Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной статье представлена подробная экспериментальная процедура восстановления нуклеосомных ДНК-тросов для одномолекулярной корреляционной силовой и флуоресцентной микроскопии. Далее описывается несколько последующих экспериментов, которые могут быть проведены для визуализации связывания белков, взаимодействующих с хроматином, и анализа изменений физических свойств нуклеосом.
Нуклеосомы являются первичной единицей эукариотического хроматина и были предметом многочисленных информативных исследований одномолекулярных соединений относительно их биофизических свойств и взаимодействия с хроматин-связывающими белками. Восстановление нуклеосом на ДНК для этих исследований обычно включает процедуру солевого диализа, которая обеспечивает точный контроль над размещением и количеством нуклеосом, образующихся вдоль троса ДНК. Тем не менее, этот протокол занимает много времени и требует значительного количества ДНК и гистоновых октамеров в качестве входных данных. Чтобы предложить альтернативную стратегию, описан метод восстановления нуклеосом in situ для одномолекулярной силовой и флуоресцентной микроскопии, в котором используется гистоновый шаперон Nap1. Этот метод позволяет пользователям собирать нуклеосомы на любой матрице ДНК без необходимости в строгом позиционировании нуклеосомных последовательностей, регулировать плотность нуклеосом по требованию и использовать меньшее количество реагентов. Образование нуклеосом in situ происходит в течение нескольких секунд, что упрощает экспериментальный рабочий процесс и удобный переход к измерениям на одной молекуле. Далее описываются примеры двух последующих анализов для зондирования механики нуклеосом и визуализации поведения отдельных белков на хроматине.
Первичной упаковочной единицей эукариотического хроматина является нуклеосома, в которой ~147 пар оснований (..) ДНК обернуты вокруг октамера белков ядра гистонов 1,2. В дополнение к упаковке генома, нуклеосомная архитектура служит еще одним богатым слоем биофизической регуляции, который может быть использован хроматин-связывающими белками при выполнении ими различных функций 3,4. Экспериментальный доступ к физическим характеристикам нуклеосом и их измерение были технически сложными, поскольку эти единицы работают в ме....
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованном в исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Получение биотинилированной ДНК
С помощью схемы, описанной на шаге 3 (рис. 1A), формирование нуклеосом вдоль троса ДНК визуализировалось как появление красных флуоресцентных очагов на 2D-сканировании (рис. 1B, слева) или траекторий с течением времени на кимографе (
Описанный протокол обеспечивает ряд преимуществ для восстановления нуклеосом, включая минимизацию реагентов и времени, а также возможность шаперон-зависимого формирования нуклеосом вдоль любой (потенциально нативной) последовательности ДНК. Кроме того, метод in si.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
G.N.L.C. выражает признательность за поддержку со стороны Национального института психического здоровья Национальных институтов здравоохранения (NIH) в рамках гранта под номером F31MH132306. С. Л. поддерживается Фондом Робертсона, Международным фондом синдрома Ретта и NIH (награда No R01GM149862).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x HR buffer | N/A | N/A | 30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA |
1x PBS (Phosphate-buffered saline) | N/A | N/A | 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic |
Acetic acid, glacial | Millipore Sigma | AX0074-6 | Use to make tris acetate |
Biotin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-BIOX-S | |
Biotin-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
Biotin-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9418-50G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye | Cytiva | PA23031 | Maleimide functionalized Cy3 fluorophore |
dGTP | New England Biolabs | N0442S | |
Eppendorf Centrifuge 5425 R | Fisher Scientific | 05-414-051 | Benchtop centrifuge with cooling |
Ethyl alcohol, Pure | Millipore Sigma | 459844 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | E9884 | Dissolve in H2O to 0.5 M |
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) | N/A | N/A | Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). |
Image buffer | N/A | N/A | 20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride |
Klenow Fragment (3' to 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
Lambda DNA (dam-, dcm-) | Thermo Fisher Scientific | SD0021 | Methylation-free λ DNA |
LD655-MAL | Lumidyne Technologies | 9 | Maleimide functionalized LD655 fluorophore |
Linker histone H1.4 (A4C) | N/A | N/A | Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38) |
LUMICKS C-Trap Dymo | LUMICKS | N/A | Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer |
Magnesium acetate solution | Millipore Sigma | 63052-100ML | Use to make HR buffer |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Included with Klenow Fragment kit |
Pluronic F-127 | Millipore Sigma | P2443-250G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P3911 | Use to make PBS and HR buffer |
Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | Use to make PBS |
S. cerevisiae Nap1 | N/A | N/A | Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif). |
Sodium acetate | Millipore Sigma | 241245 | Dissolve in H2O to 3 M |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | Use to make PBS and image buffer |
Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | S9763 | Use to make PBS |
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm) | Spherotech | TP-30-5 | |
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Fisher Scientific | ND2000 | NanoDrop Spectrophotometer |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены