Injeção intrafemoral de células-tronco hematopoiéticas humanas e progenitoras em camundongos imunocomprometidos

Resumo

As injeções intrafemorais permitem o enxerto de um pequeno número de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas (HSPCs), colocando as células diretamente na cavidade da medula óssea. Aqui descrevemos um protocolo experimental de injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes.

Resumo

As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) são definidas por sua capacidade vitalícia de produzir todos os tipos de células sanguíneas. Isso é testado operacionalmente transplantando populações de células contendo HSCs em camundongos singênicos ou imunocomprometidos. O tamanho e a composição multilinhagem do enxerto são então medidos ao longo do tempo, geralmente por citometria de fluxo. Classicamente, uma população contendo HSCs é injetada na circulação do animal, após o que as HSCs abrigam a medula óssea, onde se alojam e iniciam a produção de sangue. Alternativamente, HSCs e / ou células progenitoras (HSPCs) podem ser colocadas diretamente na cavidade da medula óssea.

Este artigo descreve um protocolo para injeção intrafemoral de HSPCs humanos em camundongos imunodeficientes. Em suma, os camundongos pré-condicionados são anestesiados e um pequeno orifício é perfurado no joelho até o fêmur usando uma agulha. Usando uma agulha de insulina menor, as células são injetadas diretamente no mesmo conduíte criado pela primeira agulha. Este método de transplante pode ser aplicado em projetos experimentais variados, usando células de camundongos ou humanas como células doadoras. Tem sido mais amplamente utilizado para xenotransplante, porque, neste contexto, acredita-se que forneça enxerto aprimorado em relação às injeções intravenosas, melhorando assim o poder estatístico e reduzindo o número de camundongos a serem usados.

Introdução

O sangue tem uma das maiores taxas de regeneração do corpo humano, produzindo 1 × 10¹² células por dia na medula óssea humana adulta¹. As células-tronco hematopoiéticas (HSCs) garantem a produção de sangue ao longo da vida pelo processo de hematopoiese e são definidas por sua capacidade de produzir todos os tipos de células sanguíneas (multipotencialidade) enquanto se mantêm (auto-renovação). Historicamente, o padrão-ouro para testar a função de um HSC sempre se baseou no transplante, testando a capacidade de uma população de doadores de reconstituir todas as linhagens sanguíneas de um camundongo a l....

Protocolo

Todas as pesquisas com animais apresentadas aqui aderem aos Regulamentos de Emenda da Lei de Animais (Procedimentos Científicos) de 1986 de 2012 e foram realizadas após revisão ética e aprovação pelo Órgão de Revisão Ética e Bem-Estar Animal da Universidade de Cambridge (AWERB). Aceno feminino. Camundongos Cg-Prkdc^scidIl2rg^tm1Wjl/SzJ (NSG), com idade entre 12 e 16 semanas (~21-30 g), criados internamente e mantidos em uma instalação animal livre de patógenos específicos, foram usados para injeções intrafemorais. Amostras de CB não identificadas foram coletadas de doadores saudáveis após consentimento informado do....

Discussão

As injeções intrafemorais são uma ferramenta útil no xenotransplante quando apenas um pequeno número de HSPCs está disponível, proporcionando melhor enxerto em comparação com as injeções intravenosas. No entanto, a técnica requer destreza e treinamento. Ao praticar, recomendamos o uso de cadáveres frescos da faixa de peso correta (veja abaixo) e a injeção de um corante colorido (como azul de tripano) para que, após a dissecção, fique claro se a injeção entrou no fêmu.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL Insulin Syringe with 29 G x 12.7 mm Needle	BD	324892
1 mL Insulin Syringe with 29 G x 0.5" Needle	BD	324827
1.5 mL tube	Fisherbrand	509-GRD-PFB
3 mL syringe	HENKE SASS WOLF GMBH	4020.000V0
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm	Falcon	352235	FACS tube
5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube with Snap Cap 12 x 75 mm	Falcon	352058	FACS tube
27 G 1/2" needle	BD	300635
40 µm cell strainer for 50 mL tube	Greiner Bio-one	542040
50 mL tube	Sarstedt Ltd	62.547.254
96 well round-bottom plate	Falcon	351177
Alcohol Swab	VITREX MEDICAL A/S	520213
BD LSR Fortessa X-20 Cell Analyzer	BD		flow cytometer
Buphrenorphine	Animalcare	XVD190
CD14/PECy7 (Clone M5E2)	biolegend	301814	Used at 1 in 1000
CD19/Alexa 700 (Clone HIB19)	biolegend	302226	Used at 1 in 300
CD19/FITC (Clone HIB19)	biolegend	302206	Used at 1 in 200
CD3/APCCy7 (Clone HIT3a)	biolegend	300318	Used at 1 in 100
CD33/APC (Clone P67.6)	BD	345800	Used at 1 in 200
CD45/BV510 (Clone HI30)	biolegend	304036	Used at 1 in 500
CD45/PECy5 (Clone 2D1)	biolegend	368526	Used at 1 in 300
CompBeads Anti-Mouse Ig, κ/Negative Control Compensation Particles Set	BD	552843
Dnase 1	Worthington Biochemical	LS002139
Fetal Bovine Serum (FBS)	PAN-Biotech	P40-37500
Glycophorin A (GlyA)/PE (Clone GA-R2)	BD	340947	Used at 1 in 1000
Iscove Modified Dulbecco Media (IMDM)	PAN-Biotech	P04-20250
Isoflurane (IsoFlo 100% w/w Inhalation Vapor, liquid)	Zoetis	115095
Microvette 300 Lithium heparin LH, 300 µL	Sarstedt Ltd	20.1309	Mouse blood collection tube
NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG) mice	Charles River
Pancoll human, Density: 1.077 g/mL	PAN-Biotech	P04-60500
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Gibco	14190169