Montagem de nucleossomos in situ para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única

Resumo

Este artigo apresenta um procedimento experimental detalhado para reconstituir amarras de DNA contendo nucleossomos para microscopia de força correlativa e fluorescência de molécula única. Além disso, descreve vários experimentos a jusante que podem ser conduzidos para visualizar o comportamento de ligação de proteínas que interagem com a cromatina e analisar mudanças nas propriedades físicas dos nucleossomos.

Resumo

Os nucleossomos constituem a unidade primária da cromatina eucariótica e têm sido o foco de inúmeras investigações informativas de molécula única sobre suas propriedades biofísicas e interações com proteínas de ligação à cromatina. A reconstituição de nucleossomos no DNA para esses estudos normalmente envolve um procedimento de diálise com sal que fornece controle preciso sobre a colocação e o número de nucleossomos formados ao longo de uma corda de DNA. No entanto, este protocolo é demorado e requer uma quantidade substancial de DNA e octâmeros de histonas como entradas. Para oferecer uma estratégia alternativa, é descrito um método de reconstituição de nucleossomos in situ para microscopia de força e fluorescência de molécula única que utiliza a chaperona histona Nap1. Esse método permite que os usuários montem nucleossomos em qualquer molde de DNA sem a necessidade de sequências fortes de posicionamento de nucleossomos, ajustem a densidade do nucleossomo sob demanda e usem menos reagentes. A formação de nucleossomos in situ ocorre em segundos, oferecendo um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para medições de molécula única. Exemplos de dois ensaios a jusante para sondar a mecânica do nucleossomo e visualizar o comportamento de proteínas individuais na cromatina são descritos posteriormente.

Introdução

A unidade de empacotamento primário da cromatina eucariótica é o nucleossomo, no qual ~ 147 pares de bases (bps) de DNA são enrolados em torno de um octâmero de proteínas histonas centrais ^1,2. Além do empacotamento do genoma, a arquitetura do nucleossomo serve como outra camada rica de regulação biofísica que pode ser aproveitada pelas proteínas de ligação à cromatina ao desempenhar suas várias funções ^3,4. Acessar e medir experimentalmente as características físicas dos nucleossomos tem sido tecnicamente desafiador, uma vez que essas unidades funcionam em escalas minúsculas (por exemplo, comprimentos nanométricos, forças de piconewton) e, portanto, sua sondagem requer sensibilidade e precisão suficientes para informar significativamente a função. Além disso, as proteínas de ligação à cromatina geralmente se envolvem com seus substratos transitoriamente, e a maioria das abordagens de conjunto carece de resolução temporal apropriada para informar a cinética dessas interações⁵. Felizmente, o advento das técnicas de molécula única tornou possível visualizar e manipular proteínas individuais e suas interações em tempo real, revelando informações mecanicistas sobre esses eventos moleculares que ocorrem em nanoescala⁶. Em particular, a microscopia de força e fluorescência correlativa de molécula única (smCFFM) aproveita as ferramentas de detecção e manipulação de força de fluorescência de alta resolução para resolver simultaneamente a mecânica, composição e coordenação da cromatina e dos complexos cromatina-proteína ^7,8.

No smCFFM, que emprega especificamente "pinças ópticas" como método de manipulação de força, um laser bem focado é usado para prender um objeto dielétrico, normalmente um grânulo de plástico do tamanho de um mícron, em três dimensões⁹. Um biopolímero, como um pedaço de DNA, pode ser conjugado ao grânulo (via, por exemplo, estreptavidina-biotina, ligação de anticorpos digoxigenina-anti-digoxigenina), e o usuário pode aplicar uma força calibrada e medir a força / deslocamento gerado pelo sistema¹⁰. O módulo de fluorescência adicionado permite imagens de fluorescência multicoloridas simultâneas para rastrear a composição e o comportamento das proteínas.

O método convencional para reconstituir modelos de nucleossomos para smCFFM envolve a montagem de nucleossomos em modelos de DNA personalizados por diálise salina 11,12,13. Neste procedimento, os octâmeros de histonas purificados são incubados com moldes de DNA em um tampão com alto teor de sal (~ 1 M de cloreto de sódio) e, à medida que o sal é lentamente dilisado, os nucleossomos se montam espontaneamente no DNA de maneira posicional dependente da sequência^14,15. Como tal, é comum que sequências fortes de posicionamento de nucleossomos (por exemplo, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷) sejam incorporadas aos modelos de DNA para gerar matrizes de nucleossomos personalizadas. Embora este método bem estabelecido ofereça controle preciso sobre a colocação e o número de nucleossomos no DNA, ele sofre de várias desvantagens: (1) a incorporação de sequências de DNA de posicionamento de nucleossomos fortes pode gerar nucleossomos artificialmente estáveis que influenciam a atividade das proteínas de ligação à cromatina, (2) o processo de diálise de sal para a formação de nucleossomos requer grandes quantidades de DNA e octâmeros, e (3) o procedimento leva de um a vários dias de trabalho, bem como um esforço considerável para titular a proporção correta de DNA para octâmero para densidade ideal de matriz de nucleossomos.

Neste manuscrito, descrevemos um método alternativo para formar nucleossomos ao longo do DNA in situ dentro de um microscópio de força correlativa e fluorescência de molécula única usando a chaperona de histona recombinante Nap1, que se assemelha à via fisiológica de formação de nucleossomos in vivo 18,19,20,21,22. Esse método permite que os usuários montem nucleossomos em sequências de DNA não específicas, ajustem facilmente a densidade do nucleossomo e utilizem quantidades significativamente menores de reagentes, tudo em minutos. Além disso, a formação de amarras de DNA nucleossômico in situ permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e a conveniência de visualização e manipulação de uma única molécula integrada. Assim, quando o posicionamento uniforme e específico do nucleossomo não é uma necessidade, este protocolo oferece uma opção útil para a investigação da mecânica do nucleossomo ou do comportamento da proteína na cromatina, para a qual também descrevemos ensaios de exemplo.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado no estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de DNA biotinilado

1. Prepare uma reação de volume de 120 μL contendo 20 μg de λ DNA, 33 μM de biotina-dCTP, 33 μM de biotina-dUTP, 33 μM de biotina-dATP, 33 μM de dGTP, 10 unidades de enzima Klenow e 1x NEB Buffer 2.
   NOTA: Este procedimento utiliza especificamente DNA genômico λ bacteriófago λ livre de metilação linear de fita dupla (ds) (48.502 bps), que contém 12 nucleotídeos (nt) 5' saliência de DNA de fita simples (ss)²³. No entanto, o protocolo pode ser adaptado para fazer uso de qualquer comprimento ou sequência de dsDNA linear, desde que contenha pelo menos vários nts de ss 5 'saliências, o comprimento e a sequência nt ditando o número de nts biotinilados instalados em cada extremidade para amarração a jusante entre armadilhas ópticas. Além disso, a reação pode ser reduzida. Por exemplo, 5 μg de DNA podem ser usados em uma reação de volume de 30 μL. Além disso, os substratos de DNA gerados dessa maneira não são restritos à torção. Para protocolos para criar DNA com restrição de torção, consulte os relatórios publicados anteriormente^24,25.
2. Incubar a reação à temperatura ambiente durante 15 min.
3. Adicionar 10 mM de EDTA e incubar a 75 °C durante 20 min.
4. Realize a precipitação de etanol para obter o produto de DNA biotinilado.
   1. Adicione 0,1x volume de acetato de sódio 3 M e 3x volume de etanol 100% gelado. Conservar a -20 °C durante, pelo menos, 1 h até uma noite. Centrifugue a 13.500 x g por 30 min a 4 °C.
   2. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet e adicione 1 mL de etanol a 75%. Centrifugue a 13.500 x g por 1 min a 4 °C.
   3. Repita as etapas de remoção do sobrenadante, adição de etanol e centrifugação.
   4. Remova cuidadosamente todo o sobrenadante e deixe o pellet secar ao ar por 10 min. Dissolva o pellet em 100-200 μL de tampão TE ou ddH₂O (pode incubar a 37 °C para facilitar a dissolução). Meça a concentração usando um espectrofotômetro Nanodrop.

2. Preparação de canais em uma célula de fluxo

NOTA: Este procedimento é baseado em um chip microfluídico disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais), mas pode ser adaptado a qualquer instrumento smCFFM com uma célula de fluxo multicanal.

1. Passivar os canais (cap.) 4 e 5 (ou qualquer ch. que contenha proteínas) (ver esquema dos canais na Figura 1A). Adicione 500 μL de BSA a 0,1% a cada canal e escove a 0,8 bar (~0,45 μL/s para tubos com diâmetro interno de 0,010 pol.) por 8 min.
2. Adicione 500 μL de 0,05% de Pluronic-F127 a cada canal e flua a 0,8 bar por 8 min. Remova a solução e enxágue as seringas com 1x PBS. Adicione 2 mL de 1x PBS a cada canal e flua a 0,8 bar por 27 min.
3. Vortex a solução estoque de grânulos revestidos com estreptavidina (este procedimento usa grânulos de tamanho de 3,13 μm) e adicione 2,15 μL da solução de grânulos a 1 mL de 1x PBS. Adicionar ao cap. 1.
   NOTA: O tamanho e a concentração dos grânulos revestidos com estreptavidina podem ser ajustados de acordo com a preferência do usuário.
4. Adicione 30-80 ng de λ DNA biotinilado a 1 mL de 1x PBS. Adicionar ao cap. 2.
   NOTA: A concentração de DNA biotinilado pode ser ajustada de acordo com a preferência do usuário. Maiores quantidades de DNA aumentarão a frequência de formação de amarras de DNA, mas também aumentarão a frequência de amarrar várias moléculas de DNA de uma só vez, o que pode aumentar a dificuldade do experimento.

3. Formação de nucleossomos in situ mediada por Nap1

1. Adicione 500 μL de tampão de imagem livre de proteínas ao cap. 3.
   NOTA: A composição do tampão no cap. 3 é flexível e deve ser apropriada para nucleossomos e proteína(s) específica(s) de interesse. Opcionalmente, os usuários podem optar por adicionar sistemas de eliminação de oxigênio para reduzir o fotobranqueamento de fluoróforos e/ou DNA concorrente para remover octâmeros de histonas que não estão devidamente envolvidos em nucleossomos.
2. Adicione 2 nM S. cerevisiae Nap1 e 2-5 nM LD655 marcado com H4 histona octâmero (HO) a 500 μL de 1x tampão HR¹⁸. Adicionar ao cap. 4.
   NOTA: Os octâmeros de histona e o Nap1 podem ser adquiridos comercialmente ou preparados internamente (consulte a Tabela de Materiais). O número de nucleossomos a serem formados ao longo de cada DNA amarrado depende da concentração de octâmero, bem como do tempo gasto neste canal. A densidade de nucleossomos desejada e aproximada do usuário ao longo de cada molécula de DNA pode ser modulada ajustando um ou ambos os parâmetros. Além disso, o usuário pode optar por rotular os octâmeros de histonas com seu fluoróforo preferido.
3. Opcional: Adicione a proteína de ligação à cromatina ou outra proteína de interesse ao cap. 5 em um tampão apropriado.
4. Fluxo de todos os canais a 1,0 bar (~ 0,55 μL / s na configuração experimental atual) por 30 s para lavar os canais da célula de fluxo com amostras.
5. Defina o fluxo para 0,2 bar (~0,16 μL/s na configuração experimental atual). Mova as armadilhas ópticas (OTs) para o cap. 1 e pegue um par adequado de esferas revestidas de estreptavidina.
6. Mova os OTs para o cap. 3, realize uma calibração de força para o par de contas, ligue o laser confocal vermelho (ou outra linha de laser de sua escolha) e calibre a área de imagem.
7. Defina o fluxo para 0,2 bar e mova os OTs para o cap. 2. Pegue DNA biotinilado.
8. Mova os OTs para o cap. 3 e pare o fluxo. Aumente a distância entre os OTs para esticar o DNA e monitore a curva de distância-força (FD) associada para confirmar a presença de uma única corda de DNA (em oposição a várias amarras). A curva deve seguir o modelo de cadeia semelhante a um verme para dsDNA no comprimento de contorno dado²⁶.
9. Ajuste a distância entre os OTs para que a tensão do DNA leia aproximadamente 1 pN.
   NOTA: 1 pN de tensão é baixo o suficiente para permitir que os nucleossomos permaneçam envoltos pelo DNA²⁷ , mas é alto o suficiente para colocar toda a molécula de DNA dentro do eixo de imagem de varredura de linha.
10. Ative a varredura de linha para começar a coletar um quimógrafo com o laser vermelho ligado.
    NOTA: Quimógrafos ou varreduras 2D de DNA amarrado podem ser obtidos, conforme a preferência do usuário.
11. Mova os OTs para o cap. 4 com o fluxo desligado. Facilitado pelo Nap1, os HOs são carregados no DNA e embrulhados para formar nucleossomos em tempo real. A carga de nucleossomos é visualizada como trajetórias fluorescentes que aparecem no DNA dentro dos quimógrafos. Ao mesmo tempo, a formação de nucleossomos no DNA pode ser monitorada pelo aumento da força à medida que mais HOs são carregados quando as posições dos OTs são mantidas constantes.
    NOTA: O laser de excitação de fluorescência pode ser desligado durante as etapas de formação do nucleossomo para evitar o fotobranqueamento dos fluoróforos. Além disso, a ligação não específica de octâmeros de histonas ao DNA, em que os octâmeros não estão envoltos em nucleossomos, pode ocorrer usando este protocolo. Esses eventos de ligação não gerarão um "rasgo" quando o DNA for esticado, conforme descrito no protocolo de desempacotamento de nucleossomos (etapa 4) abaixo, e às vezes podem ser lavados por um fluxo tampão suave, principalmente se o tampão contiver DNA concorrente livre.
12. Quando o número aproximado desejado de nucleossomos for formado, comece a coletar dados.

4. Desembrulhando nucleossomos

1. Conclua as etapas 2 e 3.
2. Depois de formar uma corda de DNA contendo nucleossomos, mova os OTs para o cap. 3.
3. Prepare-se para experimentos de desdobramento de nucleossomos reduzindo a distância entre OTs até que a força seja aproximadamente zero. Zero a força.
4. Comece a afastar o OT 1 do OT 2 a uma velocidade constante de 0.1 μm/s. Em um quimógrafo, o cordão no OT 1 se moverá visualmente mais longe do cordão no OT 2. Na curva FD, a força aumentará à medida que a distância aumenta. À medida que os nucleossomos se desenrolam, aparecerão "rasgos" ou transições na força (~ 8-37 pN) que significam o desvendar do envoltório interno de nucleossomos individuais 27,28,29.
   NOTA: A força na qual o desembrulhamento ocorre depende da taxa de tração, que é esperada para processos fora do equilíbrio. Às vezes, vários nucleossomos se desenrolam ao mesmo tempo, produzindo uma mudança de distância maior na transição na curva FD. Além disso, o desenrolar do envoltório externo do nucleossomo não é facilmente visível neste ambiente experimental (consulte a seção Discussão).

5. Visualizando a ligação de proteínas à cromatina

1. Conclua as etapas 2 e 3.
2. Adicione 10 nM de histona de ligação marcada com Cy3 H1.4 a 500 μL de buffer de imagem no cap. 5.
   NOTA: Qualquer proteína de interesse pode ser adicionada ao cap. 5 em uma concentração de escolha (normalmente abaixo de 100 nM para visualização de molécula única).
3. Depois de formar uma corda de DNA contendo nucleossomos, ligue o laser verde além do laser vermelho e mova os OTs para o cap. 5 para obter imagens em tempo real da ligação de H1 à cromatina.
4. Continue coletando quimógrafos ou varreduras até que estatísticas suficientes tenham sido alcançadas (pelo menos ~ 10-20 quimógrafos, dependendo da frequência de eventos e dificuldade experimental).

Resultados

Usando a configuração descrita na etapa 3 (Figura 1A), a formação de nucleossomos ao longo da corda de DNA foi visualizada como o aparecimento de focos fluorescentes vermelhos em uma varredura 2D (Figuras 1B, à esquerda) ou trajetórias ao longo do tempo em um quimógrafo (Figura 1B, à direita). Os nucleossomos devidamente embrulhados produziram trajetórias de fluorescência que permaneceram ...

Discussão

O protocolo descrito oferece várias vantagens para a reconstituição do nucleossomo, incluindo a minimização de reagentes e tempo, além de permitir a formação de nucleossomos dependentes de chaperonas ao longo de qualquer sequência de DNA (potencialmente nativa). Além disso, o método in situ permite um fluxo de trabalho experimental mais simples e uma transição conveniente para ensaios de molécula única da mecânica do nucleossomo e da interação proteína-cromati...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate