Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Resumo

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Resumo

Os nucleossomos constituem a unidade primária da cromatina eucariótica e têm sido o foco de inúmeras investigações informativas de molécula única sobre suas propriedades biofísicas e interações com proteínas de ligação à cromatina. A reconstituição de nucleossomos no DNA para esses estudos normalmente envolve um procedimento de diálise com sal que fornece controle preciso sobre a colocação e o número de nucleossomos formados ao longo de uma corda de DNA. No entanto, este protocolo é demorado e requer uma quantidade substancial de DNA e octâmeros de histonas como entradas. Para oferecer uma estratégia alternativa, é descrito um método de reconstituição de nucleossomos in situ para microscopia de força e fluorescência de molécula única que utiliza a chaperona histona Nap1. Esse método permite que os usuários montem nucleossomos em qualquer molde de DNA sem a necessidade de sequências fortes de posicionamento de nucleossomos, ajustem a densidade do nucleossomo sob demanda e usem menos reagentes. A formação de nucleossomos in situ ocorre em segundos, oferecendo um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para medições de molécula única. Exemplos de dois ensaios a jusante para sondar a mecânica do nucleossomo e visualizar o comportamento de proteínas individuais na cromatina são descritos posteriormente.

Introdução

A unidade de empacotamento primário da cromatina eucariótica é o nucleossomo, no qual ~ 147 pares de bases (bps) de DNA são enrolados em torno de um octâmero de proteínas histonas centrais ^1,2. Além do empacotamento do genoma, a arquitetura do nucleossomo serve como outra camada rica de regulação biofísica que pode ser aproveitada pelas proteínas de ligação à cromatina ao desempenhar suas várias funções ^3,4. Acessar e medir experimentalmente as características físicas dos nucleossomos tem sido tecnicamente desafiador, ....

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de DNA biotinilado

1. Prepare uma reação de volume de 120 μL contendo 20 μg de λ DNA, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
   NOTA: Este procedimento utiliza especificamente DNA genômico λ bacteriófago λ livre de metilação linear de fita dupla (ds) (48.502 bps), que contém 12 nucleotídeos (nt) 5' saliência de DNA de fita simples (ss)²³.....

Discussão

O protocolo descrito oferece várias vantagens para a reconstituição do nucleossomo, incluindo a minimização de reagentes e tempo, além de permitir a formação de nucleossomos dependentes de chaperonas ao longo de qualquer sequência de DNA (potencialmente nativa). Além disso, o método in situ permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para ensaios de molécula única da mecânica do nucleossomo e da interação proteína-cromati.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate