Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse

Zusammenfassung

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Zusammenfassung

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) zeichnen sich durch ihre lebenslange Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren. Dies wird operativ getestet, indem Zellpopulationen, die HSCs enthalten, in syngene oder immungeschwächte Mäuse transplantiert werden. Die Größe und Zusammensetzung des Transplantats wird dann im Laufe der Zeit gemessen, in der Regel durch Durchflusszytometrie. Klassischerweise wird eine Population, die HSCs enthält, in den Kreislauf des Tieres injiziert, woraufhin die HSCs ins Knochenmark gelangen, wo sie sich einlagern und mit der Blutproduktion beginnen. Alternativ können HSCs und/oder Vorläuferzellen (HSPCs) direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die intrafemorale Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse beschrieben. Kurz gesagt, vorkonditionierte Mäuse werden betäubt und mit einer Nadel ein kleines Loch durch das Knie in den Oberschenkelknochen gebohrt. Mit einer kleineren Insulinnadel werden die Zellen dann direkt in denselben Kanal injiziert, der von der ersten Nadel erzeugt wird. Diese Methode der Transplantation kann in verschiedenen experimentellen Designs angewendet werden, wobei entweder Mauszellen oder menschliche Zellen als Spenderzellen verwendet werden. Es wird am häufigsten für die Xenotransplantation verwendet, da in diesem Zusammenhang angenommen wird, dass es eine verbesserte Transplantation gegenüber intravenösen Injektionen ermöglicht, wodurch die statistische Aussagekraft verbessert und die Anzahl der zu verwendenden Mäuse reduziert wird.

Einleitung

Blut hat eine der höchsten Regenerationsraten im menschlichen Körper und produziert 1 × 10¹² Zellen pro Tag im erwachsenen menschlichen Knochenmark¹. Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) garantieren die Blutproduktion über die gesamte Lebensspanne durch den Prozess der Hämatopoese und zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren (Multipotentialität) und sich gleichzeitig selbst zu erhalten (Selbsterneuerung). In der Vergangenheit beruhte der Goldstandard für die Prüfung der Funktion eines HSC immer auf der Transplantation, bei der die Fähigkeit einer Spenderpopulation getestet wurde, alle Blutlinien einer Maus langfristig (allgemein definiert als mindestens 20 Wochen)² zu rekonstituieren. Eine große Anzahl von funktionellen Arbeiten, die sich über mehrere Jahrzehnte erstrecken, hat gezeigt, dass das HSC-Kompartiment sowohl in Bezug auf die Abstammungsleistung als auch auf die langfristige Rekonstitution heterogen ist. Das Instrumentarium zur Untersuchung der Hämatopoese hat sich im Laufe der Jahre mit vielen neuen Techniken erheblich erweitert, darunter In-vitro-Einzelzell-Funktionsassays, Einzelzell-Omics-Ansätze und Abstammungsverfolgung 3. Letztere haben schlüssig gezeigt, dass sich die Beiträge von HSC und multipotenten Vorläuferzellen in der nativen Hämatopoese und unter dem Stress durch Transplantation stark unterscheiden. Alle diese Techniken ergänzen Transplantationsassays, die nach wie vor wichtig sind, um die langfristige Repopulationskapazität von HSCs zu beurteilen. Im Zusammenhang mit der Erforschung der menschlichen Hämatopoese stellt die Xenotransplantation die einzige Methode dar, um die Selbsterneuerung in einem Gesamtorganismusumfeld experimentell zu bewerten.

Die Xenotransplantation von HSCs wird üblicherweise durch intravenöse Injektion von Zellen in immungeschwächte Mäuse durchgeführt. HSCs sind jedoch selten⁴ und der Zugang zu humanen Proben, die HSCs enthalten, ist begrenzt. Im Jahr 2003 passte die Gruppe von John Dick ein Protokoll für die Knochenmarkaspiration an und injizierte intrafemoral nicht-adipöse diabetische/schwere kombinierte Immundefizienz-Mäuse (NOD-SCID) mit ^Lin-CD34+ Nabelschnurblut (CB)-Zellen⁵. Unseres Wissens gibt es keinen Bericht über einen formalen Vergleich von intravenösen und intrafemoralen Injektionen bei Langzeit- und Serientransplantationsergebnissen. Im direkten Vergleich mit intravenösen Injektionen liefern intrafemorale Injektionen jedoch zumindest kurzfristig größere Transplantatgrößen mit der gleichen Anzahl transplantierter Zellen⁶. Darüber hinaus kann eine Transplantation mit viel weniger transplantierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) nachgewiesen werden. Es wird angenommen, dass dies darauf zurückzuführen ist, dass bei der intrafemoralen Verabreichung die Notwendigkeit von HSCs umgangen wird, das Knochenmark zu beheimaten, was im Zusammenhang mit Xenotransplantaten aufgrund eines Mangels an speziesübergreifender Reaktivität für eine Reihe von Rezeptoren und Zytokinen einschränkend ist. Durch den Einsatz von intrafemoralen Injektionen waren Notta und Kollegen die ersten, die einzelne humane HSCs^{transplantierten 7}, obwohl zusätzliche Überlegungen angestellt werden müssen, wie in ihren Methoden beschrieben. Die intrafemorale Verabreichung von HSPCs hat ebenfalls Einschränkungen. Die Injektion selbst zerstört und zerstört einen Teil des Knochenmarks und ist daher nicht indiziert für Studien zur Wechselwirkung zwischen HSCs und ihrer Mikroumgebung im Knochenmark. Darüber hinaus ist die maximale Anzahl von Zellen durch das Volumen dieser Knochenhöhle begrenzt, und das kann für einige Anwendungen zu wenig sein. Wie bei jeder Technik muss die Anwendung in einem bestimmten Experiment auf der Grundlage der Vorteile/Nachteile und der gestellten Fragestellung abgewogen werden. Wenn im Rahmen der Xenotransplantation das Ziel des Experiments darin besteht, die Transplantation einer geringen Anzahl menschlicher HSPCs ohne Bewertung der Mikroumgebung zu testen, wird die intrafemorale Verabreichung in der Regel der intravenösen Injektion vorgezogen.

Protokoll

Alle hier vorgestellten Tierversuche entsprechen dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012 und wurden nach ethischer Prüfung und Genehmigung durch das Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) der University of Cambridge durchgeführt. Weibliches NOD. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse im Alter zwischen 12 und 16 Wochen (~21-30 g), die im eigenen Haus gezüchtet und in einer spezifisch-pathogenfreien Tierhaltung gehalten wurden, wurden für intrafemorale Injektionen verwendet. Anonymisierte CB-Proben wurden von gesunden Spendern nach Einverständniserklärung der Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB) in Übereinstimmung mit regulierten Verfahren entnommen, die von der Cambridgeshire Local Research Ethics Committee (18/EE/0199) genehmigt wurden.

1. Vorbereitung der Maus

1. Kerben Sie vor der Bestrahlung die Ohren der Mäuse zur Identifizierung ein und wiegen Sie sie auf das Ausgangsgewicht.
2. Vierundzwanzig Stunden vor der Transplantation der Zellen bestrahlen Sie die Mäuse subletal mit 2,4 Gy Strahlung.

2. Vorbereitung der Zellen

HINWEIS: Für diese Injektionen können Zellen aus frischen oder gefrorenen Proben verwendet werden. Bestimmte Subpopulationen von Zellen können mittels Durchflusszytometrie sortiert werden. Alternativ können Zellen vor der Transplantation unter den gewünschten Bedingungen kultiviert werden. Für die gezeigten Experimente verwenden wir gefrorene CB CD34⁺ Zellen.

1. Tauen Sie die Zellen in einem 50-ml-Röhrchen durch tropfenweise Zugabe des 10-fachen des Zellvolumens an vorgewärmtem IMDM + 50 % fötalem Rinderserum (FBS) + 0,1 mg/ml DNase auf, während Sie das Röhrchen manuell bewegen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 × g für 5 min.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 20-40 μl (idealerweise 25 μl) PBS + Penicillin-Streptomycin (10 U/ml oder 0,1%) pro Maus. Wenn möglich, lassen Sie zusätzliche Zellen für ein totes Volumen zu, wenn Sie die Zellen für Injektionen in die Spritze aufnehmen. Lagern Sie die Zellen bis zur Injektion auf Eis. Die maximale Anzahl von Zellen pro Injektion beträgt 4 Millionen Zellen.

3. Vorbereitung für die intrafemorale Injektion in der Tierhaltung

1. Bereiten Sie die folgenden drei Nadeln vor, die für dieses Verfahren benötigt werden:
   1. Bereiten Sie eine 3-ml-Spritze mit einer 27 G 1/2" Nadel vor.
   2. Bereiten Sie eine 0,5-ml-Insulinspritze mit einer Nadel von 29 g x 12,7 mm vor, die die Zellsuspension enthält.
   3. Bereiten Sie eine 1 ml Insulinspritze mit einer 29 g x 0,5" Nadel mit 0,1 mg/kg Buprenorphin (100 μl) vor.
2. Betäuben Sie die Mäuse in einer Narkosebox (durch Inhalation von Isofluran 2% (v/v) und Sauerstoff 2 L/min). Setzen Sie die Maus auf einen Nasenkonus und bestätigen Sie die Bereitschaft für den Eingriff durch Zusammenkneifen der Zehen. Tragen Sie eine Augensalbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern.
   HINWEIS: Dieses Verfahren wird in einer Biosicherheitshaube der Sicherheitsstufe 2 unter sterilen Bedingungen durchgeführt.

4. Intrafemorale Injektion

1. Legen Sie die Maus auf den Rücken und beugen Sie das Hinterbein. Sichern Sie das Hinterbein mit der nicht dominanten Hand, indem Sie den Daumen auf den Fuß, den Mittelfinger auf die Hüfte und den Zeigefinger auf die Außenseite des Oberschenkelknochens legen.
2. Rasieren oder zupfen Sie die Haare vorsichtig um die Kniescheibe herum und wischen Sie den Bereich mit einem Alkoholtupfer ab.
3. Verwenden Sie die 3-ml-Spritze mit einer 27 G 1/2" Nadel und zielen Sie auf die obere innere Ecke der Kniescheibe, um vorsichtig ein Loch durch die Haut in Richtung Oberschenkelknochen zu bohren. Obwohl die Nadel anfangs hin und her gedreht werden kann, führe eine Bewegung im Uhrzeigersinn nur einmal in den Knochen ein, bis die gesamte Nadel im Knochen ist.
   HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, einen Kanal für die Zellzustellung zu generieren. (Fakultativ) Um zu überprüfen, ob die Nadel richtig im Knochen sitzt, lassen Sie das Bein los und drehen Sie die Spritze von einer Seite zur anderen. Wenn es richtig im Knochen sitzt, sollte sich das ganze Bein mit der Drehung bewegen. Sichern Sie das Bein mit der nicht dominanten Hand wieder, indem Sie den Daumen auf den Fuß, den Mittelfinger auf die Hüfte und den Zeigefinger auf die Außenseite des Oberschenkelknochens legen, bevor Sie fortfahren. Wenn die Nadel falsch eingeführt wird, befindet sie sich wahrscheinlich im Muskel oder in der Sehne, das Bein dreht sich nicht mit der Spritze und Sie können die Nadel unter der Haut spüren.
4. Entfernen Sie die Nadel mit einer Drehung gegen den Uhrzeigersinn, bis sie sich auf halber Höhe befindet. Wischen Sie an dieser Stelle mit einem Alkoholtupfer über die Nadel (es kann ein kleiner Blutstropfen vorhanden sein) und drehen Sie die Nadel dann weiter gegen den Uhrzeigersinn und entfernen Sie die Nadel.
5. Führen Sie die 0,5-ml-Insulinspritze mit den Zellen über denselben Kanal in den Femurschaft ein. Sobald die Nadel eingesteckt ist, notieren Sie sich, dass Sie einen Kratzer spüren, der die richtige Stelle anzeigt. Löse an dieser Stelle den Griff am Bein, aber achte darauf, die Nadel nicht vom Bein zu entfernen. Injizieren Sie dann vorsichtig die 25 μl Zellsuspension in den Femur und entfernen Sie die Nadel.
   HINWEIS: Der beschriebene "Kratzer" ist wie das Auftreffen auf eine raue Oberfläche, und wenn die Nadel das Gefühl hat, dass sie sanft eingedrungen ist, ohne ein raues Gefühl zu haben, befindet sie sich nicht an der richtigen Stelle. Die meisten Benutzer verstehen dies klar, wenn sie in ihrer Praxis erfolgreich sind.

5. Pflege nach der Injektion

1. Injizieren Sie der Maus subkutan Buprenorphin (0,1 mg/kg, 100 μl), bevor Sie sie in ihren Käfig zurückbringen und überwachen, ob sie sich von der Narkose erholt hat.
   HINWEIS: Die Maus darf nicht unbeaufsichtigt gelassen werden, bis sie wieder ausreichend Bewusstsein erlangt hat, um das Brustbein aufrechtzuerhalten, und wird erst wieder in die Gesellschaft anderer Tiere zurückgebracht, wenn sie sich vollständig erholt hat. Es ist unwahrscheinlich, dass Mäuse nachteilige Auswirkungen auf die intrafemorale Injektion zeigen; Eine intrafemorale Injektion kann jedoch zu einer verminderten Aktivität und Schmerzen im operierten Bereich führen.
2. Beurteilen Sie die Schwellung des Sprunggelenks, die Schmerzen und die Beweglichkeit nach dem Eingriff.
   HINWEIS: Mäuse sollten innerhalb von 24 Stunden nach der Injektion ihre normale Beweglichkeit der Gliedmaßen wiedererlangen.

6. Analyse der Daten

1. Euthanasieren Sie die Mäuse durch zervikale Dislokation oder eine andere zugelassene Methode nach der Injektion zu einem beliebigen Zeitpunkt, z. B. 24-48 Stunden für Homing-Experimente, 4-12 Wochen für kurzfristige HSC-Aktivität, >18 Wochen für langfristige Transplantation. Wenn eine Analyse des peripheren Blutes (PB) geplant ist, bluten die Mäuse vor der Tötung mit einer zugelassenen Methode, wobei idealerweise 50-100 μl Blut (nicht mehr als 10 % des Gesamtvolumens) ergeben werden. Entfernen Sie die Knochen und die Milz der hinteren Beine gemäß den Standard-Dissektionsprotokollen.
2. Für Knochenmark:
   1. Halten Sie den injizierten Femur (IF) und die nicht injizierten Knochen (Schienbeine der Hinterbeine und nicht injizierte Femure, BM genannt) getrennt. Spülen Sie die Knochen mit 1 mL IMDM + 5 % FBS und einer 36 G x 3/4" Nadel und zentrifugieren Sie sie 5 Minuten lang bei 500 × g.
   2. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PBS + 3 % FBS und geben Sie dann 50 μl zum Färben in eine Vertiefung mit einer 96er Platte mit rundem Boden.
   3. Restliches Knochenmark wird eingefroren und in flüssigem Stickstoff für weitere ex vivo oder sekundäre in vivo Versuche gelagert.
3. Für den PB:
   1. Waschen Sie das Entnahmeröhrchen mit 100 μl PBS + 3 % FBS aus, übertragen Sie das Blut in ein 5 mL FACS-Röhrchen und füllen Sie das Volumen mit PBS + 3 % FBS auf 2,5 mL auf.
   2. Pipettieren Sie vorsichtig 1 ml Pancoll in den Boden der FACS-Röhrchen und zentrifugieren Sie 25 Minuten lang bei 500 × g bei ausgeschalteter Bremse.
   3. Entnehmen Sie die Buffy-Coat-Schicht, übertragen Sie sie auf 1,5-ml-Röhrchen und füllen Sie sie auf 1,5 mL mit PBS + 3% FBS auf. 5 min bei 500 × g zentrifugieren.
   4. Das Pellet wird in 50 μl PBS + 3 % FBS resuspendiert und zum Färben in eine Vertiefung mit einer 96er Rundbodenplatte gegeben.
4. Für die Milz:
   1. Legen Sie die Milz in ein Zellsieb, das auf ein 50-ml-Röhrchen gestellt wird, und zerkleinern Sie sie mit dem Kolben einer 3-ml-Spritze.
   2. Fügen Sie jeweils einen Milliliter 5 ml IMDM + 5 % FBS hinzu, um die Zellen durchzuspülen. 50 μl zum Färben in eine Vertiefung einer 96er Platte mit rundem Boden geben.
5. Bereiten Sie einen Antikörper-Mastermix vor; Hier ist ein Beispiel für 10 Beispiele:
   1. Aliquotieren Sie 550 μl PBS + 3 % FBS (50 μl/Probe + 10 % extra) in einem 1,5- oder 2-ml-Röhrchen.
   2. Fügen Sie einzelne Antikörper hinzu, so dass ihre Endkonzentration basierend auf ihrer Titration das 2-fache beträgt (z. B. für einen Antikörper, der 1:100 titriert ist, fügen Sie 11 μl hinzu).
      HINWEIS: Wählen Sie ein Antikörper-Panel, das die potenzielle Differenzierung über alle interessierenden Blutlinien hinweg bewertet, z. B. CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 und CD3/APCCy7.
6. Färbung: Geben Sie 50 μl Antikörper-Mastermix in jede der Vertiefungen der 96-Rundbodenplatte, die die zu färbenden Proben enthält. 20 min bei Raumtemperatur färben, 100 μl PBS + 3 % FBS zum Waschen der Zellen hinzufügen und 5 min bei 500 × g zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand.
7. Resuspendieren Sie das Pellet in 200 μl PBS + 3 % FBS und leiten Sie jede Probe durch ein FACS-Röhrchen mit einer Zellsiebkappe. Zu Knochenmark- und Milzproben fügen Sie weitere 200 μl PBS + 3 % FBS hinzu.
8. Durchflusszytometrie-Kontrollen: Führen Sie Einzelfärbekontrollen mit Kompensationsperlen durch, indem Sie 100 μl PBS, 1 Tropfen positive Kügelchen, 1 Tropfen negative Kügelchen und 1 μl des Antikörpers in ein FACS-Röhrchen geben. 5 Minuten bei Raumtemperatur ziehen lassen und dann 300 μl PBS hinzufügen. Nehmen Sie 50 μl ungefärbte Knochenmarkzellen, die bis zu 400 μl mit PBS + 3 % FBS als ungefärbte Kontrolle hergestellt wurden.
9. Analysieren Sie die Proben mittels Durchflusszytometrie.
   1. Führen Sie Einzelfleckenkontrollen und ungefärbte Kontrollen zur Kompensation durch, wie für das verwendete Zytometer empfohlen. Richten Sie das Gating wie in Abbildung 3A ein.
   2. Führen Sie für PB alle Zellen und für Knochenmark und Milz mindestens 50.000 Ereignisse pro Probe durch, abhängig von den Transplantatgraden des Menschen.

Ergebnisse

Die Transplantation der intrafemoral injizierten Zellen kann je nach Versuchsdesign jederzeit ab 24 h beurteilt werden. Zum Endzeitpunkt können IF, BM, PB und Milz erfasst werden. Diese können verarbeitet und der Grad der Transplantation mittels Durchflusszytometrie beurteilt werden. Um eine humane Transplantation auch bei niedrigen Konzentrationen robust bezeichnen zu können, haben wir mit zwei unterschiedlichen Antikörpern gegen humanes CD45 gefärbt (Klon HI30 und Klon 2D1). Nur Z...

Diskussion

Intrafemorale Injektionen sind ein nützliches Instrument bei der Xenotransplantation, wenn nur eine kleine Anzahl von HSPCs verfügbar ist, und bieten im Vergleich zu intravenösen Injektionen eine verbesserte Transplantation. Die Technik erfordert jedoch Geschicklichkeit und Training. Beim Üben empfehlen wir, frische Leichen im richtigen Gewichtsbereich (siehe unten) zu verwenden und einen farbigen Farbstoff (z. B. Trypanblau) zu injizieren, damit bei der Dissektion klar ist, ob die I...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169