Assemblage de nucléosomes in situ pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence d’une molécule unique

Résumé

Cet article présente une procédure expérimentale détaillée pour reconstituer des attaches d’ADN contenant des nucléosomes pour la microscopie à force corrélative et à fluorescence à molécule unique. Il décrit en outre plusieurs expériences en aval qui peuvent être menées pour visualiser le comportement de liaison des protéines interagissant avec la chromatine et analyser les changements dans les propriétés physiques des nucléosomes.

Résumé

Les nucléosomes constituent l’unité primaire de la chromatine eucaryote et ont fait l’objet de nombreuses études informatives sur des molécules uniques concernant leurs propriétés biophysiques et leurs interactions avec les protéines de liaison à la chromatine. La reconstitution des nucléosomes sur l’ADN pour ces études implique généralement une procédure de dialyse au sel qui fournit un contrôle précis sur le placement et le nombre de nucléosomes formés le long d’un lien d’ADN. Cependant, ce protocole prend du temps et nécessite une quantité substantielle d’ADN et d’octamères d’histones comme entrées. Pour offrir une stratégie alternative, une méthode de reconstitution in situ des nucléosomes pour la microscopie à force de force et de fluorescence à molécule unique qui utilise le chaperon d’histones Nap1 est décrite. Cette méthode permet aux utilisateurs d’assembler des nucléosomes sur n’importe quelle matrice d’ADN sans avoir besoin de fortes séquences de positionnement de nucléosomes, d’ajuster la densité des nucléosomes à la demande et d’utiliser moins de réactifs. La formation de nucléosomes in situ se produit en quelques secondes, offrant un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des mesures à molécule unique. Des exemples de deux tests en aval pour sonder la mécanique des nucléosomes et visualiser le comportement de protéines individuelles sur la chromatine sont décrits plus en détail.

Introduction

L’unité d’emballage primaire de la chromatine eucaryote est le nucléosome, dans lequel ~147 paires de bases (pb) d’ADN sont enroulées autour d’un octamère des protéines^{d’histones centrales 1,2}. En plus de l’empaquetage du génome, l’architecture des nucléosomes sert d’autre couche riche de régulation biophysique qui peut être exploitée par les protéines de liaison à la chromatine lors de l’exécution de leurs diverses fonctions ^3,4. L’accès expérimental et la mesure des caractéristiques physiques des nucléosomes ont été ....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Préparation de l’ADN biotinylé

1. Préparez une réaction volumique de 120 μL contenant 20 μg d’ADN λ, 33 μM de biotine-dCTP, 33 μM de biotine-dUTP, 33 μM de biotine-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unités d’enzyme Klenow et 1 tampon NEB 2.
   REMARQUE : Cette procédure utilise spécifiquement de l’ADN génomique linéaire double brin (ds) sans méthylation du bactériophage λ (48 502 bps), qui contient 12 nucléotides (nt) 5' monocaténaire (ss)²³. C....

Discussion

Le protocole décrit offre plusieurs avantages pour la reconstitution des nucléosomes, notamment la minimisation des réactifs et du temps, ainsi que la formation de nucléosomes dépendants des chaperons le long de n’importe quelle séquence d’ADN (potentiellement native). De plus, la méthode in situ permet un flux de travail expérimental plus simple et une transition pratique vers des dosages à molécule unique de la mécanique des nucléosomes et de l’interaction pr.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate