Ensamblaje de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula

Resumen

Este artículo presenta un procedimiento experimental detallado para la reconstitución de ataduras de ADN que contienen nucleosomas para microscopía de fuerza correlativa y fluorescencia de una sola molécula. Además, describe varios experimentos posteriores que se pueden llevar a cabo para visualizar el comportamiento de unión de las proteínas que interactúan con la cromatina y analizar los cambios en las propiedades físicas de los nucleosomas.

Resumen

Los nucleosomas constituyen la unidad primaria de la cromatina eucariota y han sido objeto de numerosas investigaciones informativas sobre moléculas individuales con respecto a sus propiedades biofísicas e interacciones con las proteínas de unión a la cromatina. La reconstitución de nucleosomas en el ADN para estos estudios generalmente implica un procedimiento de diálisis salina que proporciona un control preciso sobre la ubicación y el número de nucleosomas formados a lo largo de una correa de ADN. Sin embargo, este protocolo requiere mucho tiempo y requiere una cantidad sustancial de cadencia de ADN e histonas como entradas. Para ofrecer una estrategia alternativa, se describe un método de reconstitución de nucleosomas in situ para microscopía de fuerza y fluorescencia de una sola molécula que utiliza la chaperona de histonas Nap1. Este método permite a los usuarios ensamblar nucleosomas en cualquier molde de ADN sin la necesidad de secuencias de posicionamiento de nucleosomas fuertes, ajustar la densidad de nucleosomas a pedido y usar menos reactivos. La formación de nucleosomas in situ se produce en cuestión de segundos, lo que ofrece un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición cómoda a las mediciones de una sola molécula. Se describen con más detalle ejemplos de dos ensayos posteriores para sondear la mecánica de los nucleosomas y visualizar el comportamiento de las proteínas individuales en la cromatina.

Introducción

La unidad de empaquetamiento primario de la cromatina eucariota es el nucleosoma, en el que ~ 147 pares de bases (bps) de ADN se envuelven alrededor de un octámero de proteínas histonas^{centrales 1,2}. Además del empaquetamiento del genoma, la arquitectura del nucleosoma sirve como otra rica capa de regulación biofísica que puede ser aprovechada por las proteínas de unión a la cromatina cuando realizan sus diversas funciones ^3,4. El acceso experimental y la medición de las características físicas de los nucleosomas ha si....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Preparación de ADN biotinilado

1. Prepare una reacción de volumen de 120 μL que contenga 20 μg de λ ADN, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow y 1x NEB Buffer 2.
   NOTA: Este procedimiento utiliza específicamente ADN genómico lineal de doble cadena (ds) bacteriófago λ libre de metilación (48.502 bps), que contiene 12 nucleótidos (nt) 5' de ADN monocatenario (ss)^salient....

Discusión

El protocolo descrito proporciona varias ventajas para la reconstitución de nucleosomas, incluida la minimización de los reactivos y el tiempo, así como la habilitación de la formación de nucleosomas dependientes de chaperonas a lo largo de cualquier secuencia de ADN (potencialmente nativa). Además, el método in situ permite un flujo de trabajo experimental más sencillo y una transición conveniente hacia ensayos de una sola molécula de la mecánica de nucleosomas y la .......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate