Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Résumé

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Résumé

Les nucléosomes constituent l’unité primaire de la chromatine eucaryote et ont fait l’objet de nombreuses études informatives sur des molécules uniques concernant leurs propriétés biophysiques et leurs interactions avec les protéines de liaison à la chromatine. La reconstitution des nucléosomes sur l’ADN pour ces études implique généralement une procédure de dialyse au sel qui fournit un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes formés le long d’un lien d’ADN. Cependant, ce protocole prend du temps et nécessite une quantité substantielle d’ADN et d’octamères d’histones comme entrées. Pour offrir une stratégie alternative, une méthode de reconstitution in situ des nucléosomes pour la microscopie à force de force et de fluorescence à molécule unique qui utilise le chaperon d’histones Nap1 est décrite. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur n’importe quelle matrice d’ADN sans avoir besoin de fortes séquences de positionnement de nucléosomes, d’ajuster la densité des nucléosomes à la demande et d’utiliser moins de réactifs. La formation de nucléosomes in situ se produit en quelques secondes, offrant un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des mesures à molécule unique. Des exemples de deux tests en aval pour sonder la mécanique des nucléosomes et visualiser le comportement de protéines individuelles sur la chromatine sont décrits plus en détail.

Introduction

L’unité d’emballage primaire de la chromatine eucaryote est le nucléosome, dans lequel ~147 paires de bases (pb) d’ADN sont enroulées autour d’un octamère des protéines^{d’histones centrales 1,2}. En plus de l’empaquetage du génome, l’architecture des nucléosomes sert d’autre couche riche de régulation biophysique qui peut être exploitée par les protéines de liaison à la chromatine lors de l’exécution de leurs diverses fonctions ^3,4. L’accès expérimental et la mesure des caractéristiques physiques des nucléosomes ont été techniquement difficiles, car ces unités fonctionnent à des échelles minuscules (par exemple, longueurs nanométriques, forces du piconewton), et donc, leur sondage nécessite une sensibilité et une précision suffisantes pour informer de manière significative la fonction. De plus, les protéines de liaison à la chromatine interagissent souvent avec leurs substrats de manière transitoire, et la plupart des approches d’ensemble manquent de résolution temporelle appropriée pour informer la cinétique de ces interactions⁵. Heureusement, l’avènement des techniques à molécule unique a permis de visualiser et de manipuler des protéines individuelles et leurs interactions en temps réel, révélant des informations mécanistes sur ces événements moléculaires se produisant à l’échelle nanométrique⁶. En particulier, la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique (smCFFM) exploite à la fois la détection de fluorescence à haute résolution et les outils de manipulation de force pour résoudre simultanément la mécanique, la composition et la coordination de la chromatine et des complexes chromatine-protéine ^7,8.

Dans le smCFFM qui utilise spécifiquement des « pinces optiques » comme méthode de manipulation de force, un laser à focalisation serrée est utilisé pour piéger un objet diélectrique, généralement une bille de plastique de la taille d’un micron, en trois dimensions⁹. Un biopolymère tel qu’un morceau d’ADN peut être conjugué à la bille (via, par exemple, la liaison streptavidine-biotine, digoxigénine-anti-digoxigénine), et l’utilisateur peut à la fois appliquer une force calibrée et mesurer la force/déplacement généré par le système¹⁰. Le module de fluorescence ajouté permet une imagerie de fluorescence multicolore simultanée pour suivre la composition et le comportement des protéines.

La méthode principale de reconstitution de matrices de nucléosomes pour le smCFFM consiste à assembler des nucléosomes sur des matrices d’ADN personnalisées par dialyse au sel 11,12,13. Dans cette procédure, des octamères d’histones purifiés sont incubés avec des matrices d’ADN dans un tampon à haute teneur en sel (~1 M de chlorure de sodium), et à mesure que le sel est lentement dialysé, les nucléosomes s’assemblent spontanément sur l’ADN d’une manière positionnelle dépendante de la séquence^14,15. En tant que tel, il est habituel que des séquences de positionnement de nucléosomes fortes (par exemple, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S^{rDNA 17}) soient incorporées dans les matrices d’ADN pour générer des réseaux de nucléosomes personnalisés. Bien que cette méthode bien établie offre un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes dans l’ADN, elle souffre de plusieurs inconvénients : (1) l’incorporation de séquences d’ADN à positionnement fort des nucléosomes peut générer des nucléosomes artificiellement stables qui biaisent l’activité des protéines de liaison à la chromatine, (2) le processus de dialyse au sel pour la formation des nucléosomes nécessite de grandes quantités d’ADN et d’octamères, et (3) la procédure prend un à plusieurs jours de travail ainsi qu’un effort considérable pour titrer le rapport ADN/octamère correct pour une densité optimale de réseau de nucléosomes.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode alternative pour former des nucléosomes le long de l’ADN in situ dans un microscope à force corrélative et à fluorescence à molécule unique en utilisant le chaperon d’histones recombinant Nap1, qui ressemble à la voie physiologique de la formation des nucléosomes in vivo 18,19,20,21,22. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur des séquences d’ADN non spécifiques, d’ajuster facilement la densité des nucléosomes et d’utiliser beaucoup moins de réactifs, le tout en quelques minutes. De plus, la formation d’attaches d’ADN nucléosomale in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et la commodité de la visualisation et de la manipulation intégrées de molécules uniques. Ainsi, lorsque le positionnement uniforme et spécifique des nucléosomes n’est pas une nécessité, ce protocole offre une option utile pour l’étude de la mécanique des nucléosomes ou du comportement des protéines sur la chromatine, pour lesquels nous décrivons également des exemples de dosages.

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’ADN biotinylé

1. Préparez une réaction volumique de 120 μL contenant 20 μg d’ADN λ, 33 μM de biotine-dCTP, 33 μM de biotine-dUTP, 33 μM de biotine-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unités d’enzyme Klenow et 1 tampon NEB 2.
   REMARQUE : Cette procédure utilise spécifiquement de l’ADN génomique linéaire double brin (ds) sans méthylation du bactériophage λ (48 502 bps), qui contient 12 nucléotides (nt) 5' monocaténaire (ss)²³. Cependant, le protocole peut être adapté pour utiliser n’importe quelle longueur ou séquence d’ADNdb linéaire à condition qu’il contienne au moins plusieurs nts de surplombs ss 5', la longueur et la séquence nt dictant le nombre de nts biotinylés installés à chaque extrémité pour l’attache en aval entre les pièges optiques. De plus, la réaction peut être réduite. Par exemple, 5 μg d’ADN peuvent être utilisés dans une réaction de 30 μL de volume. De plus, les substrats d’ADN générés de cette manière ne sont pas contraints en torsion. Pour les protocoles permettant de créer de l’ADN sous contrainte de torsion, veuillez vous référer aux rapports publiés précédemment^24,25.
2. Incuber la réaction à température ambiante pendant 15 min.
3. Ajouter 10 mM d’EDTA et incuber à 75 °C pendant 20 min.
4. Effectuer une précipitation de l’éthanol pour obtenir le produit d’ADN biotinylé.
   1. Ajouter 0,1 volume d’acétate de sodium 3 M et 3 volume d’éthanol 100 % glacé. Conserver à -20 °C pendant au moins 1 h jusqu’à toute la nuit. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 30 min à 4 °C.
   2. Retirez délicatement le surnageant sans déranger la pastille et ajoutez 1 ml d’éthanol à 75 %. Centrifugeuse à 13 500 x g pendant 1 min à 4 °C.
   3. Répétez les étapes d’élimination du surnageant, d’ajout d’éthanol et de centrifugation.
   4. Retirez soigneusement tout le surnageant et laissez sécher les granulés à l’air libre pendant 10 min. Dissoudre la pastille dans 100-200 μL de tampon TE ou ddH₂O (peut incuber à 37 °C pour faciliter la dissolution). Mesurez la concentration à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop.

2. Préparation des canaux dans une cellule d’écoulement

REMARQUE : Cette procédure est basée sur une puce microfluidique disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) mais peut être adaptée à tout instrument smCFFM doté d’une cellule d’écoulement multicanaux.

