Сборка нуклеосом in situ для одномолекулярной корреляционно-силовой и флуоресцентной микроскопии

Резюме

В данной статье представлена подробная экспериментальная процедура восстановления нуклеосомных ДНК-тросов для одномолекулярной корреляционной силовой и флуоресцентной микроскопии. Далее описывается несколько последующих экспериментов, которые могут быть проведены для визуализации связывания белков, взаимодействующих с хроматином, и анализа изменений физических свойств нуклеосом.

Аннотация

Нуклеосомы являются первичной единицей эукариотического хроматина и были предметом многочисленных информативных исследований одномолекулярных соединений относительно их биофизических свойств и взаимодействия с хроматин-связывающими белками. Восстановление нуклеосом на ДНК для этих исследований обычно включает процедуру солевого диализа, которая обеспечивает точный контроль над размещением и количеством нуклеосом, образующихся вдоль троса ДНК. Тем не менее, этот протокол занимает много времени и требует значительного количества ДНК и гистоновых октамеров в качестве входных данных. Чтобы предложить альтернативную стратегию, описан метод восстановления нуклеосом in situ для одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии, в котором используется гистоновый шаперон Nap1. Этот метод позволяет пользователям собирать нуклеосомы на любой матрице ДНК без необходимости в строгом позиционировании нуклеосомных последовательностей, регулировать плотность нуклеосом по требованию и использовать меньшее количество реагентов. Образование нуклеосом in situ происходит в течение нескольких секунд, что упрощает экспериментальный рабочий процесс и удобный переход к измерениям на одной молекуле. Далее описываются примеры двух последующих анализов для зондирования механики нуклеосом и визуализации поведения отдельных белков на хроматине.

Введение

Первичной упаковочной единицей эукариотического хроматина является нуклеосома, в которой ~147 пар оснований (..) ДНК обернуты вокруг октамера белков ядра гистонов ^1,2. В дополнение к упаковке генома, нуклеосомная архитектура служит еще одним богатым слоем биофизической регуляции, который может быть использован хроматин-связывающими белками при выполнении ими различных функций ^3,4. Экспериментальный доступ к физическим характеристикам нуклеосом и их измерение были технически сложными, поскольку эти единицы работают в ме....

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Получение биотинилированной ДНК

1. Приготовьте объемную реакцию объемом 120 мкл, содержащую 20 мкг λ ДНК, 33 мкМ биотина-dCTP, 33 мкМ биотина-dUTP, 33 мкМ биотина-dATP, 33 мкМ dGTP, 10 единиц фермента Кленоу и 1x NEB Buffer 2.
   Примечание: В данной процедуре специально используется линейная двухцепочечная (ds) геномная ДНК бактериофага λ без метилирования (48 502.с.), которая содержит 12-нуклеотидную (nt) 5'-одноцепочечную (ss) ДНК^23<....

Результаты

С помощью схемы, описанной на шаге 3 (рис. 1A), формирование нуклеосом вдоль троса ДНК визуализировалось как появление красных флуоресцентных очагов на 2D-сканировании (рис. 1B, слева) или траекторий с течением времени на кимографе (

Обсуждение

Описанный протокол обеспечивает ряд преимуществ для восстановления нуклеосом, включая минимизацию реагентов и времени, а также возможность шаперон-зависимого формирования нуклеосом вдоль любой (потенциально нативной) последовательности ДНК. Кроме того, метод in si.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate