מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

Abstract

נוקלאוזומים מהווים את היחידה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי והיו במוקד של מחקרים אינפורמטיביים רבים על מולקולות בודדות בנוגע לתכונות הביופיזיקליות שלהם ולאינטראקציות שלהם עם חלבונים קושרי כרומטין. בנייה מחדש של נוקלאוזומים על דנ"א עבור מחקרים אלה כרוכה בדרך כלל בהליך דיאליזה מלח המספק שליטה מדויקת על המיקום ומספר הנוקלאוזומים הנוצרים לאורך קשירת DNA. עם זאת, פרוטוקול זה גוזל זמן רב ודורש כמות משמעותית של DNA ואוקטמרים של היסטון כתשומות. כדי להציע אסטרטגיה חלופית, מתוארת שיטת בנייה מחדש של נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש במלווה ההיסטון Nap1. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על כל תבנית DNA ללא צורך ברצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים, להתאים את צפיפות הנוקלאוזומים לפי דרישה ולהשתמש בפחות ריאגנטים. היווצרות נוקלאוזומים באתרם מתרחשת תוך שניות, ומציעה זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למדידות של מולקולה בודדת. דוגמאות לשני מבדקים במורד הזרם לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים ולהדמיית ההתנהגות של חלבונים בודדים על הכרומטין מתוארות בהמשך.

Introduction

יחידת האריזה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי היא הנוקלאוזום, שבו ~147 זוגות בסיסים (bps) של DNA עטופים סביב אוקטמר של חלבוני היסטוני ליבה ^1,2. בנוסף לאריזת הגנום, ארכיטקטורת הנוקלאוזומים משמשת כשכבה עשירה נוספת של ויסות ביופיזיקלי שניתן לרתום על ידי חלבונים קושרי כרומטין, בעת ביצוע תפקידיהם השונים ^3,4. גישה ניסיונית למאפיינים פיזיקליים של נוקלאוזומים ומדידתם הייתה מאתגרת מבחינה טכנית, שכן יחידות אלה פועלות בסקאלות זעירות (למשל, אורכים ננומטריים, כוחות פיקוניוטון), ולכן, החיטוט שלהן דורש רגישות ודיוק מספיקים כדי ליידע באו....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת DNA biotinylated

1. הכינו תגובת נפח של 120 μL המכילה 20 מיקרוגרם של λ DNA, 33 מיקרומטר של ביוטין-dCTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dUTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dATP, 33 מיקרומטר של dGTP, 10 יחידות של אנזים קלנו, ו-1x NEB Buffer 2.
   הערה: הליך זה משתמש באופן ספציפי בדנ"א גנומי λ של בקטריופאג' ליניארי דו-גדילי (ds) נטול מתילציה (48,502 bps), המכיל 12-נוקלאוטיד (nt) 5' חד-גדילי (ss) DNA מעל²³. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש בכל אורך או רצף של dsDNA ליניארי בתנאי שהוא מכיל לפחות ....

תוצאות

באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 3 (איור 1A), היווצרות נוקלאוזומים לאורך קשירת הדנ"א הודגמה כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים אדומים בסריקה דו-ממדית (איור 1B, משמאל) או מסלולים לאורך זמן בקימוגרף (איור 1B, מימין). נוקלאוזומים עטופים כרא.......

Discussion

הפרוטוקול המתואר מספק מספר יתרונות לבנייה מחדש של נוקלאוזומים, כולל מזעור ריאגנטים וזמן, כמו גם מאפשר היווצרות נוקלאוזומים תלויי מלווה לאורך כל רצף DNA (פוטנציאלי ילידי). יתר על כן, שיטת in situ מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למבחני מולקולות בודדות של מ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate