A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.

Abstract

נוקלאוזומים מהווים את היחידה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי והיו במוקד של מחקרים אינפורמטיביים רבים על מולקולות בודדות בנוגע לתכונות הביופיזיקליות שלהם ולאינטראקציות שלהם עם חלבונים קושרי כרומטין. בנייה מחדש של נוקלאוזומים על דנ"א עבור מחקרים אלה כרוכה בדרך כלל בהליך דיאליזה מלח המספק שליטה מדויקת על המיקום ומספר הנוקלאוזומים הנוצרים לאורך קשירת DNA. עם זאת, פרוטוקול זה גוזל זמן רב ודורש כמות משמעותית של DNA ואוקטמרים של היסטון כתשומות. כדי להציע אסטרטגיה חלופית, מתוארת שיטת בנייה מחדש של נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש במלווה ההיסטון Nap1. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על כל תבנית DNA ללא צורך ברצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים, להתאים את צפיפות הנוקלאוזומים לפי דרישה ולהשתמש בפחות ריאגנטים. היווצרות נוקלאוזומים באתרם מתרחשת תוך שניות, ומציעה זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למדידות של מולקולה בודדת. דוגמאות לשני מבדקים במורד הזרם לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים ולהדמיית ההתנהגות של חלבונים בודדים על הכרומטין מתוארות בהמשך.

Introduction

יחידת האריזה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי היא הנוקלאוזום, שבו ~147 זוגות בסיסים (bps) של DNA עטופים סביב אוקטמר של חלבוני היסטוני ליבה 1,2. בנוסף לאריזת הגנום, ארכיטקטורת הנוקלאוזומים משמשת כשכבה עשירה נוספת של ויסות ביופיזיקלי שניתן לרתום על ידי חלבונים קושרי כרומטין, בעת ביצוע תפקידיהם השונים 3,4. גישה ניסיונית למאפיינים פיזיקליים של נוקלאוזומים ומדידתם הייתה מאתגרת מבחינה טכנית, שכן יחידות אלה פועלות בסקאלות זעירות (למשל, אורכים ננומטריים, כוחות פיקוניוטון), ולכן, החיטוט שלהן דורש רגישות ודיוק מספיקים כדי ליידע באו....

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. הכנת DNA biotinylated

  1. הכינו תגובת נפח של 120 μL המכילה 20 מיקרוגרם של λ DNA, 33 מיקרומטר של ביוטין-dCTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dUTP, 33 מיקרומטר של ביוטין-dATP, 33 מיקרומטר של dGTP, 10 יחידות של אנזים קלנו, ו-1x NEB Buffer 2.
    הערה: הליך זה משתמש באופן ספציפי בדנ"א גנומי λ של בקטריופאג' ליניארי דו-גדילי (ds) נטול מתילציה (48,502 bps), המכיל 12-נוקלאוטיד (nt) 5' חד-גדילי (ss) DNA מעל23. עם זאת, ניתן להתאים את הפרוטוקול לשימוש בכל אורך או רצף של dsDNA ליניארי בתנאי שהוא מכיל לפחות ....

תוצאות

באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 3 (איור 1A), היווצרות נוקלאוזומים לאורך קשירת הדנ"א הודגמה כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים אדומים בסריקה דו-ממדית (איור 1B, משמאל) או מסלולים לאורך זמן בקימוגרף (איור 1B, מימין). נוקלאוזומים עטופים כרא.......

Discussion

הפרוטוקול המתואר מספק מספר יתרונות לבנייה מחדש של נוקלאוזומים, כולל מזעור ריאגנטים וזמן, כמו גם מאפשר היווצרות נוקלאוזומים תלויי מלווה לאורך כל רצף DNA (פוטנציאלי ילידי). יתר על כן, שיטת in situ מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למבחני מולקולות בודדות של מ.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

G. N. L. C. מודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות הנפש של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר F31MH132306. S. L. נתמך על ידי קרן רוברטסון, הקרן הבינלאומית לתסמונת רט, ואת NIH (פרס מספר R01GM149862).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1x HR bufferN/AN/A30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA 
1x PBS (Phosphate-buffered saline)N/AN/A137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic 
Acetic acid, glacialMillipore SigmaAX0074-6Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTPJena BioscienceNU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATPJena BioscienceNU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTPJena BioscienceNU-956-BIO14-S
Bovine Serum AlbuminMillipore SigmaA9418-50GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive DyeCytivaPA23031Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTPNew England BiolabsN0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 RFisher Scientific05-414-051Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, PureMillipore Sigma459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Millipore SigmaE9884Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) N/AN/ARecombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). 
Image bufferN/AN/A20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)New England BiolabsM0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)Thermo Fisher ScientificSD0021Methylation-free λ DNA
LD655-MALLumidyne Technologies9Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)N/AN/APurified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap DymoLUMICKSN/ADual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solutionMillipore Sigma63052-100MLUse to make HR buffer
NEBuffer 2New England BiolabsB7002SIncluded with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127Millipore SigmaP2443-250GDissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chlorideMillipore SigmaP3911Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasicMillipore SigmaP0662Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1N/AN/ANap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetateMillipore Sigma241245Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chlorideMillipore SigmaS9888Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasicMillipore SigmaS9763Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)SpherotechTP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c SpectrophotometerFisher ScientificND2000NanoDrop Spectrophotometer
Tris BaseFisher ScientificBP152-500Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate

References

  1. Kornberg, R. D. Chromatin structure: A repeating unit of histones and DNA. Science. 184, 868-871 (1974).
  2. Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Crystal Richmond, T. J. structure of the nucleosome core particle at 2....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved