Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье представлена подробная экспериментальная процедура восстановления нуклеосомных ДНК-тросов для одномолекулярной корреляционной силовой и флуоресцентной микроскопии. Далее описывается несколько последующих экспериментов, которые могут быть проведены для визуализации связывания белков, взаимодействующих с хроматином, и анализа изменений физических свойств нуклеосом.

Аннотация

Нуклеосомы являются первичной единицей эукариотического хроматина и были предметом многочисленных информативных исследований одномолекулярных соединений относительно их биофизических свойств и взаимодействия с хроматин-связывающими белками. Восстановление нуклеосом на ДНК для этих исследований обычно включает процедуру солевого диализа, которая обеспечивает точный контроль над размещением и количеством нуклеосом, образующихся вдоль троса ДНК. Тем не менее, этот протокол занимает много времени и требует значительного количества ДНК и гистоновых октамеров в качестве входных данных. Чтобы предложить альтернативную стратегию, описан метод восстановления нуклеосом in situ для одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии, в котором используется гистоновый шаперон Nap1. Этот метод позволяет пользователям собирать нуклеосомы на любой матрице ДНК без необходимости в строгом позиционировании нуклеосомных последовательностей, регулировать плотность нуклеосом по требованию и использовать меньшее количество реагентов. Образование нуклеосом in situ происходит в течение нескольких секунд, что упрощает экспериментальный рабочий процесс и удобный переход к измерениям на одной молекуле. Далее описываются примеры двух последующих анализов для зондирования механики нуклеосом и визуализации поведения отдельных белков на хроматине.

Введение

Первичной упаковочной единицей эукариотического хроматина является нуклеосома, в которой ~147 пар оснований (..) ДНК обернуты вокруг октамера белков ядра гистонов 1,2. В дополнение к упаковке генома, нуклеосомная архитектура служит еще одним богатым слоем биофизической регуляции, который может быть использован хроматин-связывающими белками при выполнении ими различных функций 3,4. Экспериментальный доступ к физическим характеристикам нуклеосом и их измерение были технически сложными, поскольку эти единицы работают в ме....

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Получение биотинилированной ДНК

  1. Приготовьте объемную реакцию объемом 120 мкл, содержащую 20 мкг λ ДНК, 33 мкМ биотина-dCTP, 33 мкМ биотина-dUTP, 33 мкМ биотина-dATP, 33 мкМ dGTP, 10 единиц фермента Кленоу и 1x NEB Buffer 2.
    Примечание: В данной процедуре специально используется линейная двухцепочечная (ds) геномная ДНК бактериофага λ без метилирования (48 502.с.), которая содержит 12-нуклеотидную (nt) 5'-одноцепочечную (ss) ДНК23<....

Результаты

С помощью схемы, описанной на шаге 3 (рис. 1A), формирование нуклеосом вдоль троса ДНК визуализировалось как появление красных флуоресцентных очагов на 2D-сканировании (рис. 1B, слева) или траекторий с течением времени на кимографе (

Обсуждение

Описанный протокол обеспечивает ряд преимуществ для восстановления нуклеосом, включая минимизацию реагентов и времени, а также возможность шаперон-зависимого формирования нуклеосом вдоль любой (потенциально нативной) последовательности ДНК. Кроме того, метод in si.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

G.N.L.C. выражает признательность за поддержку со стороны Национального института психического здоровья Национальных институтов здравоохранения (NIH) в рамках гранта под номером F31MH132306. С. Л. поддерживается Фондом Робертсона, Международным фондом синдрома Ретта и NIH (награда No R01GM149862).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1x HR bufferN/AN/A30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (Phosphate-buffered saline)N/AN/A137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic 
Acetic acid, glacialMillipore SigmaAX0074-6Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418-50GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, PureMillipore Sigma459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARecombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). 
Image bufferN/AN/A20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methylation-free λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)N/AN/APurified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/ADual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solutionMillipore Sigma63052-100MLUse to make HR buffer
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasicMillipore SigmaP0662Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetateMillipore Sigma241245Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasicMillipore SigmaS9763Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerFisher ScientificND2000NanoDrop Spectrophotometer
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate

Ссылки

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Crystal Richmond, T. J. structure of the nucleosome core particle at 2....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены