A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
מאמר זה מציג הליך ניסויי מפורט לבנייה מחדש של קשירי דנ"א המכילים נוקלאוזומים עבור כוח מתאם של מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי. הוא מתאר גם מספר ניסויים במורד הזרם שניתן לבצע כדי להמחיש את התנהגות הקישור של חלבונים המקיימים אינטראקציה עם כרומטין, ולנתח שינויים בתכונות הפיזיקליות של נוקלאוזומים.
נוקלאוזומים מהווים את היחידה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי והיו במוקד של מחקרים אינפורמטיביים רבים על מולקולות בודדות בנוגע לתכונות הביופיזיקליות שלהם ולאינטראקציות שלהם עם חלבונים קושרי כרומטין. בנייה מחדש של נוקלאוזומים על דנ"א עבור מחקרים אלה כרוכה בדרך כלל בהליך דיאליזה מלח המספק שליטה מדויקת על המיקום ומספר הנוקלאוזומים הנוצרים לאורך קשירת DNA. עם זאת, פרוטוקול זה גוזל זמן רב ודורש כמות משמעותית של DNA ואוקטמרים של היסטון כתשומות. כדי להציע אסטרטגיה חלופית, מתוארת שיטת בנייה מחדש של נוקלאוזומים באתרו עבור כוח מולקולה בודדת ומיקרוסקופ פלואורסצנטי המשתמש במלווה ההיסטון Nap1. שיטה זו מאפשרת למשתמשים להרכיב נוקלאוזומים על כל תבנית DNA ללא צורך ברצפי מיקום נוקלאוזומים חזקים, להתאים את צפיפות הנוקלאוזומים לפי דרישה ולהשתמש בפחות ריאגנטים. היווצרות נוקלאוזומים באתרם מתרחשת תוך שניות, ומציעה זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למדידות של מולקולה בודדת. דוגמאות לשני מבדקים במורד הזרם לחקירת מכניקת הנוקלאוזומים ולהדמיית ההתנהגות של חלבונים בודדים על הכרומטין מתוארות בהמשך.
יחידת האריזה העיקרית של הכרומטין האיקריוטי היא הנוקלאוזום, שבו ~147 זוגות בסיסים (bps) של DNA עטופים סביב אוקטמר של חלבוני היסטוני ליבה 1,2. בנוסף לאריזת הגנום, ארכיטקטורת הנוקלאוזומים משמשת כשכבה עשירה נוספת של ויסות ביופיזיקלי שניתן לרתום על ידי חלבונים קושרי כרומטין, בעת ביצוע תפקידיהם השונים 3,4. גישה ניסיונית למאפיינים פיזיקליים של נוקלאוזומים ומדידתם הייתה מאתגרת מבחינה טכנית, שכן יחידות אלה פועלות בסקאלות זעירות (למשל, אורכים ננומטריים, כוחות פיקוניוטון), ולכן, החיטוט שלהן דורש רגישות ודיוק מספיקים כדי ליידע באו....
פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת DNA biotinylated
באמצעות ההגדרה שתוארה בשלב 3 (איור 1A), היווצרות נוקלאוזומים לאורך קשירת הדנ"א הודגמה כהופעה של מוקדים פלואורסצנטיים אדומים בסריקה דו-ממדית (איור 1B, משמאל) או מסלולים לאורך זמן בקימוגרף (איור 1B, מימין). נוקלאוזומים עטופים כרא.......
הפרוטוקול המתואר מספק מספר יתרונות לבנייה מחדש של נוקלאוזומים, כולל מזעור ריאגנטים וזמן, כמו גם מאפשר היווצרות נוקלאוזומים תלויי מלווה לאורך כל רצף DNA (פוטנציאלי ילידי). יתר על כן, שיטת in situ מאפשרת זרימת עבודה ניסיונית פשוטה יותר ומעבר נוח למבחני מולקולות בודדות של מ.......
המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.
G. N. L. C. מודה על תמיכת המכון הלאומי לבריאות הנפש של המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) תחת פרס מספר F31MH132306. S. L. נתמך על ידי קרן רוברטסון, הקרן הבינלאומית לתסמונת רט, ואת NIH (פרס מספר R01GM149862).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1x HR buffer | N/A | N/A | 30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA |
1x PBS (Phosphate-buffered saline) | N/A | N/A | 137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic |
Acetic acid, glacial | Millipore Sigma | AX0074-6 | Use to make tris acetate |
Biotin-11-dUTP | Jena Bioscience | NU-803-BIOX-S | |
Biotin-14-dATP | Jena Bioscience | NU-835-BIO14-S | |
Biotin-14-dCTP | Jena Bioscience | NU-956-BIO14-S | |
Bovine Serum Albumin | Millipore Sigma | A9418-50G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye | Cytiva | PA23031 | Maleimide functionalized Cy3 fluorophore |
dGTP | New England Biolabs | N0442S | |
Eppendorf Centrifuge 5425 R | Fisher Scientific | 05-414-051 | Benchtop centrifuge with cooling |
Ethyl alcohol, Pure | Millipore Sigma | 459844 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Millipore Sigma | E9884 | Dissolve in H2O to 0.5 M |
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C) | N/A | N/A | Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher). |
Image buffer | N/A | N/A | 20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride |
Klenow Fragment (3' to 5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
Lambda DNA (dam-, dcm-) | Thermo Fisher Scientific | SD0021 | Methylation-free λ DNA |
LD655-MAL | Lumidyne Technologies | 9 | Maleimide functionalized LD655 fluorophore |
Linker histone H1.4 (A4C) | N/A | N/A | Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38) |
LUMICKS C-Trap Dymo | LUMICKS | N/A | Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer |
Magnesium acetate solution | Millipore Sigma | 63052-100ML | Use to make HR buffer |
NEBuffer 2 | New England Biolabs | B7002S | Included with Klenow Fragment kit |
Pluronic F-127 | Millipore Sigma | P2443-250G | Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter |
Potassium chloride | Millipore Sigma | P3911 | Use to make PBS and HR buffer |
Potassium phosphate monobasic | Millipore Sigma | P0662 | Use to make PBS |
S. cerevisiae Nap1 | N/A | N/A | Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif). |
Sodium acetate | Millipore Sigma | 241245 | Dissolve in H2O to 3 M |
Sodium chloride | Millipore Sigma | S9888 | Use to make PBS and image buffer |
Sodium phosphate dibasic | Millipore Sigma | S9763 | Use to make PBS |
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm) | Spherotech | TP-30-5 | |
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Fisher Scientific | ND2000 | NanoDrop Spectrophotometer |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-500 | Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved