Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Riepilogo

Questo articolo presenta una procedura sperimentale dettagliata per la ricostituzione di cavi di DNA contenenti nucleosomi per la forza correlativa a singola molecola e la microscopia a fluorescenza. Descrive inoltre diversi esperimenti a valle che possono essere condotti per visualizzare il comportamento di legame delle proteine che interagiscono con la cromatina e analizzare i cambiamenti nelle proprietà fisiche dei nucleosomi.

Abstract

I nucleosomi costituiscono l'unità primaria della cromatina eucariotica e sono stati al centro di numerose indagini informative su singole molecole riguardanti le loro proprietà biofisiche e le interazioni con le proteine leganti la cromatina. La ricostituzione dei nucleosomi sul DNA per questi studi comporta tipicamente una procedura di dialisi a sale che fornisce un controllo preciso sul posizionamento e sul numero di nucleosomi formati lungo un cavo di DNA. Tuttavia, questo protocollo richiede molto tempo e richiede una notevole quantità di DNA e ottameri istonici come input. Per offrire una strategia alternativa, viene descritto un metodo di ricostituzione nucleosomiale in situ per la forza di una singola molecola e la microscopia a fluorescenza che utilizza l'istone chaperone Nap1. Questo metodo consente agli utenti di assemblare nucleosomi su qualsiasi modello di DNA senza la necessità di forti sequenze di posizionamento dei nucleosomi, regolare la densità dei nucleosomi su richiesta e utilizzare meno reagenti. La formazione dei nucleosomi in situ avviene in pochi secondi, offrendo un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso le misure di singole molecole. Vengono ulteriormente descritti esempi di due saggi a valle per sondare la meccanica dei nucleosomi e visualizzare il comportamento di singole proteine sulla cromatina.

Introduzione

L'unità di confezionamento primaria della cromatina eucariotica è il nucleosoma, in cui ~147 coppie di basi (bps) di DNA sono avvolte attorno a un ottamero^{di proteine} istoniche ^1,2. Oltre all'impacchettamento del genoma, l'architettura del nucleosoma funge da un altro ricco strato di regolazione biofisica che può essere sfruttato dalle proteine leganti la cromatina durante l'esecuzione delle loro varie funzioni ^3,4. L'accesso sperimentale e la misurazione delle caratteristiche fisiche dei nucleosomi è stato tecnicament....

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate nello studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Preparazione del DNA biotinilato

1. Preparare una reazione in volume da 120 μL contenente 20 μg di λ DNA, 33 μM di biotina-dCTP, 33 μM di biotina-dUTP, 33 μM di biotina-dATP, 33 μM di dGTP, 10 unità di enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
   NOTA: Questa procedura utilizza specificamente il DNA genomico λ del batteriofago lineare a doppio filamento (ds) privo di metilazione (48.502 bps), che contiene 12 nucleotidi (nt) 5' sporgenza di DNA a singolo filamento....

Discussione

Il protocollo descritto offre diversi vantaggi per la ricostituzione dei nucleosomi, tra cui la riduzione al minimo dei reagenti e del tempo, nonché l'abilitazione della formazione di nucleosomi chaperone-dipendenti lungo qualsiasi sequenza di DNA (potenzialmente nativa). Inoltre, il metodo in situ consente un flusso di lavoro sperimentale più semplice e una comoda transizione verso saggi a singola molecola della meccanica dei nucleosomi e dell'interazione proteina-cromatina. .......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate