은 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골내 주사하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 요컨대, 미리 조절된 쥐를 마취하고 바늘을 사용하여 무릎을 통해 대퇴골에 작은 구멍을 뚫습니다. 더 작은 인슐린 바늘을 사용하여 세포는 첫 번째 바늘에 의해 생성된 동일한 도관에 직접 주입됩니다. 이 이식 방법은 마우스 또는 인간 세포를 기증 세포로 사용하여 다양한 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 이종 이식에 가장 널리 사용되어 왔는데, 이러한 맥락에서 정맥 주사에 비해 향상된 생착을 제공하는 것으로 생각되어 통계적 검정력을 향상시키고 사용할 마우스의 수를 줄일 수 있기 때문입니다.

서문

혈액은 인체에서 재생률이 가장 높은 곳 중 하나로, 성인 골수에서 하루에 1 × 10¹² 개의 세포를 생산한다¹. 조혈모세포(HSC)는 조혈 과정을 통해 일생 동안 혈액 생성을 보장하며, 모든 유형의 혈액 세포를 생산하는 동시에 스스로를 유지(자가 재생)할 수 있는 능력으로 정의됩니다. 역사적으로 HSC의 기능을 테스트하기 위한 황금 표준은 항상 이식에 의존해 왔으며, 장기적으로(일반적으로 최소 20주로 ^정의됨) 마우스의 모든 혈통을 재구성할 수 있는 기증자 집단의 능력을 테스트했습니다2. 수십 년에 걸친 대규모 기능 연구는 HSC 구획이 계통 출력과 장기 재구성 모두에서 이질적이라는 것을 입증했습니다. 조혈을 연구하기 위한 툴킷은 체외 단세포 기능 분석, 단세포 오믹스 접근법 및 계통 추적을 포함한 많은 새로운 기술과 함께 수년에 걸쳐 상당히 확장되었습니다³. 후자는 HSC와 다능 전구 세포의 기여도가 자연 조혈과 이식에 의해 부과되는 스트레스 하에서 크게 다르다는 것을 결정적으로 입증했습니다. 이러한 모든 기법은 이식 분석을 보완하며, 이는 HSC의 장기적인 재증식 능력을 평가하는 데 여전히 중요합니다. 인간 조혈 연구의 맥락에서 이종 이식은 전체 유기체 환경에서 자가 재생을 실험적으로 평가할 수 있는 유일한 방법을 제공합니다.

HSC의 이종 이식은 일반적으로 면역력이 저하된 마우스에 세포를 정맥 주사하여 수행됩니다. 그러나 HSC는 드물며⁴ HSC가 포함된 인체 샘플에 대한 접근은 제한적입니다. 2003년, 존 딕(John Dick) 연구진은 Lin⁻CD34⁺ 제대혈(CB) 세포를 이용한 골수 흡인 및 대퇴 내 주입된 비만 당뇨병/중증 복합 면역결핍증(NOD-SCID) 마우스에 대한 프로토콜을 채택했다⁵. 우리가 아는 한, 장기 및 연속 이식 결과에서 정맥 주사와 대퇴 내 주사의 공식적인 비교는 보고된 적이 없습니다. 그러나, 정맥 주사와 직접 비교했을 때, 대퇴골 내 주사는 적어도 단기적으로는 동일한 수의 이식^{된 세포6}로 더 큰 이식편 크기를 제공한다. 또한, 훨씬 적은 수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 이식하여 생착을 감지할 수 있습니다. 이는 대퇴골 내 전달이 HSC가 골수의 본거지로 이동해야 할 필요성을 우회하기 때문인 것으로 생각되며, 이종이식 맥락에서 여러 수용체와 사이토카인에 대한 종간 반응성이 부족하여 제한되고 있습니다. 대퇴골 내 주사를 통해 Notta와 동료들은 단일 인간 HSC⁷을 처음으로 이식했지만, 그들의 방법에 설명된 대로 추가 고려 사항이 필요합니다. HSPC의 대퇴골 내 분만에도 한계가 있습니다. 주사 자체는 골수의 일부를 파괴하고 파괴하므로 HSC와 골수 미세환경 간의 누화 연구에는 적합하지 않습니다. 또한, 최대 세포 수는 해당 골강의 부피에 의해 제한되며 일부 응용 분야에서는 너무 적을 수 있습니다. 모든 기법과 마찬가지로, 특정 실험에서의 적용은 장점/단점 및 제기되는 질문에 따라 평가되어야 합니다. 이종 이식의 맥락에서, 실험의 목적이 미세 환경에 대한 평가 없이 적은 수의 인간 HSPC의 생착을 테스트하는 것이라면 일반적으로 정맥 주사보다 대퇴골 내 전달이 선호됩니다.

프로토콜

여기에 제시된 모든 동물 연구는 1986년 동물(과학적 절차)법 개정 규정 2012를 준수하며 케임브리지 대학교 동물 복지 및 윤리 검토 기관(AWERB)의 윤리 검토 및 승인 후 수행되었습니다. 여성 끄덕임. 12주에서 16주(~21-30g) 사이의 생후 12주에서 16주(~21-30g) 된 Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스를 사내에서 사육하고 Specific-Pathogen-Free 동물 시설에서 관리하여 대퇴골 내 주사에 사용했습니다. Cambridgeshire Local Research Ethics Committee(18/EE/0199)에서 승인한 규제 절차에 따라 Cambridge Blood and Stem Cell Biobank(CBSB)의 사전 동의 후 건강한 기증자로부터 비식별화된 CB 샘플을 수집했습니다.

1. 마우스의 준비

1. 방사선 조사하기 전에 식별을 위해 쥐의 귀를 홈으로 파고 기준선 체중을 위해 무게를 잰다.
2. 세포를 이식하기 24시간 전에 마우스에 2.4Gy 방사선을 치사하 방사선 조사합니다.

2. 세포의 준비

참고: 이러한 주입의 경우 신선 또는 냉동 샘플의 세포를 사용할 수 있습니다. 세포의 특정 부분집단은 유세포 분석으로 분류할 수 있습니다. 대안적으로, 이식 전에 원하는 조건에서 세포를 배양할 수 있습니다. 표시된 실험을 위해 냉동 CB CD34⁺ 세포를 사용하고 있습니다.

1. 튜브를 수동으로 교반하면서 미리 따뜻해진 IMDM + 50% 소 태아 혈청(FBS) + 0.1mg/mL DNase의 세포 부피의 10배를 적하에 추가하여 50mL 튜브의 세포를 해동합니다. 500× g 에서 5분 동안 세포를 원심분리합니다.
2. 마우스당 20-40 μL(이상적으로는 25 μL) + 페니실린-스트렙토마이신(10 U/mL 또는 0.1%)의 세포를 재현탁시킵니다. 가능하면 주입을 위해 주사기에 세포를 넣을 때 데드 볼륨에 대한 추가 세포를 허용하십시오. 주사할 때까지 세포를 얼음에 보관하십시오. 주입당 최대 세포 수는 400만 개입니다.

3. 동물 시설에서 대퇴골 내 주사를 위한 준비

1. 이 절차에 필요한 다음 세 개의 바늘을 준비합니다.
   1. 27G 1/2" 바늘이 있는 3mL 주사기를 준비합니다.
   2. 세포 현탁액이 들어 있는 29G x 12.7mm 바늘이 있는 0.5mL 인슐린 주사기를 준비합니다.
   3. 1mg/kg 부프레노르핀(100μL)이 든 29G x 0.5" 바늘이 있는 1mL 인슐린 주사기를 준비합니다.
2. 마취 상자에 쥐를 마취합니다(이소플루란 2%(v/v) 및 산소 2L/min 흡입을 통해). 마우스를 노즈 콘으로 옮기고 발가락 꼬집음으로 시술 준비 상태를 확인합니다. 눈의 건조를 방지하기 위해 안과 연고를 눈에 바르십시오.
   주의: 이 절차는 봉쇄 등급 2 생물안전 후드에서 수행되며 멸균 상태가 사용됩니다.

4. 대퇴 내 주사

1. 마우스를 등을 대고 뒷다리를 구부립니다. 엄지손가락을 발에, 가운데 손가락을 엉덩이에, 검지 손가락을 대퇴골 바깥쪽에 놓아 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 뒷다리를 고정합니다.
2. 슬개골 주변의 머리카락을 부드럽게 면도하거나 뽑고 알코올 면봉을 사용하여 해당 부위를 닦습니다.
3. 27G 1/2" 바늘과 함께 3mL 주사기를 사용하고 슬개골의 상단 안쪽 모서리를 목표로 하여 피부를 통해 대퇴골 쪽으로 부드럽게 구멍을 뚫습니다. 처음에는 바늘을 앞뒤로 회전할 수 있지만 바늘 전체가 뼈에 들어갈 때까지 시계 방향으로 한 번만 뼈에 넣습니다.
   참고: 이 단계의 목표는 세포 전달을 위한 도관을 생성하는 것입니다. (선택 사항) 바늘이 뼈에 올바르게 꽂혀 있는지 확인하려면 다리를 풀고 주사기를 좌우로 돌립니다. 뼈에 올바르게 있으면 다리 전체가 회전과 함께 움직여야 합니다. 계속하기 전에 엄지 손가락을 발에, 가운데 손가락을 엉덩이에, 검지 손가락을 대퇴골 바깥쪽에 놓아 주로 사용하지 않는 손을 사용하여 다리를 다시 고정합니다. 잘못 삽입하면 바늘이 근육이나 힘줄에 끼일 가능성이 높고, 다리가 주사기로 회전하지 않으며, 바늘이 피부 아래에서 느껴질 수 있습니다.
4. 바늘이 반쯤 빠질 때까지 시계 반대 방향으로 회전하여 바늘을 제거합니다. 이 때 알코올 면봉을 사용하여 바늘 주위를 닦은 후 (약간의 혈액 방울이있을 수 있음) 바늘을 시계 반대 방향으로 계속 돌려 바늘을 제거합니다.
5. 동일한 도관을 통해 대퇴골갱의 세포를 포함하는 0.5mL 인슐린 주사기를 삽입합니다. 바늘이 들어가면 올바른 위치를 나타내는 긁힌 느낌이 느껴지는 것을 기록하십시오. 이 시점에서 다리의 그립을 놓되 다리에서 바늘을 제거하지 않도록 주의하십시오. 그런 다음 25μL의 세포 현탁액을 대퇴골에 부드럽게 주입하고 바늘을 제거합니다.
   알림: 설명된 '긁힘'은 거친 표면을 치는 것과 같으며 바늘이 거친 느낌 없이 부드럽게 들어갔다고 느끼면 올바른 위치에 있지 않은 것입니다. 대부분의 사용자는 실습에 성공하면 이를 명확하게 이해합니다.

5. 주사 후 관리

1. 마우스에 부프레노르핀(0.1mg/kg, 100μL)을 피하에 주입한 후 케이지로 돌려보내고 마취제에서 회복되는지 모니터링합니다.
   알림: 쥐는 흉골 누운 자세를 유지하기에 충분한 의식을 회복할 때까지 방치해서는 안 되며 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내서는 안 됩니다. 마우스는 대퇴 내 주사에 부작용을 보이지 않을 것입니다. 그러나 대퇴골 내 주사는 수술 부위의 활동과 통증을 감소시킬 수 있습니다.
2. 시술 후 발목의 부종, 통증 및 이동성을 평가합니다.
   참고: 마우스는 주사 후 24시간 이내에 정상적인 사지 이동성을 회복해야 합니다.

6. 데이터 분석

1. 자궁경부 탈구 또는 주입 후 승인된 방법으로 언제든지 마우스를 안락사시킵니다(예: 원점 복귀 실험의 경우 24-48시간, 단기 HSC 활성의 경우 4-12주, 장기 생착의 경우 >18주). 말초 혈액(PB) 분석을 계획하는 경우 승인된 방법으로 희생하기 전에 마우스를 출혈시켜 이상적으로는 50-100μL의 혈액(총 부피의 10% 이하)을 생성합니다. 표준 절개 프로토콜에 따라 뒷다리 뼈와 비장을 제거합니다.
2. 골수의 경우:
   1. 주입된 대퇴골(IF)과 주입되지 않은 뼈(뒷다리 경골 및 주입되지 않은 대퇴골, BM이라고 함)를 분리하십시오. 1mL의 IMDM + 5% FBS와 36G x 3/4" 바늘 및 원심분리기를 사용하여 500× g에서 5분 동안 뼈를 씻어냅니다.
   2. 펠릿을 500 μL의 PBS + 3 % FBS에 재현탁시킨 다음 50 μL를 96 둥근 바닥 플레이트의 웰로 옮겨 염색합니다.
   3. 남아 있는 골수를 동결하고 추가 생체 외 또는 2차 생체 내 실험을 위해 액체 질소에 보관합니다.
3. PB의 경우:
   1. 채취 튜브를 100μL의 PBS + 3% FBS로 씻어내고 혈액을 5mL FACS 튜브로 옮긴 다음 PBS + 3% FBS로 2.5mL로 부피를 구성합니다.
   2. 브레이크를 끈 상태에서 Pancoll 1mL를 FACS 튜브 바닥에 조심스럽게 피펫팅하고 500× g 에서 25분 동안 원심분리합니다.
   3. 버피 코트 층을 수집하여 1.5mL 튜브로 옮기고 PBS + 3% FBS로 최대 1.5mL를 보충합니다. 500 × g에서 5분 동안 원심분리합니다.
   4. 펠릿을 50 μL의 PBS + 3 % FBS에 재현탁시키고 염색을 위해 96 둥근 바닥 플레이트의 웰로 옮깁니다.
4. 비장의 경우:
   1. 50mL 튜브에 놓인 세포 여과기에 비장을 놓고 3mL 주사기의 플런저로 분쇄합니다.
   2. 한 번에 1mL씩 5mL의 IMDM + 5% FBS를 추가하여 세포를 세척합니다. 염색을 위해 50 μL를 96 둥근 바닥 플레이트의 웰로 가져갑니다.
5. 항체 마스터믹스를 준비합니다. 다음은 10개 샘플에 대한 예입니다.
   1. 1.5 또는 2 mL 튜브에서 550 μL의 PBS + 3% FBS(50 μL/샘플 + 10% 추가)를 분취합니다.
   2. 적정에 따라 최종 농도가 2배가 되도록 개별 항체를 추가합니다(예: 1:100으로 적정된 항체의 경우 11μL 추가).
      참고: CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 및 CD3/APCCy7과 같은 모든 관심 혈액 계통에서 잠재적 분화를 평가하는 항체 패널을 선택하십시오.
6. 염색: 염색할 샘플이 들어 있는 96개의 둥근 바닥 플레이트의 각 웰에 50μL의 항체 마스터믹스를 추가합니다. 실온에서 20분 동안 염색하고 100μL의 PBS + 3% FBS를 추가하여 세포를 세척하고 500× g에서 5분 동안 원심분리합니다. 상층액을 제거합니다.
7. 펠릿을 200μL PBS + 3% FBS에 재현탁시키고 각 샘플을 셀 스트레이너 캡이 있는 FACS 튜브를 통과시킵니다. 골수 및 비장 샘플에 200μL의 PBS + 3% FBS를 추가로 추가합니다.
8. 유세포 분석 대조군: FACS 튜브에 PBS 100μL, 양성 비드 1방울, 음성 비드 1방울 및 항체 1μL를 추가하여 보상 비드를 사용하여 단일 염색 대조군을 만듭니다. 실온에서 5분 동안 그대로 둔 다음 300μL의 PBS를 추가합니다. PBS + 3% FBS를 사용하여 PBS + 3% FBS를 사용하여 최대 400μL로 만든 50μL의 염색되지 않은 골수 세포를 채취합니다.
9. 유세포 분석으로 시료를 분석합니다.
   1. single-stain control을 실행하고 사용된 유세포분석기에 대해 조언된 대로 보정을 위해 염색하지 않습니다. 그림 3A와 같이 게이팅을 설정합니다.
   2. PB의 경우 모든 세포를 실행하고 골수 및 비장의 경우 인간 생착 수준에 따라 샘플당 최소 50,000개의 이벤트를 실행합니다.

결과

대퇴 내 주입 세포의 생착은 실험 설계에 따라 24시간부터 언제든지 평가할 수 있습니다. 종료 시점에는 IF, BM, PB 및 비장이 수집될 수 있습니다. 이를 처리할 수 있으며 유세포 분석을 통해 생착 수준을 평가할 수 있습니다. 낮은 수준에서도 인간 생착을 강력하게 부르기 위해 인간 CD45에 대한 두 가지 뚜렷한 항체(클론 HI30 및 클론 2D1)로 염색했습니다. 두 항체(CD45⁺⁺

토론

대퇴골 내 주사는 소수의 HSPC만 사용할 수 있는 경우 이종 이식에 유용한 도구로, 정맥 주사에 비해 향상된 생착을 제공합니다. 그러나 이 기술에는 손재주와 훈련이 필요합니다. 연습할 때는 올바른 체중 범위의 신선한 시체(아래 참조)를 사용하고 유색 염료(예: 트리판 블루)를 주입하여 해부 시 주사가 대퇴골로 들어갔고 대퇴골에만 국한되었는지 명확하게 알 수 있도?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169