Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos

Resumo

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Resumo

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são definidas por sua capacidade vitalícia de produzir todos os tipos de células sanguíneas. Isso é testado operacionalmente transplantando populações de células contendo HSCs em camundongos singênicos ou imunocomprometidos. O tamanho e a composição multilinhagem do enxerto são então medidos ao longo do tempo, geralmente por citometria de fluxo. Classicamente, uma população contendo HSCs é injetada na circulação do animal, após o que as HSCs abrigam a medula óssea, onde se alojam e iniciam a produção de sangue. Alternativamente, HSCs e / ou células progenitoras (HSPCs) podem ser colocadas diretamente na cavidade da medula óssea.

Este artigo descreve um protocolo para injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes. Em suma, os camundongos pré-condicionados são anestesiados e um pequeno orifício é perfurado no joelho até o fêmur usando uma agulha. Usando uma agulha de insulina menor, as células são injetadas diretamente no mesmo conduíte criado pela primeira agulha. Este método de transplante pode ser aplicado em projetos experimentais variados, usando células de camundongos ou humanas como células doadoras. Tem sido mais amplamente utilizado para xenotransplante, porque, neste contexto, acredita-se que forneça enxerto aprimorado em relação às injeções intravenosas, melhorando assim o poder estatístico e reduzindo o número de camundongos a serem usados.

Introdução

O sangue tem uma das maiores taxas de regeneração do corpo humano, produzindo 1 × 10¹² células por dia na medula óssea humana adulta¹. As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) garantem a produção de sangue ao longo da vida pelo processo de hematopoiese e são definidas por sua capacidade de produzir todos os tipos de células sanguíneas (multipotencialidade) enquanto se mantêm (auto-renovação). Historicamente, o padrão-ouro para testar a função de um HSC sempre se baseou no transplante, testando a capacidade de uma população de doadores de reconstituir todas as linhagens sanguíneas de um camundongo a longo prazo (comumente definido como um mínimo de 20 semanas)². Um grande corpo de trabalho funcional abrangendo várias décadas demonstrou que o compartimento HSC é heterogêneo tanto na produção de linhagem quanto na reconstituição de longo prazo. O kit de ferramentas para estudar a hematopoiese se expandiu consideravelmente ao longo dos anos, com muitas novas técnicas, incluindo ensaios funcionais de célula única in vitro , abordagens ômicas de célula única e rastreamento de linhagem³. Estes últimos demonstraram conclusivamente que as contribuições do HSC e dos progenitores multipotentes diferem amplamente na hematopoiese nativa e sob o estresse imposto pelo transplante. Todas essas técnicas complementam os ensaios de transplante, que continuam sendo importantes para avaliar a capacidade de repovoamento a longo prazo dos HSCs. No contexto do estudo da hematopoiese humana, o xenotransplante fornece o único método para avaliar experimentalmente a auto-renovação em um ambiente de organismo inteiro.

O xenotransplante de HSCs é comumente realizado usando injeção intravenosa de células em camundongos imunocomprometidos. No entanto, as HSCs são raras⁴ e o acesso a amostras humanas contendo HSCs é limitado. Em 2003, o grupo de John Dick adaptou um protocolo para aspiração de medula óssea e camundongos diabéticos/imunodeficiência combinada grave (NOD-SCID) injetados intrafemoralmente com células do sangue do cordão umbilical (CB) Lin⁻CD34^{+ 5}. Até onde sabemos, não houve comparação formal relatada de injeções intravenosas versus intrafemorais em desfechos de transplante em longo prazo e seriados. No entanto, em comparação direta com as injeções intravenosas, as injeções intrafemorais fornecem tamanhos de enxerto maiores com o mesmo número de células transplantadas⁶, pelo menos em curto prazo. Além disso, o enxerto pode ser detectado com muito menos células-tronco hematopoiéticas e progenitoras (HSPCs) transplantadas. Acredita-se que isso ocorra porque a administração intrafemoral ignora a necessidade de HSCs para abrigar a medula óssea, o que no contexto do xenoenxerto é limitante devido à falta de reatividade entre espécies para vários receptores e citocinas. Por meio do uso de injeções intrafemorais, Notta e colegas foram os primeiros a transplantar HSCs humanos únicos⁷, embora considerações extras precisem ser tomadas, conforme descrito em seus métodos. A administração intrafemoral de HSPCs também tem limitações. A injeção em si interrompe e destrói parte da medula óssea e, portanto, não é indicada para estudos da interferência entre HSCs e seu microambiente de medula óssea. Além disso, o número máximo de células é limitado pelo volume dessa cavidade óssea e isso pode ser muito pequeno para algumas aplicações. Como acontece com toda técnica, sua aplicação em um experimento específico precisa ser ponderada com base nos benefícios / desvantagens e na pergunta que está sendo feita. No contexto do xenotransplante, se o objetivo do experimento é testar o enxerto de um baixo número de HSPCs humanos sem avaliação do microambiente, a administração intrafemoral é geralmente preferida à injeção intravenosa.

Protocolo

Todas as pesquisas com animais apresentadas aqui aderem aos Regulamentos de Emenda da Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 de 2012 e foram realizadas após revisão ética e aprovação pelo Órgão de Revisão Ética e Bem-Estar Animal da Universidade de Cambridge (AWERB). Aceno feminino. Camundongos Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), com idade entre 12 e 16 semanas (~21-30 g), criados internamente e mantidos em uma instalação animal livre de patógenos específicos, foram usados para injeções intrafemorais. Amostras de CB não identificadas foram coletadas de doadores saudáveis após consentimento informado do Cambridge Blood and Stem Cell Biobank (CBSB) de acordo com os procedimentos regulamentados aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa Local de Cambridgeshire (18/EE/0199).

1. Preparação do mouse

1. Antes da irradiação, entalhe as orelhas dos camundongos para identificação e pese-as quanto ao peso basal.
2. Vinte e quatro horas antes do transplante das células, irradiar subletalmente os camundongos com radiação de 2,4 Gy.

2. Preparação de células

NOTA: Para essas injeções, as células podem ser usadas a partir de amostras frescas ou congeladas. Subpopulações específicas de células podem ser classificadas por citometria de fluxo. Alternativamente, as células podem ser cultivadas nas condições desejadas antes do transplante. Para os experimentos mostrados, estamos usando células CB CD34 ⁺ congeladas.

1. Descongele as células em um tubo de 50 mL pela adição gota a gota de 10x o volume da célula de IMDM pré-aquecido + 50% de soro fetal bovino (FBS) + 0,1 mg/mL de DNase enquanto agita o tubo manualmente. Centrifugue as células a 500 × g durante 5 min.
2. Ressuspenda as células em 20-40 μL (idealmente 25 μL) de PBS + Penicilina-Estreptomicina (10 U / mL ou 0,1%) por camundongo. Se possível, deixe células extras para um volume morto ao levar as células para a seringa para injeções. Armazene as células no gelo até as injeções. O número máximo de células por injeção é de 4 milhões de células.

3. Preparação para injeção intrafemoral no biotério

1. Prepare as três agulhas a seguir necessárias para este procedimento:
   1. Prepare uma seringa de 3 ml com uma agulha de 27 G 1/2".
   2. Prepare uma seringa de insulina de 0,5 ml com agulha de 29 G x 12,7 mm contendo a suspensão celular.
   3. Prepare uma seringa de insulina de 1 mL com agulha de 29 G x 0,5" com buprenorfina 0,1 mg/kg (100 μL).
2. Anestesiar os camundongos em uma caixa anestésica (através da inalação de isoflurano 2% (v/v) e oxigênio 2 L/min). Transfira o mouse para um cone do nariz e confirme sua prontidão para o procedimento beliscando o dedo do pé. Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento.
   NOTA: Este procedimento é realizado em um capuz de biossegurança de nível 2 de contenção e são utilizadas condições estéreis.

4. Injeção intrafemoral

1. Coloque o mouse de costas e flexione a pata traseira. Prenda a perna traseira usando a mão não dominante, colocando o polegar no pé, o dedo médio no quadril e o dedo indicador na parte externa do fêmur.
2. Raspe suavemente ou arranque o cabelo ao redor da rótula e use um cotonete embebido em álcool para limpar a área.
3. Use a seringa de 3 mL com uma agulha de 27 G 1/2" e aponte para o canto interno superior da rótula para fazer um orifício suavemente na pele em direção ao fêmur. Embora a agulha possa ser girada para frente e para trás no início, use apenas um movimento no sentido horário uma vez no osso, até que toda a agulha esteja no osso.
   NOTA: O objetivo desta etapa é gerar um conduíte para entrega de células. (Opcional) Para verificar se a agulha está corretamente no osso, solte a perna e gire a seringa de um lado para o outro; Se estiver corretamente no osso, toda a perna deve se mover com a rotação. Prenda novamente a perna usando a mão não dominante, colocando o polegar no pé, o dedo médio no quadril e o dedo indicador na parte externa do fêmur, antes de continuar. Se inserida incorretamente, a agulha provavelmente estará no músculo ou tendão, a perna não girará com a seringa e você poderá sentir a agulha sob a pele.
4. Remova a agulha girando no sentido anti-horário até que esteja na metade. Neste ponto, use um cotonete embebido em álcool para limpar ao redor da agulha (pode haver uma pequena gota de sangue) e, em seguida, continue girando a agulha no sentido anti-horário e remova a agulha.
5. Insira a seringa de insulina de 0,5 mL contendo as células na diáfise femoral através do mesmo conduto. Assim que a agulha estiver dentro, anote que sentiu um arranhão indicando o local correto. Neste ponto, solte o aperto da perna, mas tome cuidado para não remover a agulha da perna. Em seguida, injete suavemente os 25 μL de suspensão celular no fêmur e remova a agulha.
   NOTA: O 'arranhão' descrito é como bater em uma superfície áspera e se a agulha sentir que entrou suavemente sem sensação áspera, não está no lugar correto. A maioria dos usuários entende isso claramente quando é bem-sucedida em sua prática.

5. Cuidados pós-injeção

1. Injete o camundongo por via subcutânea com buprenorfina (0,1 mg / kg, 100 μL) antes de devolvê-lo à sua gaiola e monitorar a recuperação do anestésico.
   NOTA: O camundongo não deve ser deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal e não seja devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. É improvável que os camundongos apresentem quaisquer efeitos adversos à injeção intrafemoral; no entanto, a injeção intrafemoral pode resultar em redução da atividade e dor na área operada.
2. Avalie o inchaço do jarrete, a dor e a mobilidade após o procedimento.
   NOTA: Os camundongos devem recuperar a mobilidade normal dos membros dentro de 24 h após a injeção.

6. Analisando os dados

1. Eutanasiar os camundongos por luxação cervical ou qualquer método aprovado após a injeção a qualquer momento, por exemplo, 24-48 h para experimentos de homing, 4-12 semanas para atividade HSC de curto prazo >18 semanas para enxerto de longo prazo. Se a análise do sangue periférico (PB) for planejada, sangrar os camundongos antes do sacrifício por qualquer método autorizado, produzindo idealmente 50-100 μL de sangue (não mais do que 10% do volume total). Remova os ossos da perna traseira e o baço de acordo com os protocolos de dissecção padrão.
2. Para a medula óssea:
   1. Mantenha o fêmur injetado (IF) e os ossos não injetados (tíbias da perna traseira e fêmures não injetados, denominados MO) separados. Lave os ossos usando 1 mL de IMDM + 5% FBS e uma agulha de 36 G x 3/4 "e centrifugue por 5 min a 500 × g.
   2. Ressuspenda o pellet em 500 μL de PBS + 3% FBS e, em seguida, transfira 50 μL para um poço de uma placa de fundo redondo 96 para coloração.
   3. Congelar a medula óssea restante e armazená-la em nitrogênio líquido para experimentos ex vivo ou secundários in vivo .
3. Para o OP:
   1. Lave o tubo de coleta com 100 μL de PBS + 3% de FBS, transfira o sangue para um tubo de 5 mL de FACS e complete o volume para 2,5 mL com PBS + 3% de FBS.
   2. Pipetar cuidadosamente 1 ml de Pancoll no fundo dos tubos FACS e centrifugar durante 25 min a 500 × g com o travão desligado.
   3. Colete a camada de buffy coat, transfira-a para tubos de 1,5 mL e complete até 1,5 mL com PBS + 3% FBS. Centrifugue por 5 min a 500 × g.
   4. Ressuspenda o pellet em 50 μL de PBS + 3% de FBS e transfira para um poço de uma placa de fundo redondo de 96 para coloração.
4. Para o baço:
   1. Coloque o baço em um filtro de células colocado em um tubo de 50 mL e esmague com o êmbolo de uma seringa de 3 mL.
   2. Um mililitro de cada vez, adicione 5 mL de IMDM + 5% de FBS para lavar as células. Leve 50 μL para um poço de uma placa de fundo redondo de 96 para coloração.
5. Prepare um mastermix de anticorpos; Aqui está um exemplo para 10 amostras:
   1. Alíquota 550 μL de PBS + 3% de FBS (50 μL/amostra + 10% extra) em tubo de 1,5 ou 2 mL.
   2. Adicione anticorpos individuais para que sua concentração final seja 2x com base em sua titulação (por exemplo, para um anticorpo titulado 1:100, adicione 11 μL).
      NOTA: Escolha um painel de anticorpos que avalie a diferenciação potencial em todas as linhagens sanguíneas de interesse, por exemplo, CD19/FITC, GlyA/PE, CD45/PECy5, CD14/PECy7, CD33/APC, CD19/Alexa 700, CD45/BV510 e CD3/APCCy7.
6. Coloração: adicionar 50 μL de mastermix de anticorpos a cada um dos alvéolos da placa de fundo redondo 96 que contém as amostras a colorir. Pinte por 20 min em temperatura ambiente, adicione 100 μL de PBS + 3% de FBS para lavar as células e centrifugue por 5 min a 500 × g. Remova o sobrenadante.
7. Ressuspenda o pellet em 200 μL de PBS + 3% de FBS e passe cada amostra por um tubo FACS com uma tampa de filtro de células. Às amostras de medula óssea e baço, adicione mais 200 μL de PBS + 3% de FBS.
8. Controles de citometria de fluxo: Faça controles de coloração única usando grânulos de compensação adicionando 100 μL de PBS, 1 gota de grânulos positivos, 1 gota de grânulos negativos e 1 μL do anticorpo a um tubo FACS. Deixe por 5 min em temperatura ambiente e adicione 300 μL de PBS. Tome 50 μL de células da medula óssea não coradas até 400 μL com PBS + 3% FBS como controle não corado.
9. Analise as amostras por citometria de fluxo.
   1. Execute controles de coloração única e não corados para compensação, conforme recomendado para o citômetro usado. Configure o gating como na Figura 3A.
   2. Para PB, execute todas as células e para medula óssea e baço, execute um mínimo de 50.000 eventos por amostra, dependendo dos níveis de enxerto humano.

Resultados

O enxerto das células injetadas intrafemoralmente pode ser avaliado a qualquer momento a partir de 24 horas, dependendo do desenho experimental. No final do tempo, IF, BM, PB e baços podem ser coletados. Estes podem ser processados e o nível de enxerto avaliado por citometria de fluxo. Para chamar de forma robusta o enxerto humano, mesmo em níveis baixos, coramos com dois anticorpos distintos contra CD45 humano (clone HI30 e clone 2D1). Apenas as células positivas para ambos os anti...

Discussão

As injeções intrafemorais são uma ferramenta útil no xenotransplante quando apenas um pequeno número de HSPCs está disponível, proporcionando melhor enxerto em comparação com as injeções intravenosas. No entanto, a técnica requer destreza e treinamento. Ao praticar, recomendamos o uso de cadáveres frescos da faixa de peso correta (veja abaixo) e a injeção de um corante colorido (como azul de tripano) para que, após a dissecção, fique claro se a injeção entrou no fêmu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169