1. Canaux passivants (ch.) 4 et 5 (ou n’importe quel canal contenant des protéines) (voir schéma des canaux dans la figure 1A). Ajouter 500 μL de BSA à 0,1 % dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar (~0,45 μL/s pour un tube d’un diamètre intérieur de 0,010 pouce) pendant 8 min. Retirer la solution.
2. Ajouter 500 μL de Pluronic-F127 à 0,05 % dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar pendant 8 min. Retirez la solution et rincez les seringues avec 1x PBS. Ajouter 2 mL de 1x PBS dans chaque canal et laisser couler à 0,8 bar pendant 27 min.
3. Vortex la solution mère de billes enrobées de streptavidine (cette procédure utilise des billes de 3,13 μm) et ajoutez 2,15 μL de la solution de billes à 1 mL de 1x PBS. Ajouter au ch. 1.
   REMARQUE : La taille et la concentration des billes enrobées de streptavidine peuvent être ajustées selon les préférences de l’utilisateur.
4. Ajoutez 30 à 80 ng d’ADN λ biotinylé à 1 ml de PBS 1x. Ajouter au ch. 2.
   REMARQUE : La concentration d’ADN biotinylé peut être ajustée selon les préférences de l’utilisateur. De plus grandes quantités d’ADN augmenteront la fréquence de formation des attaches d’ADN, mais augmenteront également la fréquence de l’attache de plusieurs molécules d’ADN à la fois, ce qui peut ajouter à la difficulté de l’expérience.

3. Formation de nucléosomes in situ médiée par Nap1

1. Ajouter 500 μL de tampon d’image sans protéines au chapitre 3.
   REMARQUE : La composition tampon du chapitre 3 est flexible et devrait convenir à la fois aux nucléosomes et à la ou aux protéines spécifiques d’intérêt. En option, les utilisateurs peuvent choisir d’ajouter des systèmes de piégeage de l’oxygène pour réduire le photoblanchiment des fluorophores et/ou de l’ADN concurrent pour éliminer les octamères d’histones qui ne sont pas correctement enveloppés dans les nucléosomes.
2. Ajouter 2 nM de S. cerevisiae Nap1 et 2-5 nM d’octamère d’histones H4 (HO) marqué au LD655 à 500 μL de 1x tampon HR¹⁸. Ajouter au ch. 4.
   REMARQUE : Les octamères d’histone et le Nap1 peuvent être achetés dans le commerce ou préparés sur place (voir le tableau des matériaux). Le nombre de nucléosomes à former le long de chaque ADN attaché dépend de la concentration d’octamères ainsi que du temps passé dans ce canal. La densité nucléologique souhaitée et approximative de l’utilisateur le long de chaque molécule d’ADN peut être modulée en ajustant l’un ou l’autre de ces paramètres ou les deux. De plus, l’utilisateur peut choisir d’étiqueter les octamères d’histones avec son fluorophore préféré.
3. Facultatif : Ajouter la protéine de liaison à la chromatine ou une autre protéine d’intérêt au chapitre 5 dans un tampon approprié.
4. Écoulement de tous les canaux à 1,0 bar (~0,55 μL/s dans la configuration expérimentale actuelle) pendant 30 s pour rincer les canaux de la cellule d’écoulement avec des échantillons.
5. Réglez le débit à 0,2 bar (~0,16 μL/s dans la configuration expérimentale actuelle). Déplacez les pièges optiques (OT) vers le canal 1 et attrapez une paire appropriée de billes enrobées de streptavidine.
6. Déplacez les OT sur le canal 3, effectuez un étalonnage de force pour la paire de billes, allumez le laser confocal rouge (ou une autre ligne laser de votre choix) et calibrez la zone d’imagerie.
7. Réglez le débit sur 0,2 bar et déplacez les ergothérapeutes sur le canal 2. Attrapez l’ADN biotinylé.
8. Déplacez les OT sur le ch. 3 et arrêtez le flux. Augmentez la distance entre les OT pour étirer l’ADN et surveillez la courbe force-distance (FD) associée pour confirmer la présence d’un seul lien d’ADN (par opposition à plusieurs fils). La courbe doit suivre le modèle de chaîne vermoulue pour l’ADNdb à la longueur de contour donnée²⁶.
9. Ajustez la distance entre les OT de sorte que la tension de l’ADN soit d’environ 1 pN.
   REMARQUE : Une tension de 1 pN est suffisamment faible pour permettre aux nucléosomes de rester enveloppés par l’ADN²⁷ , mais elle est suffisamment élevée pour placer la molécule d’ADN entière dans l’axe d’imagerie du balayage de ligne.
10. Activez le balayage en ligne pour commencer à collecter un kymographe avec le laser rouge allumé.
    REMARQUE : Des kymographes ou des scans 2D d’ADN attaché peuvent être obtenus, selon les préférences de l’utilisateur.
11. Déplacez les OT au ch. 4 avec le flux coupé. Grâce à Nap1, les HOs sont chargés sur l’ADN et enveloppés pour former des nucléosomes en temps réel. La charge nucléosomique est visualisée sous forme de trajectoires fluorescentes apparaissant sur l’ADN à l’intérieur des kymographes. Parallèlement, la formation de nucléosomes sur l’ADN peut être surveillée par l’augmentation de la force à mesure que davantage de HOs sont chargés lorsque les positions des OT sont maintenues constantes.
    REMARQUE : Le laser d’excitation de fluorescence peut être désactivé pendant les étapes de formation des nucléosomes pour éviter le photoblanchiment des fluorophores. De plus, la liaison non spécifique des octamères d’histones à l’ADN dans laquelle les octamères ne sont pas enveloppés dans des nucléosomes pourrait se produire à l’aide de ce protocole. Ces événements de liaison ne génèrent pas de « déchirure » lorsque l’ADN est étiré, comme décrit dans le protocole de déballage des nucléosomes (étape 4) ci-dessous, et peuvent parfois être éliminés par un léger flux tampon, en particulier si le tampon contient de l’ADN concurrent libre.
12. Lorsque le nombre approximatif souhaité de nucléosomes est formé, commencez à collecter des données.

4. Déballage des nucléosomes

1. Terminez les étapes 2 et 3.
2. Après avoir formé un lien d’ADN contenant des nucléosomes, déplacez les OT vers le canal 3.
3. Préparez-vous aux expériences de déballage de nucléosomes en réduisant la distance entre les OT jusqu’à ce que la force soit approximativement nulle. Zéro la force.
4. Commencez à éloigner l’OT 1 de l’OT 2 à une vitesse constante de 0,1 μm/s. Sur un kymographe, la perle de l’OT 1 s’éloignera visuellement de la perle de l’OT 2. Sur la courbe FD, la force augmentera à mesure que la distance augmente. Au fur et à mesure que les nucléosomes se déballent, il y aura des « déchirures » ou des transitions dans la force (~8-37 pN) qui signifient le dénouement de l’enveloppe interne des nucléosomes individuels 27,28,29.
   REMARQUE : La force à laquelle le déballage se produit dépend de la vitesse de traction, qui est attendue pour les processus hors équilibre. Parfois, plusieurs nucléosomes se déballent en même temps, produisant un changement de distance plus important dans la transition sur la courbe FD. De plus, l’effilochage de l’enveloppe externe du nucléosome n’est pas facilement visible dans ce cadre expérimental (voir la section Discussion).

5. Visualisation de la liaison des protéines à la chromatine

1. Terminez les étapes 2 et 3.
2. Ajoutez 10 nM d’histone H1.4 de linker marquée Cy3 à 500 μL de tampon d’image dans le ch. 5.
   REMARQUE : Toute protéine d’intérêt peut être ajoutée au canal 5 à une concentration de choix (généralement inférieure à 100 nM pour la visualisation d’une seule molécule).
3. Après avoir formé un lien d’ADN contenant des nucléosomes, allumez le laser vert en plus du laser rouge et déplacez les OT sur le canal 5 pour une imagerie en temps réel de la liaison de H1 à la chromatine.
4. Continuez à collecter des kymographes ou des scans jusqu’à ce que des statistiques suffisantes aient été obtenues (au moins ~10-20 kymographes selon la fréquence des événements et la difficulté expérimentale).

Résultats

À l’aide de la configuration décrite à l’étape 3 (figure 1A), la formation de nucléosomes le long du lien d’ADN a été visualisée sous la forme de foyers fluorescents rouges sur un balayage 2D (figures 1B, à gauche) ou de trajectoires dans le temps sur un kymographe (figure 1B, à droite). Des nucléosomes correctement enveloppés ont produit des trajectoires de fluorescence qui étaie...

Discussion

Le protocole décrit offre plusieurs avantages pour la reconstitution des nucléosomes, notamment la minimisation des réactifs et du temps, ainsi que la formation de nucléosomes dépendants des chaperons le long de n’importe quelle séquence d’ADN (potentiellement native). De plus, la méthode in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des dosages à molécule unique de la mécanique des nucléosomes et de l’interaction pr...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate