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要約

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。

要約

ヌクレオソームは真核生物のクロマチンの主要単位を構成し、その生物物理学的特性やクロマチン結合タンパク質との相互作用に関する数多くの有益な単一分子研究の焦点となっています。これらの研究のためのDNA上のヌクレオソーム再構成には、通常、DNAテザーに沿って形成されるヌクレオソームの配置と数を正確に制御する塩透析手順が含まれます。しかし、このプロトコールは時間がかかり、インプットとして大量のDNAとヒストン八量体が必要です。代替戦略として、ヒストンシャペロンNap1を利用した単一分子力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のための in situ ヌクレオソーム再構成法について説明する。この方法により、ユーザーは強力なヌクレオソームポジショニング配列を必要とせずに、任意のDNAテンプレート上にヌクレオソームをアセンブルし、ヌクレオソーム密度をオンデマンドで調整し、試薬の使用量を減らすことができます。 in situ ヌクレオソームの形成は数秒以内に行われるため、実験ワークフローが簡素化され、1分子測定への移行が容易になります。さらに、ヌクレオソームのメカニズムをプローブし、クロマチン上の個々のタンパク質の挙動を可視化するための2つのダウンストリームアッセイの例について説明します。

概要

真核生物のクロマチンの主要なパッケージング単位はヌクレオソームであり、その中に~147塩基対(bps)のDNAがコアヒストンタンパク質1,2の八量体に巻き付けられています。ゲノムパッケージングに加えて、ヌクレオソーム構造は、クロマチン結合タンパク質がそのさまざまな機能を果たす際に利用できる生物物理学的調節の別の豊かな層として機能します3,4。ヌクレオソームの物理的特性に実験的にアクセスし、測定することは、これらのユニットが極小のスケール(ナノメートルの長さ、ピコニュートン力など)で動作するため、技術的に困難であり、したがって、それらのプローブには、機能に有意義な情報を提供するのに十分な感度と精度が必要です。さらに、クロマチン結合タンパク質はしばしばその基質と一過性に関与しており、ほとんどのアンサンブルアプローチは、これらの相互作用の動態を知らせるための適切な時間分解能を欠いています5。幸いなことに、単一分子技術の出現により、個々のタンパク質とその相互作用をリアルタイムで視覚化および操作することが可能になり、ナノスケールで発生するこれらの分子イベントに関するメカニズム情報が明らかになりました6。特に、1分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡(smCFFM)は、高分解能蛍光検出と力操作ツールの両方を利用して、クロマチンおよびクロマチン-タンパク質複合体の力学、組成、および配位を同時に分離します7,8。

力の操作方法として「光ピンセット」を特に採用しているsmCFFMでは、密集したレーザーを使用して、誘電体、通常はミクロンサイズのプラスチックビーズを3次元でトラップします9。DNA片のような生体高分子をビーズに結合させることができ(例えば、ストレプトアビジン−ビオチン、ジゴキシゲニン−抗ジゴキシゲニン抗体結合を介して)、ユーザーは、較正された力を加えることができ、かつ、システム10によって生成される力/変位を測定することができる。追加された蛍光モジュールにより、タンパク質の組成と挙動を追跡するためのマルチカラー蛍光イメージングを同時に行うことができます。

smCFFMのヌクレオソームテンプレートを再構成するための主流の方法は、塩透析11,12,13によってカスタムDNAテンプレート上にヌクレオソームを組み立てることを含む。この手順では、精製されたヒストン八量体を高塩緩衝液(~1M塩化ナトリウム)でDNAテンプレートと共にインキュベートし、塩がゆっくりと透析されると、ヌクレオソームは配列依存的な位置でDNA上に自発的に集合する14,15。そのため、強力なヌクレオソームポジショニング配列(例えば、Widom 60116、X. laevis 5S rDNA17)がDNAテンプレート内に組み込まれて、カスタムヌクレオソームアレイを生成するのが通例です。この確立された方法は、DNA上のヌクレオソームの配置と数を正確に制御することができますが、いくつかの欠点があります:(1)強力なヌクレオソームポジショニングDNA配列の組み込みは、クロマチン結合タンパク質の活性を偏らせる人工的に安定したヌクレオソームを生成する可能性があります、(2)ヌクレオソーム形成のための塩透析のプロセスには、大量のDNAとオクタマーが必要です。 (3)この手順は、最適なヌクレオソームアレイ密度を得るために正しいDNA対八量体比を滴定するために、1日から数日の作業とかなりの努力を要します。

本稿では、in vivo 18,19,20,21,22 のヌクレオソーム形成の生理経路に類似した組換えヒストンシャペロン Nap1 を用いて、単一分子相関力および蛍光顕微鏡を用いて、in situでDNAに沿ってヌクレオソームを形成する代替法について述べる.この方法により、ユーザーは非特異的なDNA配列上にヌクレオソームを組み立て、ヌクレオソーム密度を簡単に調整し、試薬の量を大幅に削減することができます。さらに、in situでヌクレオソームDNAテザーを形成することで、実験ワークフローが簡素化され、組み込み型の単一分子の可視化と操作の利便性が向上します。したがって、均一で特異的なヌクレオソームのポジショニングが必要ない場合、このプロトコルは、ヌクレオソームの力学やクロマチン上のタンパク質の挙動の調査に有用なオプションを提供します。

プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ビオチン化DNAの調製

  1. 20 μgのλ DNA、33 μMのビオチン-dCTP、33 μMのビオチン-dUTP、33 μMのビオチン-dATP、33 μMのdGTP、10ユニットのKlenow酵素、および1x NEB Buffer 2を含む120 μLの体積反応液を調製します。
    注:この手順は、特に12ヌクレオチド(nt)5'一本鎖(ss)DNAオーバーハング23を含む線形二本鎖(ds)メチル化フリーバクテリオファージλゲノムDNA(48,502 bps)を利用します。しかし、このプロトコルは、少なくとも数ntsのss 5'オーバーハングを含み、その長さおよびnt配列が光トラップ間の下流のテザリングのために各末端に設置されたビオチン化ntsの数を決定する場合、任意の長さまたは配列の線形dsDNAを利用するように適合させることができる。さらに、反応をスケールダウンすることができます。例えば、5 μgのDNAを30 μLの容量反応に使用できます。さらに、このようにして生成されたDNA基質はねじれ的に制約されません。ねじれ制約DNAを作成するプロトコルについては、以前に公開されたレポート24,25を参照してください。
  2. 反応液を室温で15分間インキュベートします。
  3. 10 mMのEDTAを添加し、75°Cで20分間インキュベートします。
  4. エタノール沈殿を行い、ビオチン化DNA産物を得る。
    1. 0.1倍容量の3 M酢酸ナトリウムと3倍容量の氷冷100%エタノールを加えます。-20°Cで少なくとも1時間から一晩保管します。13,500 x g で4°Cで30分間遠心分離します。
    2. ペレットを乱さないように上清を慎重に取り除き、75%エタノール1mLを加えます。13,500 x g で4°Cで1分間遠心分離します。
    3. 上清の除去、エタノール添加、遠心分離のステップを繰り返します。
    4. すべての上清を慎重に取り除き、ペレットを10分間自然乾燥させます。ペレットを100-200 μLのTEバッファーまたはddH2O(溶解を促進するために37°Cでインキュベート可能)に溶解します。Nanodrop分光光度計を使用して濃度を測定します。

2. フローセル内のチャネルの準備

注:この手順は、市販のマイクロ流体チップ( 材料の表を参照)に基づいていますが、マルチチャネルフローセルを備えた任意のsmCFFM装置に適合させることができます。

  1. チャネル(ch.)4および5(またはタンパク質を含む任意の チャネル )を不動態化します( 図1Aのチャネルの概略図を参照)。0.1% BSAを500 μLを各チャンネルに加え、0.8 bar(内径0.010インチのチューブの場合は~0.45 μL/s)で8分間流します。
  2. 0.05% Pluronic-F127 500 μL を各チャンネルに加え、0.8 bar で 8 分間流します。溶液を取り出し、1x PBSでシリンジを洗い流します。各チャンネルに2 mLの1x PBSを加え、0.8 barで27分間流します。
  3. ストレプトアビジンでコーティングされたビーズのストック溶液をボルテックスし(この手順では3.13 μmサイズのビーズを使用)、1x PBSの1 mLに2.15 μLのビーズ溶液を加えます。 ch.1に追加。
    注:ストレプトアビジンコーティングビーズのサイズと濃度は、ユーザーの好みに応じて調整できます。
  4. 30-80 ngのビオチン化λ DNAを1x PBSの1 mLに加えます。 ch.2に追加。
    注:ビオチン化DNAの濃度は、ユーザーの好みに合わせて調整できます。DNAの量が多いと、DNAテザーを形成する頻度が増加しますが、一度に複数のDNA分子をテザーする頻度も高くなり、実験の難易度が高まる可能性があります。

3. Nap1を介したin situヌクレオソーム形成

  1. 500 μLのタンパク質フリー画像バッファーを Ch.3に加えます。
    注: 第3章 のバッファー組成は柔軟性があり、ヌクレオソームと目的の特定のタンパク質の両方に適しているはずです。オプションで、ユーザーは、ヌクレオソームに適切に包まれていないヒストン八量体を除去するために、蛍光色素および/または競合DNAの光退色を低減するために酸素捕捉システムを追加することを選択できます。
  2. 2 nM S. cerevisiae Nap1 および 2-5 nM LD655 標識 H4 ヒストン八量体 (HO) を 500 μL の 1x HR buffer18 に加えます。 第4章に追加。
    注:ヒストン八量体とNap1は、市販のものでも、社内で調製することもできます( 資料の表を参照)。テザーされた各DNAに沿って形成されるヌクレオソームの数は、八量体の濃度とこのチャネルで費やされた時間によって異なります。各DNA分子に沿ったユーザーの所望のおおよそのヌクレオソーム密度は、これらのパラメータのいずれかまたは両方を調整することによって調節することができる。さらに、ユーザーは、ヒストン八量体を好みの蛍光色素で標識することを選択できます。
  3. オプション:クロマチン結合タンパク質またはその他の目的のタンパク質を適切なバッファーの ch.5 に添加します。
  4. すべてのチャンネルを1.0 bar(現在の実験セットアップでは~0.55 μL/s)で30秒間流し、フローセルチャンネルをサンプルで洗い流します。
  5. 流量を 0.2 bar (現在の実験セットアップでは ~0.16 μL/s) に設定します。オプティカルトラップ(OT)を ch.1 に移動し、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズの適切なペアをキャッチします。
  6. OTを チャンネル3に移動し、ビーズペアの力キャリブレーションを行い、赤色共焦点レーザー(または選択した別のレーザーライン)をオンにして、イメージングエリアをキャリブレーションします。
  7. 流量を0.2バールに設定し、OTを チャンネル2に移動します。ビオチン化DNAを捕捉します。
  8. OTを 第3章 に移動し、流れを停止します。OT間の距離を広げてDNAを伸ばし、関連する力-距離(FD)曲線を監視して、(複数のテザーではなく)単一のDNAテザーの存在を確認します。曲線は、与えられた等高線長26におけるdsDNAの線虫様鎖モデルに従うべきである。
  9. DNAの張力が約1pNを読み取るように、OT間の距離を調整します。
    注:1pNの張力は、ヌクレオソームがDNA27 によって包まれたままであることを可能にするのに十分低いが、DNA分子全体をライン走査イメージング軸内に配置するのに十分高い。
  10. ラインスキャンをオンにして、赤色レーザーをオンにした状態でキモグラフの収集を開始します。
    注:テザーDNAのキモグラフまたは2Dスキャンは、ユーザーの好みに応じて取得できます。
  11. フローをオフにしてOTを ch.4 に移動します。Nap1のファシリテートにより、HOはDNAにロードされ、リアルタイムでヌクレオソームを形成するためにラップされます。ヌクレオソームの負荷は、キモグラフ内のDNA上に現れる蛍光軌道として視覚化されます。同時に、OTの位置が一定に保たれているときにより多くのHOがロードされるにつれて、DNA上のヌクレオソーム形成を監視できます。
    注:蛍光励起レーザーは、蛍光色素の光退色を避けるために、ヌクレオソーム形成ステップ中にオフにすることができます。さらに、このプロトコルを使用して、ヒストン八量体がヌクレオソームに包まれていないDNAへのヒストン八量体の非特異的結合が起こり得る。これらの結合イベントは、以下のUnwrapping Nucleosomes(ステップ4)プロトコルで説明されているように、DNAが引き伸ばされても「リップ」を生成せず、特にバッファーに遊離の競合DNAが含まれている場合は、緩やかなバッファーフローによって洗い流されることがあります。
  12. おおよその所望の数のヌクレオソームが形成されたら、データの収集を開始します。

4. ヌクレオソームの解きほぐし

  1. ステップ 2 とステップ 3 を完了します。
  2. ヌクレオソームを含むDNAテザーを形成した後、OTを第3章に移動します。
  3. ヌクレオソームアンラッピング実験の準備として、力がほぼゼロになるまでOT間の距離を縮めます。力をゼロにします。
  4. OT 1 を OT 2 から 0.1 μm/s の一定速度で離し始めます。キモグラフでは、OT 1 のビードは OT 2 のビードから視覚的に移動します。FD曲線では、距離が長くなると力が増加します。ヌクレオソームが解きほぐされると、個々のヌクレオソーム27,28,29の内側のラップの解きほぐしを意味する力(~8-37pN)に「裂け目」または遷移が現れる。
    注:アンラッピングが発生する力は、非平衡プロセスで予想される引っ張り速度によって異なります。場合によっては、複数のヌクレオソームが一度にアンラップされ、FD曲線上の遷移に大きな距離変化が生じます。さらに、ヌクレオソームの外側のラップの解きほぐしは、この実験環境では容易には見えません(「考察」のセクションを参照)。

5. タンパク質のクロマチン結合の可視化

  1. ステップ 2 とステップ 3 を完了します。
  2. 5ch.5のイメージバッファー500 μLに、10 nMのCy3標識リンカーヒストンH1.4を添加します。
    注:任意の目的のタンパク質を任意の濃度で ch.5 に添加することができます(通常、1分子の可視化では100 nM未満)。
  3. ヌクレオソームを含むDNAテザーを形成した後、赤色レーザーに加えて緑色レーザーをオンにし、OTを Ch.5 に移動して、クロマチンに結合するH1のリアルタイムイメージングを行います。
  4. 十分な統計が達成されるまで、キモグラフまたはスキャンの収集を続けます (イベントの頻度と実験の難易度に応じて、少なくとも 10 ~ 20 のキモグラフ)。

結果

ステップ3(図1A)で説明したセットアップを使用して、DNAテザーに沿ったヌクレオソーム形成を、2Dスキャン上の赤色蛍光病巣の出現(図1B、左)またはキモグラフ上の経時的な軌跡(図1B、右)として視覚化しました。適切にラップされたヌクレオソームは、共焦点検出の回折限界(~300 nm)内で経時的に静止す...

ディスカッション

記載されたプロトコルは、ヌクレオソーム再構成のためのいくつかの利点を提供するだけでなく、試薬および時間の最小化、ならびに任意の(潜在的に天然の)DNA配列に沿ったシャペロン依存性ヌクレオソーム形成を可能にする。さらに、 in situ 法により、実験ワークフローが簡素化され、ヌクレオソーム力学およびタンパク質-クロマチン相互作用の単一分子ア...

開示事項

著者は、競合する利益を宣言しません。

謝辞

G. N. L. C. は、米国国立衛生研究所 (NIH) の国立精神衛生研究所からの支援を F31MH132306 件で認めています。S.L.は、ロバートソン財団、国際レット症候群財団、およびNIH(賞番号R01GM149862)の支援を受けています。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1x HR bufferN/AN/A30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (Phosphate-buffered saline)N/AN/A137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic 
Acetic acid, glacialMillipore SigmaAX0074-6Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418-50GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, PureMillipore Sigma459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARecombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). 
Image bufferN/AN/A20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methylation-free λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)N/AN/APurified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/ADual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solutionMillipore Sigma63052-100MLUse to make HR buffer
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasicMillipore SigmaP0662Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetateMillipore Sigma241245Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasicMillipore SigmaS9763Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerFisher ScientificND2000NanoDrop Spectrophotometer
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate

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