면역저하 마우스에 인간 조혈모세포와 전구세포의 대퇴골내 주입

요약

대퇴골 내 주사는 세포를 골수강에 직접 배치하여 소수의 조혈모세포 및 전구세포(HSPC)를 생착할 수 있습니다. 여기에서는 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골 내 주사하는 실험 프로토콜에 대해 설명합니다.

초록

조혈모세포(HSC)는 모든 유형의 혈액 세포를 평생 생산할 수 있는 능력으로 정의됩니다. 이는 HSC를 포함하는 세포 집단을 합성 유전자 또는 면역 저하 마우스에 이식하여 운영상 테스트됩니다. 그런 다음 이식편의 크기와 다중 계통 조성을 일반적으로 유세포 분석을 통해 시간이 지남에 따라 측정합니다. 전통적으로 HSC를 함유한 개체군이 동물의 순환에 주입된 후 HSC는 골수의 본거지로 이동하여 머물고 혈액 생산을 시작합니다. 또는 HSC 및/또는 전구 세포(HSPC)를 골수강에 직접 배치할 수 있습니다.

이 논문은 면역 결핍 마우스에 인간 HSPC를 대퇴골내 주사하기 위한 프로토콜을 설명합니다. 요컨대, 미리 조절된 쥐를 마취하고 바늘을 사용하여 무릎을 통해 대퇴골에 작은 구멍을 뚫습니다. 더 작은 인슐린 바늘을 사용하여 세포는 첫 번째 바늘에 의해 생성된 동일한 도관에 직접 주입됩니다. 이 이식 방법은 마우스 또는 인간 세포를 기증 세포로 사용하여 다양한 실험 설계에 적용할 수 있습니다. 이종 이식에 가장 널리 사용되어 왔는데, 이러한 맥락에서 정맥 주사에 비해 향상된 생착을 제공하는 것으로 생각되어 통계적 검정력을 향상시키고 사용할 마우스의 수를 줄일 수 있기 때문입니다.

서문

혈액은 인체에서 재생률이 가장 높은 곳 중 하나로, 성인 골수에서 하루에 1 × 10¹² 개의 세포를 생산한다¹. 조혈모세포(HSC)는 조혈 과정을 통해 일생 동안 혈액 생성을 보장하며, 모든 유형의 혈액 세포를 생산하는 동시에 스스로를 유지(자가 재생)할 수 있는 능력으로 정의됩니다. 역사적으로 HSC의 기능을 테스트하기 위한 황금 표준은 항상 이식에 의존해 왔으며, 장기적으로(일반적으로 최소 20주로 ^정의됨) 마우스의 모든 혈통을 재구성할 수 있는 기증자 집단의 능력을 테스트했습니다2. 수십 년에 걸친 대규모 기능 연구는 HSC 구획이 계통 출력과 장기 재구성 모두에서 이질적이라는 것을 입증했습니다. 조혈을 연구하기 위한 툴킷은 체외 단세포 기능 분석, 단세포 오믹스 접근법 및 계통 추적을 포함한 많은 새로운 기술과 함께 수년에 걸쳐 상당히 확장되었습니다³. 후자는 HSC와 다능 전구 세포의 기여도가 자연 조혈과 이식에 의해 부과되는 스트레스 하에서 크게 다르다는 것을 결정적으로 입증했습니다. 이러한 모든 기법은 이식 분석을 보완하며, 이는 HSC의 장기적인 재증식 ....

프로토콜

여기에 제시된 모든 동물 연구는 1986년 동물(과학적 절차)법 개정 규정 2012를 준수하며 케임브리지 대학교 동물 복지 및 윤리 검토 기관(AWERB)의 윤리 검토 및 승인 후 수행되었습니다. 여성 끄덕임. 12주에서 16주(~21-30g) 사이의 생후 12주에서 16주(~21-30g) 된 Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ(NSG) 마우스를 사내에서 사육하고 Specific-Pathogen-Free 동물 시설에서 관리하여 대퇴골 내 주사에 사용했습니다. Cambridgeshire Local Research Ethics Committee(18/EE/0199)에서 승인한 규제 절차에 따라 Cambridge Blood and Stem Cell Biobank(CBSB)의 사전 동의 후 건강한 기증자로부터 비식별화된 CB 샘플을 수집했습니다.

1. 마우스의 준비

1. 방사선 조사하기 전에 식별을 위해 쥐의 귀를 홈으로 파고 기준선 체중을 위해 무게를 잰다.
2. 세포를 이식하기 24시간 전에 마우스에 2.4Gy 방사선을 치사하 방사선 조사합니다.

토론

대퇴골 내 주사는 소수의 HSPC만 사용할 수 있는 경우 이종 이식에 유용한 도구로, 정맥 주사에 비해 향상된 생착을 제공합니다. 그러나 이 기술에는 손재주와 훈련이 필요합니다. 연습할 때는 올바른 체중 범위의 신선한 시체(아래 참조)를 사용하고 유색 염료(예: 트리판 블루)를 주입하여 해부 시 주사가 대퇴골로 들어갔고 대퇴골에만 국한되었는지 명확하게 알 수 있도?.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169