מכלול נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי

Summary

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

Abstract

נוקלאוזומים מהווים את היחידה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי והיו במוקד של מחקרים אינפורמטיביים רבים על מולקולות בודדות בנוגע לתכונות הביופיזיקליות שלהם ולאינטראקציות שלהם עם חלבונים קושרי כרומטין. בנייה מחדש של נוקלאוזומים על דנ"א עבור מחקרים אלה כרוכה בדרך כלל בהליך דיאליזה מלח המספק שליטה מדויקת על המיקום ומספר הנוקלאוזומים הנוצרים לאורך קשירת DNA. עם זאת, פרוטוקול זה גוזל זמן רב ודורש כמות משמעותית של DNA ואוקטמרים של היסטון כתשומות. כדי להציע אסטרטגיה חלופית, מתוארת שיטת בנייה מחדש של נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש במלווה ההיסטון Nap1. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על כל תבנית DNA ללא צורך ברצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים, להתאים את צפיפות הנוקלאוזומים לפי דרישה ולהשתמש בפחות ריאגנטים. היווצרות נוקלאוזומים באתרם מתרחשת תוך שניות, ומציעה זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למדידות של מולקולה בודדת. דוגמאות לשני מבדקים במורד הזרם לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים ולהדמיית ההתנהגות של חלבונים בודדים על הכרומטין מתוארות בהמשך.

Introduction

יחידת האריזה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי היא הנוקלאוזום, שבו ~147 זוגות בסיסים (bps) של DNA עטופים סביב אוקטמר של חלבוני היסטוני ליבה ^1,2. בנוסף לאריזת הגנום, ארכיטקטורת הנוקלאוזומים משמשת כשכבה עשירה נוספת של ויסות ביופיזיקלי שניתן לרתום על ידי חלבונים קושרי כרומטין, בעת ביצוע תפקידיהם השונים ^3,4. גישה ניסיונית למאפיינים פיזיקליים של נוקלאוזומים ומדידתם הייתה מאתגרת מבחינה טכנית, שכן יחידות אלה פועלות בסקאלות זעירות (למשל, אורכים ננומטריים, כוחות פיקוניוטון), ולכן, החיטוט שלהן דורש רגישות ודיוק מספיקים כדי ליידע באופן משמעותי את התפקוד. יתר על כן, חלבונים קושרי כרומטין מתקשרים לעתים קרובות עם הסובסטרטים שלהם באופן ארעי, ורוב גישות האנסמבל חסרות רזולוציה טמפורלית מתאימה כדי ליידע את הקינטיקה של אינטראקציות אלה⁵. למרבה המזל, הופעתן של טכניקות של מולקולות בודדות אפשרה לדמיין ולתפעל חלבונים בודדים ואת האינטראקציות שלהם בזמן אמת, ולחשוף מידע מכניסטי על אירועים מולקולריים אלה המתרחשים בקנה מידה ננומטרי⁶. בפרט, כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי (smCFFM) רותם הן זיהוי פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה והן כלי מניפולציה של כוח כדי לפתור בו זמנית את המכניקה, ההרכב והתיאום של קומפלקסים של כרומטין וכרומטין-חלבון ^7,8.

ב- smCFFM המשתמש באופן ספציפי ב"פינצטה אופטית" כשיטת מניפולציית הכוח, לייזר ממוקד היטב משמש ללכידת אובייקט דיאלקטרי, בדרך כלל חרוז פלסטיק בגודל מיקרון, בשלושה ממדים⁹. ביופולימר כגון פיסת דנ"א יכול להיות מצומד לחרוז (באמצעות, למשל, סטרפטווידין-ביוטין, קישור נוגדנים digoxigenin-anti-digoxigenin), והמשתמש יכול גם להפעיל כוח מכויל וגם למדוד את הכוח/תזוזה שנוצר על ידי המערכת¹⁰. מודול הפלואורסצנטיות הנוסף מאפשר הדמיה פלואורסצנטית מרובת צבעים בו זמנית כדי לעקוב אחר הרכב החלבונים והתנהגותם.

השיטה המקובלת לבנייה מחדש של תבניות נוקלאוזומים עבור smCFFM כוללת הרכבת נוקלאוזומים על תבניות DNA מותאמות אישית על ידי דיאליזה מלחית 11,12,13. בהליך זה, אוקטמרים מטוהרים של היסטון מודגרים עם תבניות דנ"א במאגר מלח גבוה (~1 M נתרן כלורי), וכאשר המלח מתרחק באיטיות, נוקלאוזומים מתאספים באופן ספונטני על הדנ"א באופן מיקום תלוי רצף^14,15. ככזה, נהוג שרצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים (לדוגמה, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷) משולבים בתוך תבניות הדנ"א כדי ליצור מערכי נוקלאוזומים מותאמים אישית. למרות ששיטה מבוססת זו מציעה שליטה מדויקת על מיקום ומספר הנוקלאוזומים על פני הדנ"א, היא סובלת ממספר חסרונות: (1) שילוב של רצפי DNA בעלי מיקום נוקלאוזומים חזקים עשוי ליצור נוקלאוזומים יציבים באופן מלאכותי המטים את פעילותם של חלבונים קושרי כרומטין, (2) תהליך דיאליזה מלח להיווצרות נוקלאוזומים דורש כמויות גבוהות של DNA ואוקטמרים, ו-(3) ההליך לוקח יום עד מספר ימים של עבודה, כמו גם מאמץ ניכר כדי להתאים את יחס הדנ"א לאוקטמר הנכון לקבלת צפיפות אופטימלית של מערך נוקלאוזומים.

בכתב יד זה, אנו מתארים שיטה חלופית ליצירת נוקלאוזומים לאורך DNA באתרו בתוך כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מלווה היסטון רקומביננטי Nap1, הדומה למסלול הפיזיולוגי של היווצרות נוקלאוזומים in vivo 18,19,20,21,22 . שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על רצפי דנ"א לא ספציפיים, להתאים בקלות את צפיפות הנוקלאוזומים ולנצל כמויות קטנות משמעותית של ריאגנטים, כל זאת תוך דקות. בנוסף, היווצרות של קשירי DNA נוקלאוזומליים באתרם מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ואת הנוחות של הדמיה ומניפולציה מובנית של מולקולה אחת. לכן, כאשר מיקום נוקלאוזומים אחיד וספציפי אינו הכרחי, פרוטוקול זה מציע אפשרות שימושית לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים או התנהגות החלבונים על כרומטין, שעבורה אנו מתארים גם בדיקות לדוגמה.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת DNA biotinylated

1. הכינו תגובת נפח של 120 μL המכילה 20 מיקרוגרם של λ DNA, 33 מיקרומטר של ביוטין-dCTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dUTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dATP, 33 מיקרומטר של dGTP, 10 יחידות של אנזים קלנו, ו-1x NEB Buffer 2.
   הערה: הליך זה משתמש באופן ספציפי בדנ"א גנומי λ של בקטריופאג' ליניארי דו-גדילי (ds) נטול מתילציה (48,502 bps), המכיל 12-נוקלאוטיד (nt) 5' חד-גדילי (ss) DNA מעל²³. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש בכל אורך או רצף של dsDNA ליניארי בתנאי שהוא מכיל לפחות מספר nts של ss 5' overhangs, האורך ורצף nt המכתיבים את מספר nts biotinylated מותקן בכל קצה עבור קשירה במורד הזרם בין מלכודות אופטיות. בנוסף, ניתן להקטין את התגובה. לדוגמה, 5 מיקרוגרם של דנ"א יכול לשמש בתגובת נפח של 30 μL. בנוסף, מצעי הדנ"א הנוצרים בדרך זו אינם מוגבלים פיתול. לקבלת פרוטוקולים ליצירת DNA מוגבל פיתול, עיין בדוחות^{שפורסמו בעבר 24,25}.
2. לדגור על התגובה בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
3. הוסף 10 mM של EDTA ודגור ב 75 ° C במשך 20 דקות.
4. בצע משקעים אתנול כדי להשיג את המוצר DNA biotinylated.
   1. הוסף נפח 0.1x של 3 M נתרן אצטט ונפח 3x של 100% אתנול קר כקרח. יש לשמור בטמפרטורה של -20°C למשך שעה לפחות עד הלילה. צנטריפוגה ב 13,500 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
   2. בזהירות להסיר את supernatant מבלי להפריע את הגלולה ולהוסיף 1 מ"ל של 75% אתנול. צנטריפוגה ב 13,500 x גרם למשך דקה אחת ב 4 ° C.
   3. חזור על שלבי הסרת הסופרנאטנט, הוספת אתנול וצנטריפוגה.
   4. מוציאים בזהירות את כל הסופרנאטנט ונותנים לגלולה להתייבש באוויר במשך 10 דקות. יש להמיס את הגלולה ב-100-200 מיקרוליטר של חיץ TE או ddH₂O (יכול לדגור ב-37°C כדי להקל על המסה). מדוד את הריכוז באמצעות ספקטרופוטומטר ננו-טיפה.

2. הכנת ערוצים בתא זרימה

הערה: הליך זה מבוסס על שבב מיקרופלואידי זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים), אך ניתן להתאים אותו לכל מכשיר smCFFM עם תא זרימה רב-ערוצי.

1. תעלות פסיביות (ch.) 4 ו-5 (או כל ch. שיכיל חלבונים) (ראו סכמה של ערוצים באיור 1A). הוסף 500 μL של 0.1% BSA לכל ערוץ וזרם במהירות של 0.8 בר (~ 0.45 μL/s עבור צינורות בקוטר פנימי של 0.010 אינץ ') למשך 8 דקות. הסר את התמיסה.
2. הוסף 500 μL של 0.05% Pluronic-F127 לכל ערוץ וזרם ב 0.8 בר במשך 8 דקות. הסר את התמיסה ושטוף את המזרקים עם 1x PBS. הוסף 2 מ"ל של 1x PBS לכל ערוץ וזרם ב- 0.8 בר למשך 27 דקות.
3. מערבלים את תמיסת המניות של חרוזים מצופים סטרפטווידין (הליך זה משתמש בחרוזים בגודל 3.13 מיקרומטר) ומוסיפים 2.15 מיקרוליטר של תמיסת החרוזים ל -1 מ"ל של PBS 1x. הוסף לפרק 1.
   הערה: ניתן להתאים את הגודל והריכוז של החרוזים המצופים סטרפטווידין בהתאם להעדפת המשתמש.
4. הוסף 30-80 ng של λ DNA biotinylated ל 1 מ"ל של 1x PBS. הוסף לפרק 2.
   הערה: ניתן להתאים את ריכוז הדנ"א הביוטינילי להעדפת המשתמש. כמויות גדולות יותר של דנ"א יגבירו את תדירות יצירת קשירת הדנ"א, אך גם יעלו את התדירות של קשירת מולקולות דנ"א מרובות בבת אחת, מה שיכול להוסיף לקושי של הניסוי.

3. Nap1-בתיווך היווצרות נוקלאוזומים באתרם

1. הוסף 500 μL של מאגר תמונה ללא חלבון לפרק 3.
   הערה: הרכב החיץ בפרק 3 גמיש וצריך להתאים הן לנוקלאוזומים והן לחלבונים הספציפיים המעניינים. לחלופין, משתמשים יכולים לבחור להוסיף מערכות חיטוי חמצן להפחתת הלבנה של פלואורופורים ו / או DNA מתחרה כדי להסיר אוקטמרים היסטון שאינם עטופים כראוי בנוקלאוזומים.
2. הוסף 2 nM S. cerevisiae Nap1 ו- 2-5 nM LD655-labeled H4 histone octamer (HO) ל- 500 μL של 1x HR buffer¹⁸. הוסף לפרק 4.
   הערה: ניתן לרכוש או להכין אוקטמרים של היסטון ו-Nap1 באופן מסחרי (ראו טבלת חומרים). מספר הנוקלאוזומים שייווצרו לאורך כל דנ"א קשור תלוי בריכוז האוקטמר, כמו גם בזמן השהייה בתעלה זו. ניתן לווסת את צפיפות הנוקלאוזומים הרצויה והמשוערת של המשתמש לאורך כל מולקולת DNA על ידי התאמת אחד מהפרמטרים הללו או שניהם. בנוסף, המשתמש יכול לבחור לתייג אוקטמרים היסטון עם הפלואורופור המועדף עליו.
3. אופציונלי: הוסף חלבון קושר כרומטין, או חלבון אחר בעל עניין ל - ch. 5 במאגר מתאים.
4. זרם את כל הערוצים ב- 1.0 בר (~ 0.55 μL/s במערך הניסוי הנוכחי) במשך 30 שניות כדי לשטוף את ערוצי תאי הזרימה עם דגימות.
5. הגדר את הזרימה ל- 0.2 בר (~ 0.16 μL/s במערך הניסוי הנוכחי). הזיזו את המלכודות האופטיות (OTs) לפרק 1 ותפסו זוג מתאים של חרוזים מצופים סטרפטווידין.
6. העבר את ה- OTs ל - ch. 3, בצע כיול כוח עבור זוג החרוזים, הפעל את הלייזר הקונפוקלי האדום (או קו לייזר אחר לפי בחירה), וכייל את אזור ההדמיה.
7. הגדר את הזרימה ל- 0.2 בר והעבר OTs ל - ch. 2. לתפוס DNA biotinylated.
8. העבר את ה- OTs ל - ch. 3 ועצור את הזרימה. הגדל את המרחק בין OTs כדי למתוח את הדנ"א ולנטר את עקומת מרחק הכוח (FD) המשויכת כדי לאשר את נוכחותו של קשר DNA יחיד (בניגוד לקשירה מרובה). העקומה צריכה לעקוב אחר מודל השרשרת דמוית התולעת עבור dsDNA באורך המתאר הנתון²⁶.
9. התאימו את המרחק בין ה-OTs כך שמתח הדנ"א יקרא בערך 1 pN.
   הערה: pN 1 של מתח נמוך מספיק כדי לאפשר לנוקלאוזומים להישאר עטופים על ידי DNA²⁷ , אך הוא גבוה מספיק כדי למקם את מולקולת הדנ"א כולה בתוך ציר הדימות של סריקת הקו.
10. הפעל סריקה קווית כדי להתחיל לאסוף קימוגרף כאשר הלייזר האדום מופעל.
    הערה: ניתן להשיג קימוגרפים או סריקות דו-ממדיות של DNA קשור, בהתאם להעדפת המשתמש.
11. העבר את ה- OTs ל - ch. 4 כאשר הזרימה כבויה. בהנחיית Nap1, HOs נטענים על DNA ונעטפים ליצירת נוקלאוזומים בזמן אמת. טעינת נוקלאוזומים מתוארת כמסלולים פלואורסצנטיים המופיעים על הדנ"א בתוך קימוגרפים. במקביל, היווצרות נוקלאוזומים על הדנ"א יכולה להיות מנוטרת על ידי עליית הכוח ככל שיותר HOs נטענים כאשר המיקומים של OTs מוחזקים קבועים.
    הערה: ניתן לכבות לייזר עירור פלואורסצנטי במהלך שלבי היווצרות הנוקלאוזומים כדי למנוע הלבנה של פלואורופורים. בנוסף, קשירה לא ספציפית של אוקטמרים היסטון לדנ"א שבה האוקטמרים אינם עטופים בנוקלאוזומים יכולה להתרחש באמצעות פרוטוקול זה. אירועי קישור אלה לא ייצרו "קרע" כאשר הדנ"א נמתח, כפי שמתואר בפרוטוקול Unwrapping Nucleosomes (שלב 4) להלן, ולפעמים הם יכולים להישטף על ידי זרימת חיץ עדינה, במיוחד אם המאגר מכיל DNA מתחרה חופשי.
12. כאשר נוצר המספר הרצוי המשוער של נוקלאוזומים, התחל לאסוף נתונים.

4. חשיפת נוקלאוזומים

1. השלם את שלב 2 ואת שלב 3.
2. לאחר יצירת קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים, העבר את ה- OTs ל - ch. 3.
3. התכוננו לניסויי חשיפת נוקלאוזומים על ידי צמצום המרחק בין OTs עד שהכוח הוא בערך אפס. אפס את הכוח.
4. התחל להזיז את OT 1 הרחק מ-OT 2 במהירות קבועה של 0.1 מיקרומטר לשנייה. בקימוגרף, החרוז ב-OT 1 יתרחק ויזואלית מהחרוז ב-OT 2. בעקומת FD, הכוח יעלה ככל שהמרחק יגדל. כאשר נוקלאוזומים מתפרקים, יופיעו "קרעים" או מעברים בכוח (~8-37 pN) המסמנים את חשיפת העטיפה הפנימית של נוקלאוזומים בודדים 27,28,29.
   הערה: הכוח שבו מתרחשת הסרת העטיפה תלוי בקצב המשיכה, הצפוי בתהליכים שאינם בשיווי משקל. לפעמים, נוקלאוזומים מרובים נפתחים בבת אחת, ויוצרים שינוי מרחק גדול יותר במעבר בעקומת FD. בנוסף, חשיפת העטיפה החיצונית של הנוקלאוזום, אינה נראית בקלות במסגרת ניסויית זו (ראה פרק הדיון).

5. הדמיה של קשירת חלבון לכרומטין

1. השלם את שלב 2 ואת שלב 3.
2. הוסף 10 ננומטר של היסטון H1.4 עד 500 μL של מאגר תמונה בפרק 5.
   הערה: ניתן להוסיף כל חלבון מעניין ל-ch. 5 בריכוז לפי בחירה (בדרך כלל מתחת ל-100 ננומטר לצורך הדמיה של מולקולה יחידה).
3. לאחר יצירת קשירת DNA המכילה נוקלאוזומים, הפעל את הלייזר הירוק בנוסף ללייזר האדום והעבר OTs ל - ch. 5 לצורך הדמיה בזמן אמת של H1 נקשר לכרומטין.
4. המשך לאסוף קימוגרפים או סריקות עד להשגת סטטיסטיקה מספקת (לפחות ~ 10-20 קימוגרפים בהתאם לתדירות האירועים וקושי הניסוי).

תוצאות

באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 3 (איור 1A), היווצרות נוקלאוזומים לאורך קשירת הדנ"א הודגמה כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים אדומים בסריקה דו-ממדית (איור 1B, משמאל) או מסלולים לאורך זמן בקימוגרף (איור 1B, מימין). נוקלאוזומים עטופים כרא...

Discussion

הפרוטוקול המתואר מספק מספר יתרונות לבנייה מחדש של נוקלאוזומים, כולל מזעור ריאגנטים וזמן, כמו גם מאפשר היווצרות נוקלאוזומים תלויי מלווה לאורך כל רצף DNA (פוטנציאלי ילידי). יתר על כן, שיטת in situ מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למבחני מולקולות בודדות של מ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate