Intrafemorale Injektion von humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen in immungeschwächte Mäuse

Zusammenfassung

Intrafemorale Injektionen ermöglichen die Transplantation einer kleinen Anzahl von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs), indem die Zellen direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden. Hier beschreiben wir ein experimentelles Protokoll zur intrafemoralen Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse.

Zusammenfassung

Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) zeichnen sich durch ihre lebenslange Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren. Dies wird operativ getestet, indem Zellpopulationen, die HSCs enthalten, in syngene oder immungeschwächte Mäuse transplantiert werden. Die Größe und Zusammensetzung des Transplantats wird dann im Laufe der Zeit gemessen, in der Regel durch Durchflusszytometrie. Klassischerweise wird eine Population, die HSCs enthält, in den Kreislauf des Tieres injiziert, woraufhin die HSCs ins Knochenmark gelangen, wo sie sich einlagern und mit der Blutproduktion beginnen. Alternativ können HSCs und/oder Vorläuferzellen (HSPCs) direkt in der Knochenmarkhöhle platziert werden.

In dieser Arbeit wird ein Protokoll für die intrafemorale Injektion von humanen HSPCs in immundefiziente Mäuse beschrieben. Kurz gesagt, vorkonditionierte Mäuse werden betäubt und mit einer Nadel ein kleines Loch durch das Knie in den Oberschenkelknochen gebohrt. Mit einer kleineren Insulinnadel werden die Zellen dann direkt in denselben Kanal injiziert, der von der ersten Nadel erzeugt wird. Diese Methode der Transplantation kann in verschiedenen experimentellen Designs angewendet werden, wobei entweder Mauszellen oder menschliche Zellen als Spenderzellen verwendet werden. Es wird am häufigsten für die Xenotransplantation verwendet, da in diesem Zusammenhang angenommen wird, dass es eine verbesserte Transplantation gegenüber intravenösen Injektionen ermöglicht, wodurch die statistische Aussagekraft verbessert und die Anzahl der zu verwendenden Mäuse reduziert wird.

Einleitung

Blut hat eine der höchsten Regenerationsraten im menschlichen Körper und produziert 1 × 10¹² Zellen pro Tag im erwachsenen menschlichen Knochenmark¹. Hämatopoetische Stammzellen (HSCs) garantieren die Blutproduktion über die gesamte Lebensspanne durch den Prozess der Hämatopoese und zeichnen sich durch ihre Fähigkeit aus, alle Blutzelltypen zu produzieren (Multipotentialität) und sich gleichzeitig selbst zu erhalten (Selbsterneuerung). In der Vergangenheit beruhte der Goldstandard für die Prüfung der Funktion eines HSC immer auf der Transplantation, bei der die Fähigkeit einer Spenderpopulation getes....

Protokoll

Alle hier vorgestellten Tierversuche entsprechen dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 Amendment Regulations 2012 und wurden nach ethischer Prüfung und Genehmigung durch das Animal Welfare and Ethical Review Body (AWERB) der University of Cambridge durchgeführt. Weibliches NOD. Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG) Mäuse im Alter zwischen 12 und 16 Wochen (~21-30 g), die im eigenen Haus gezüchtet und in einer spezifisch-pathogenfreien Tierhaltung gehalten wurden, wurden für intrafemorale Injektionen verwendet. Anonymisierte CB-Proben wurden von gesunden Spendern nach Einverständniserklärung der Cambridge Blood....

Diskussion

Intrafemorale Injektionen sind ein nützliches Instrument bei der Xenotransplantation, wenn nur eine kleine Anzahl von HSPCs verfügbar ist, und bieten im Vergleich zu intravenösen Injektionen eine verbesserte Transplantation. Die Technik erfordert jedoch Geschicklichkeit und Training. Beim Üben empfehlen wir, frische Leichen im richtigen Gewichtsbereich (siehe unten) zu verwenden und einen farbigen Farbstoff (z. B. Trypanblau) zu injizieren, damit bei der Dissektion klar ist, ob die I.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169