Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Riepilogo

Questo articolo presenta una procedura sperimentale dettagliata per la ricostituzione di cavi di DNA contenenti nucleosomi per la forza correlativa a singola molecola e la microscopia a fluorescenza. Descrive inoltre diversi esperimenti a valle che possono essere condotti per visualizzare il comportamento di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina e analizzare i cambiamenti nelle proprietà fisiche dei nucleosomi.

Abstract

I nucleosomi costituiscono l'unità primaria della cromatina eucariotica e sono stati al centro di numerose indagini informative su singole molecole riguardanti le loro proprietà biofisiche e le interazioni con le proteine leganti la cromatina. La ricostituzione dei nucleosomi sul DNA per questi studi comporta tipicamente una procedura di dialisi a sale che fornisce un controllo preciso sul posizionamento e sul numero di nucleosomi formati lungo un cavo di DNA. Tuttavia, questo protocollo richiede molto tempo e richiede una notevole quantità di DNA e ottameri istonici come input. Per offrire una strategia alternativa, viene descritto un metodo di ricostituzione nucleosomiale in situ per la forza di una singola molecola e la microscopia a fluorescenza che utilizza l'istone chaperone Nap1. Questo metodo consente agli utenti di assemblare nucleosomi su qualsiasi modello di DNA senza la necessità di forti sequenze di posizionamento dei nucleosomi, regolare la densità dei nucleosomi su richiesta e utilizzare meno reagenti. La formazione dei nucleosomi in situ avviene in pochi secondi, offrendo un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso le misure di singole molecole. Vengono ulteriormente descritti esempi di due saggi a valle per sondare la meccanica dei nucleosomi e visualizzare il comportamento di singole proteine sulla cromatina.

Introduzione

L'unità di confezionamento primaria della cromatina eucariotica è il nucleosoma, in cui ~147 coppie di basi (bps) di DNA sono avvolte attorno a un ottamero^{di proteine} istoniche ^1,2. Oltre all'impacchettamento del genoma, l'architettura del nucleosoma funge da un altro ricco strato di regolazione biofisica che può essere sfruttato dalle proteine leganti la cromatina durante l'esecuzione delle loro varie funzioni ^3,4. L'accesso sperimentale e la misurazione delle caratteristiche fisiche dei nucleosomi è stato tecnicamente impegnativo poiché queste unità si comportano su scale minuscole (ad esempio, lunghezze nanometriche, forze di piconewton) e, quindi, il loro sondaggio richiede una sensibilità e una precisione sufficienti per informare in modo significativo la funzione. Inoltre, le proteine leganti la cromatina spesso interagiscono con i loro substrati in modo transitorio e la maggior parte degli approcci d'insieme manca di un'adeguata risoluzione temporale per informare la cinetica di queste interazioni⁵. Fortunatamente, l'avvento delle tecniche a singola molecola ha reso possibile visualizzare e manipolare singole proteine e le loro interazioni in tempo reale, rivelando informazioni meccanicistiche su questi eventi molecolari che si verificano su scala nanometrica⁶. In particolare, la microscopia a fluorescenza e forza correlativa a singola molecola (smCFFM) sfrutta sia il rilevamento della fluorescenza ad alta risoluzione che gli strumenti di manipolazione della forza per risolvere simultaneamente la meccanica, la composizione e la coordinazione della cromatina e dei complessi cromatina-proteina ^7,8.

Nell'smCFFM che impiega specificamente "pinzette ottiche" come metodo di manipolazione della forza, un laser strettamente focalizzato viene utilizzato per intrappolare un oggetto dielettrico, tipicamente una perlina di plastica di dimensioni micron, in tre dimensioni⁹. Un biopolimero come un pezzo di DNA può essere coniugato alla perlina (tramite, ad esempio, streptavidina-biotina, digossigenina-anti-digossigenina) e l'utente può applicare una forza calibrata e misurare la forza/spostamento generata dal sistema¹⁰. Il modulo di fluorescenza aggiunto consente l'imaging a fluorescenza multicolore simultaneo per monitorare la composizione e il comportamento delle proteine.

Il metodo tradizionale per la ricostituzione dei modelli di nucleosomi per smCFFM prevede l'assemblaggio di nucleosomi su modelli di DNA personalizzati mediante dialisi a sale 11,12,13. In questa procedura, gli ottameri istonici purificati vengono incubati con modelli di DNA in un tampone ad alto contenuto di sale (~1 M di cloruro di sodio) e, mentre il sale viene lentamente dializzato, i nucleosomi si assemblano spontaneamente sul DNA in modo posizionale sequenziale-dipendente^14,15. Pertanto, è consuetudine che sequenze di posizionamento dei nucleosomi forti (ad esempio, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷) siano incorporate all'interno dei modelli di DNA per generare array di nucleosomi personalizzati. Sebbene questo metodo consolidato offra un controllo preciso sul posizionamento e sul numero di nucleosomi nel DNA, soffre di diversi svantaggi: (1) l'incorporazione di sequenze di DNA di posizionamento dei nucleosomi forti può generare nucleosomi artificialmente stabili che influenzano l'attività delle proteine leganti la cromatina, (2) il processo di dialisi salina per la formazione dei nucleosomi richiede elevate quantità di DNA e ottsomeri, e (3) la procedura richiede da uno a diversi giorni di lavoro, nonché uno sforzo considerevole per titolare il corretto rapporto DNA/ottamero per una densità ottimale dell'array di nucleosomi.

In questo manoscritto, descriviamo un metodo alternativo per formare nucleosomi lungo il DNA in situ all'interno di una forza correlativa a singola molecola e microscopio a fluorescenza utilizzando l'istone ricombinante chaperone Nap1, che assomiglia al percorso fisiologico della formazione dei nucleosomi in vivo 18,19,20,21,22. Questo metodo consente agli utenti di assemblare nucleosomi su sequenze di DNA non specifiche, regolare facilmente la densità dei nucleosomi e utilizzare quantità significativamente inferiori di reagenti, il tutto in pochi minuti. Inoltre, la formazione di cavi di DNA nucleosomico in situ consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e la comodità della visualizzazione e della manipolazione di singole molecole integrate. Pertanto, quando il posizionamento uniforme e specifico dei nucleosomi non è una necessità, questo protocollo offre un'opzione utile per lo studio della meccanica dei nucleosomi o del comportamento delle proteine sulla cromatina, per i quali descriviamo anche saggi di esempio.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione del DNA biotinilato

1. Preparare una reazione in volume da 120 μL contenente 20 μg di λ DNA, 33 μM di biotina-dCTP, 33 μM di biotina-dUTP, 33 μM di biotina-dATP, 33 μM di dGTP, 10 unità di enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
   NOTA: Questa procedura utilizza specificamente il DNA genomico λ del batteriofago lineare a doppio filamento (ds) privo di metilazione (48.502 bps), che contiene 12 nucleotidi (nt) 5' sporgenza di DNA a singolo filamento (ss)²³. Tuttavia, il protocollo può essere adattato per utilizzare qualsiasi lunghezza o sequenza di dsDNA lineare, a condizione che contenga almeno diversi nt di sporgenze di ss 5', la lunghezza e la sequenza nt determinano il numero di nt biotinilati installati su ciascuna estremità per il tethering a valle tra trappole ottiche. Inoltre, la reazione può essere ridimensionata. Ad esempio, 5 μg di DNA possono essere utilizzati in una reazione di volume di 30 μl. Inoltre, i substrati di DNA generati in questo modo non sono vincolati torsionalmente. Per i protocolli per la creazione di DNA vincolato alla torsione, fare riferimento ai rapporti precedentemente pubblicati^24,25.
2. Incubare la reazione a temperatura ambiente per 15 minuti.
3. Aggiungere 10 mM di EDTA e incubare a 75 °C per 20 minuti.
4. Eseguire la precipitazione dell'etanolo per ottenere il prodotto del DNA biotinilato.
   1. Aggiungi 0,1 volte il volume di acetato di sodio 3 M e 3 volte il volume di etanolo al 100% ghiacciato. Conservare a -20 °C per almeno 1 ora fino a tutta la notte. Centrifugare a 13.500 x g per 30 min a 4 °C.
   2. Rimuovere con cautela il surnatante senza disturbare il pellet e aggiungere 1 mL di etanolo al 75%. Centrifugare a 13.500 x g per 1 min a 4 °C.
   3. Ripetere le fasi di rimozione del surnatante, aggiunta di etanolo e centrifugazione.
   4. Rimuovere con cura tutto il surnatante e lasciare asciugare il pellet all'aria per 10 minuti. Sciogliere il pellet in 100-200 μL di tampone TE o ddH₂O (può incubare a 37 °C per facilitare la dissoluzione). Misurare la concentrazione utilizzando uno spettrofotometro Nanodrop.

2. Preparazione dei canali in una cella a flusso

NOTA: Questa procedura si basa su un chip microfluidico disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) ma può essere adattata a qualsiasi strumento smCFFM con una cella di flusso multicanale.

1. Passivare i canali (cap.) 4 e 5 (o qualsiasi canale che contenga proteine) (vedere lo schema dei canali in Figura 1A). Aggiungere 500 μl di BSA allo 0,1% in ciascun canale e fluire a 0,8 bar (~0,45 μl/s per tubi con un diametro interno di 0,010 pollici) per 8 minuti. Rimuovere la soluzione.
2. Aggiungere 500 μl di Pluronic-F127 allo 0,05% a ciascun canale e far fluire a 0,8 bar per 8 minuti. Rimuovere la soluzione e sciacquare le siringhe con 1x PBS. Aggiungere 2 mL di 1x PBS a ciascun canale e fluire a 0,8 bar per 27 min.
3. Agitare la soluzione madre di perle rivestite di streptavidina (questa procedura utilizza perle di dimensioni di 3,13 μm) e aggiungere 2,15 μL della soluzione di perline a 1 mL di 1x PBS. Aggiungere al cap. 1.
   NOTA: La dimensione e la concentrazione delle perle rivestite di streptavidina possono essere regolate in base alle preferenze dell'utente.
4. Aggiungere 30-80 ng di λ DNA biotinilato a 1 mL di 1x PBS. Aggiungere al capitolo 2.
   NOTA: La concentrazione di DNA biotinilato può essere regolata in base alle preferenze dell'utente. Quantità maggiori di DNA aumenteranno la frequenza di formazione di cavi di DNA, ma aumenteranno anche la frequenza di legare più molecole di DNA contemporaneamente, il che può aumentare la difficoltà dell'esperimento.

3. Formazione di nucleosomi in situ mediata da Nap1

1. Aggiungere 500 μL di tampone immagine privo di proteine al capitolo 3.
   NOTA: La composizione del tampone nel capitolo 3 è flessibile e dovrebbe essere appropriata sia per i nucleosomi che per la proteina specifica di interesse. Opzionalmente, gli utenti possono scegliere di aggiungere sistemi di evacuazione dell'ossigeno per ridurre il fotosbiancamento dei fluorofori e/o del DNA concorrente per rimuovere gli ottameri istonici che non sono correttamente avvolti nei nucleosomi.
2. Aggiungere 2 nM di S. cerevisiae Nap1 e 2-5 nM di ottamero (HO) istonico H4 marcato con LD655 a 500 μL di 1x tampone HR¹⁸. Aggiungere al capitolo 4.
   NOTA: Gli ottameri istonici e Nap1 possono essere acquistati commercialmente o preparati internamente (vedi Tabella dei materiali). Il numero di nucleosomi da formare lungo ciascun DNA legato dipende dalla concentrazione di ottamero e dal tempo trascorso in questo canale. La densità nucleosomica desiderata e approssimativa dell'utente lungo ciascuna molecola di DNA può essere modulata regolando uno o entrambi questi parametri. Inoltre, l'utente può scegliere di etichettare gli ottameri istonici con il fluoroforo preferito.
3. Opzionale: aggiungere la proteina legante la cromatina o un'altra proteina di interesse al capitolo 5 in un tampone appropriato.
4. Fluire tutti i canali a 1,0 bar (~0,55 μL/s nell'attuale configurazione sperimentale) per 30 s per lavare i canali della cella di flusso con i campioni.
5. Impostare il flusso su 0,2 bar (~0,16 μL/s nell'attuale configurazione sperimentale). Spostare le trappole ottiche (OT) al capitolo 1 e catturare un paio di perle rivestite di streptavidina adatte.
6. Spostare gli OT al canale 3, eseguire una calibrazione della forza per la coppia di perline, accendere il laser confocale rosso (o un'altra linea laser a scelta) e calibrare l'area di imaging.
7. Imposta il flusso a 0,2 bar e sposta gli OT al canale 2. Cattura il DNA biotinilato.
8. Sposta gli OT al capitolo 3 e ferma il flusso. Aumenta la distanza tra gli OT per allungare il DNA e monitora la curva forza-distanza (FD) associata per confermare la presenza di un singolo cavo del DNA (al contrario di più fili). La curva dovrebbe seguire il modello a catena a forma di verme per il dsDNA alla lunghezza del contorno data²⁶.
9. Regolare la distanza tra gli OT in modo che la tensione del DNA sia di circa 1 pN.
   NOTA: 1 pN di tensione è abbastanza basso da consentire ai nucleosomi di rimanere avvolti dal DNA²⁷ , ma è abbastanza alto da posizionare l'intera molecola di DNA all'interno dell'asse di imaging a scansione lineare.
10. Attiva la scansione in linea per iniziare a raccogliere un chimografo con il laser rosso acceso.
    NOTA: È possibile ottenere chimografi o scansioni 2D del DNA legato, in base alle preferenze dell'utente.
11. Spostare gli OT al canale 4 con il flusso disattivato. Facilitati da Nap1, gli HO vengono caricati sul DNA e avvolti per formare nucleosomi in tempo reale. Il carico dei nucleosomi è visualizzato come traiettorie fluorescenti che appaiono sul DNA all'interno di chimografi. Allo stesso tempo, la formazione di nucleosomi sul DNA può essere monitorata dall'aumento della forza man mano che vengono caricati più HO quando le posizioni degli OT vengono mantenute costanti.
    NOTA: Il laser di eccitazione a fluorescenza può essere disattivato durante le fasi di formazione del nucleosoma per evitare il fotosbiancamento dei fluorofori. Inoltre, il legame non specifico degli ottameri istonici al DNA in cui gli ottameri non sono avvolti nei nucleosomi potrebbe verificarsi utilizzando questo protocollo. Questi eventi di legame non generano uno "strappo" quando il DNA viene allungato, come descritto nel protocollo Unwrapping Nucleosomes (fase 4) di seguito, e talvolta possono essere lavati via da un flusso di tampone delicato, in particolare se il tampone contiene DNA concorrente libero.
12. Quando si forma il numero approssimativo desiderato di nucleosomi, iniziare a raccogliere i dati.

4. Scartare i nucleosomi

1. Completa i passaggi 2 e 3.
2. Dopo aver formato un cavo di DNA contenente nucleosomi, spostare gli OT al capitolo 3.
3. Preparati per gli esperimenti di srotolamento dei nucleosomi riducendo la distanza tra gli OT fino a quando la forza non è approssimativamente zero. Azzerare la forza.
4. Iniziare ad allontanare l'OT 1 dall'OT 2 ad una velocità costante di 0,1 μm/s. Su un chimografo, la perlina in OT 1 si sposterà visivamente più lontano dalla perlina in OT 2. Sulla curva FD, la forza aumenterà all'aumentare della distanza. Man mano che i nucleosomi si srotolano, appariranno "strappi" o transizioni nella forza (~8-37 pN) che significano il disfacimento dell'involucro interno dei singoli nucleosomi 27,28,29.
   NOTA: La forza con cui avviene lo srotolamento dipende dalla velocità di trazione, che è prevista per i processi di non equilibrio. A volte, più nucleosomi si srotolano contemporaneamente, producendo una variazione di distanza maggiore nella transizione sulla curva FD. Inoltre, il disfacimento dell'involucro esterno del nucleosoma non è facilmente visibile in questo contesto sperimentale (vedi la sezione Discussione).

5. Visualizzazione del legame delle proteine alla cromatina

1. Completa i passaggi 2 e 3.
2. Aggiungere 10 nM di istone H1.4 marcato con Cy3 a 500 μL di tampone di immagine nel cap. 5.
   NOTA: Qualsiasi proteina di interesse può essere aggiunta al capitolo 5 a una concentrazione a scelta (tipicamente inferiore a 100 nM per la visualizzazione di una singola molecola).
3. Dopo aver formato un cavo di DNA contenente nucleosomi, accendi il laser verde oltre al laser rosso e sposta gli OT al canale 5 per l'imaging in tempo reale del legame H1 alla cromatina.
4. Continuare a raccogliere chimografi o scansioni fino a quando non sono state raggiunte statistiche sufficienti (almeno ~10-20 chimografi a seconda della frequenza degli eventi e della difficoltà sperimentale).

Risultati

Utilizzando la configurazione descritta nel passaggio 3 (Figura 1A), la formazione di nucleosomi lungo il cavo del DNA è stata visualizzata come l'aspetto di focolai fluorescenti rossi su una scansione 2D (Figure 1B, a sinistra) o traiettorie nel tempo su un chimografo (Figura 1B, a destra). I nucleosomi correttamente avvolti hanno prodotto traiettorie di fluorescenza che sono rimaste stazionarie n...

Discussione

Il protocollo descritto offre diversi vantaggi per la ricostituzione dei nucleosomi, tra cui la riduzione al minimo dei reagenti e del tempo, nonché l'abilitazione della formazione di nucleosomi chaperone-dipendenti lungo qualsiasi sequenza di DNA (potenzialmente nativa). Inoltre, il metodo in situ consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso saggi a singola molecola della meccanica dei nucleosomi e dell'interazione proteina-cromatina. ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate