単一分子相関力および蛍光顕微鏡法のためのIn Situヌクレオソームアセンブリ

要約

この記事では、単一分子相関力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のためにヌクレオソーム含有DNAテザーを再構成するための詳細な実験手順を示します。さらに、クロマチン相互作用タンパク質の結合挙動を視覚化し、ヌクレオソームの物理的特性の変化を解析するために実施できるいくつかの下流実験についても説明します。

要約

ヌクレオソームは真核生物のクロマチンの主要単位を構成し、その生物物理学的特性やクロマチン結合タンパク質との相互作用に関する数多くの有益な単一分子研究の焦点となっています。これらの研究のためのDNA上のヌクレオソーム再構成には、通常、DNAテザーに沿って形成されるヌクレオソームの配置と数を正確に制御する塩透析手順が含まれます。しかし、このプロトコールは時間がかかり、インプットとして大量のDNAとヒストン八量体が必要です。代替戦略として、ヒストンシャペロンNap1を利用した単一分子力顕微鏡および蛍光顕微鏡法のための in situ ヌクレオソーム再構成法について説明する。この方法により、ユーザーは強力なヌクレオソームポジショニング配列を必要とせずに、任意のDNAテンプレート上にヌクレオソームをアセンブルし、ヌクレオソーム密度をオンデマンドで調整し、試薬の使用量を減らすことができます。 in situ ヌクレオソームの形成は数秒以内に行われるため、実験ワークフローが簡素化され、1分子測定への移行が容易になります。さらに、ヌクレオソームのメカニズムをプローブし、クロマチン上の個々のタンパク質の挙動を可視化するための2つのダウンストリームアッセイの例について説明します。

概要

真核生物のクロマチンの主要なパッケージング単位はヌクレオソームであり、その中に~147塩基対(bps)のDNAがコアヒストンタンパク質^1,2の八量体に巻き付けられています。ゲノムパッケージングに加えて、ヌクレオソーム構造は、クロマチン結合タンパク質がそのさまざまな機能を果たす際に利用できる生物物理学的調節の別の豊かな層として機能します^3,4。ヌクレオソームの物理的特性に実験的にアクセスし、測定することは、これらのユニットが極小のスケール(ナノメートルの長さ、ピコニュートン力など)で動作するため、技術的に困難であり、したがって、それらのプローブには、機能に有意義な情報を提供するのに十分な感度と精度が必要です。さらに、クロマチン結合タンパク質はしばしばその基質と一過性に関与しており、ほとんどのアンサンブルアプローチは、これらの相互作用の動態を知らせるための適切な時間分解能を欠いています⁵。幸いなことに、単一分子技術の出現により、個々のタンパク質とその相互作用をリアルタイムで視覚化および操作することが可能になり、ナノスケールで発生するこれらの分子イベントに関するメカニズム情報が明らかになりま....

プロトコル

本試験で使用した試薬および機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. ビオチン化DNAの調製

1. 20 μgのλ DNA、33 μMのビオチン-dCTP、33 μMのビオチン-dUTP、33 μMのビオチン-dATP、33 μMのdGTP、10ユニットのKlenow酵素、および1x NEB Buffer 2を含む120 μLの体積反応液を調製します。
   注:この手順は、特に12ヌクレオチド(nt)5'一本鎖(ss)DNAオーバーハング²³を含む線形二本鎖(ds)メチル化フリーバクテリオファージλゲノムDNA(48,502 bps)を利用します。しかし、このプロトコルは、少なくとも数ntsのss 5'オーバーハングを含み、その長さおよびnt配列が光トラップ間の下流のテザリングのために各末端に設置されたビオチン化ntsの数を決定する場合、任意の長さまたは配列の線形dsDNAを利用するように適合させることができる。さらに、反応をスケールダウンすることができます。例えば、5 μgのDNAを30 μLの容量反応に使用できます。さらに、このようにして生成されたDNA基質はねじれ的に制約されません。ねじれ制約DNAを作成するプロトコルについては、以前に公開されたレポート

ディスカッション

記載されたプロトコルは、ヌクレオソーム再構成のためのいくつかの利点を提供するだけでなく、試薬および時間の最小化、ならびに任意の(潜在的に天然の)DNA配列に沿ったシャペロン依存性ヌクレオソーム形成を可能にする。さらに、 in situ 法により、実験ワークフローが簡素化され、ヌクレオソーム力学およびタンパク質-クロマチン相互作用の単一分子ア.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate