In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

요약

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

초록

뉴클레오솜은 진핵생물 염색질의 주요 단위를 구성하며 생물물리학적 특성 및 염색질 결합 단백질과의 상호 작용에 관한 수많은 유익한 단일 분자 조사의 초점이었습니다. 이러한 연구를 위한 DNA의 뉴클레오솜 재구성에는 일반적으로 DNA 테더를 따라 형성된 뉴클레오솜의 배치와 수를 정밀하게 제어하는 염 투석 절차가 포함됩니다. 그러나 이 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 입력으로 상당한 양의 DNA와 히스톤 옥타머가 필요합니다. 대안 전략을 제공하기 위해, 히스톤 샤페론 Nap1을 활용하는 단일 분자 힘 및 형광 현미경을 위한 현장 뉴클레오솜 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 통해 사용자는 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열 없이도 모든 DNA 템플릿에서 뉴클레오솜을 조립하고, 필요에 따라 뉴클레오솜 밀도를 조정하고, 더 적은 시약을 사용할 수 있습니다. In situ 뉴클레오솜 형성은 몇 초 내에 발생하여 실험 워크플로우가 더 간단하고 단일 분자 측정으로 편리하게 전환할 수 있습니다. 뉴클레오솜 역학을 조사하고 염색질에 대한 개별 단백질의 거동을 시각화하기 위한 두 가지 다운스트림 분석의 예가 자세히 설명되어 있습니다.

서문

진핵 염색질의 주요 포장 단위는 뉴클레오솜으로, DNA의 ~ 147 염기쌍 (bps)이 코어 히스톤 단백질 ^1,2의 옥타머를 감싸고 있습니다. 게놈 패키징 외에도 뉴클레오솜 아키텍처는 다양한 기능을 수행할 때 염색질 결합 단백질에 의해 활용될 수 있는 생물물리학적 조절의 또 다른 풍부한 층 역할을 합니다 ^3,4. 뉴클레오솜의 물리적 특성에 대한 실험적 접근 및 측정은 기술적으로 어려웠는데, 이는 이러한 단위가 미세한 규모(예: 나노미터 길이, 피코네톤 힘)에서 작동하기 때문에 프로빙에는 기능을 의미 있게 알려줄 수 있는 충분한 감도와 정밀도가 필요하기 때문입니다. 더욱이, 염색질 결합 단백질은 종종 기질과 일시적으로 결합하며, 대부분의 앙상블 접근법은 이러한 상호 작용의 동역학을 알려주는 적절한 시간적 해상도가 부족합니다⁵. 다행히도, 단 하나 분자 기술의 출현은 즉시에 있는 개인적인 단백질 및 그들의 상호 작용을 구상하고 교묘히 다루는 것을 가능하게 해, nanoscale⁶에 일어나는 이 분자 사건에 관하여 기계론적인 정보를 계시하. 특히, 단일 분자 상관 힘 및 형광 현미경(smCFFM)은 고분해능 형광 검출 및 힘 조작 도구를 모두 활용하여 염색질 및 염색질-단백질 복합체의 역학, 조성 및 조정을 동시에 해결합니다 ^7,8.

힘 조작 방법으로 "광학 핀셋"을 특별히 사용하는 smCFFM에서는 단단히 집중된 레이저를 사용하여 일반적으로 미크론 크기의 플라스틱 비드와 같은 유전체 물체를 3차원⁹로 가둡니다. DNA 조각과 같은 생체 중합체는 비드에 접합될 수 있으며(예를 들어, 스트렙타비딘-비오틴, 디곡시제닌-항-디곡시제닌 항체 결합을 통해), 사용자는 보정된 힘을 적용하고 시스템(¹⁰)에 의해 생성된 힘/변위를 측정할 수 있다. 추가된 형광 모듈을 사용하면 동시 다색 형광 이미징을 통해 단백질 구성 및 거동을 추적할 수 있습니다.

smCFFM에 대한 뉴클레오솜 템플릿을 재구성하는 주류 방법은 염 투석 11,12,13에 의해 맞춤형 DNA 템플릿에 뉴클레오솜을 조립하는 것입니다. 이 절차에서, 정제 된 히스톤 옥타 머는 고 염 완충액 (~ 1M 염화나트륨)에서 DNA 템플릿과 함께 배양되고, 염이 천천히 투석됨에 따라 뉴클레오솜은 서열 의존적 위치 방식으로 DNA에 자발적으로 조립됩니다^14,15. 따라서, 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열(예를 들어, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷)이 DNA 템플릿 내에 통합되어 맞춤형 뉴클레오솜 어레이를 생성하는 것이 일반적이다. 이 잘 확립된 방법은 DNA에 걸친 뉴클레오솜의 배치와 수에 대한 정밀한 제어를 제공하지만, 몇 가지 단점이 있습니다: (1) 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 DNA 서열의 통합은 염색질 결합 단백질의 활성을 편향시키는 인위적으로 안정적인 뉴클레오솜을 생성할 수 있습니다. (2) 뉴클레오솜 형성을 위한 염 투석 과정에는 많은 양의 DNA와 옥타머가 필요합니다. (3) 이 절차는 최적의 뉴클레오솜 어레이 밀도를 위해 올바른 DNA 대 옥타머 비율을 적정하는 데 상당한 노력뿐만 아니라 1-며칠의 작업이 필요합니다.

이 원고에서는 생체 내 뉴클레오솜 형성의 생리적 경로와 유사한 재조합 히스톤 샤페론 Nap1을 사용하여 단일 분자 상관력 및 형광 현미경 내에서 DNA를 따라 제자리에서 DNA를 형성하는 대체 방법을 설명합니다. 이 방법을 통해 사용자는 비특이적 DNA 염기서열에서 뉴클레오솜을 조립하고, 뉴클레오솜 밀도를 쉽게 조정하고, 훨씬 더 적은 양의 시약을 몇 분 내에 사용할 수 있습니다. 또한 in situ 뉴클레오솜 DNA 테더의 형성은 더 간단한 실험 워크플로우와 내장된 단일 분자 시각화 및 조작의 편리함을 가능하게 합니다. 따라서 균일하고 특이적인 뉴클레오솜 포지셔닝이 필요하지 않은 경우 이 프로토콜은 크로마틴에 대한 뉴클레오솜 역학 또는 단백질 거동 조사에 유용한 옵션을 제공하며, 이에 대해 예제 분석도 설명합니다.

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 비오틴화된 DNA의 제조

1. λ DNA 20μg, 비오틴-dCTP 33μM, 비오틴-dUTP 33μM, 비오틴-dATP 33μM, dGTP 33μM, Klenow 효소 10단위 및 1x NEB Buffer 2를 포함하는 120μL 부피 반응을 준비합니다.
   참고: 이 절차는 특히 12-뉴클레오티드(nt) 5' 단일 가닥(ss) DNA 돌출부(²³)를 포함하는 선형 이중 가닥(ds) 메틸화가 없는 박테리오파지 λ 게놈 DNA(48,502bps)를 사용합니다. 그러나, 프로토콜은 적어도 몇 개의 ss 5' 돌출부(nts)를 포함하는 경우, 선형 dsDNA의 모든 길이 또는 서열을 사용하도록 조정할 수 있으며, 길이 및 nt 서열은 광학 트랩 간의 다운스트림 테더링을 위해 각 말단에 설치된 비오틴화된 nt의 수를 나타냅니다. 또한 반응을 축소할 수 있습니다. 예를 들어, 5μg의 DNA를 30μL 부피 반응에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 방식으로 생성된 DNA 기질은 비틀림에 의해 구속되지 않습니다. 비틀림 제약이 있는 DNA를 생성하는 프로토콜에 대해서는 이전에 발표된 보고서^24,25를 참조하십시오.
2. 실온에서 15분 동안 반응을 배양합니다.
3. 10mM의 EDTA를 추가하고 75°C에서 20분 동안 배양합니다.
4. 에탄올 침전을 수행하여 비오틴화된 DNA 생성물을 얻습니다.
   1. 0.1M 아세트산 나트륨 0.1x 부피와 얼음처럼 차가운 100% 에탄올 3배를 추가합니다. -20 °C에서 최소 1시간에서 밤새 유지하십시오. 13,500 x g 에서 4 °C에서 30분 동안 원심분리합니다.
   2. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 조심스럽게 제거하고 1mL의 75% 에탄올을 추가합니다. 13,500 x g 에서 4 °C에서 1분 동안 원심분리합니다.
   3. 상층액 제거, 에탄올 첨가 및 원심분리 단계를 반복합니다.
   4. 모든 상층액을 조심스럽게 제거하고 펠릿을 10분 동안 자연 건조시킵니다. 펠릿을 100-200 μL의 TE 완충액 또는 ddH₂O에 용해시킵니다(용해를 용이하게 하기 위해 37°C에서 배양 가능). Nanodrop 분광 광도계를 사용하여 농도를 측정합니다.

2. 플로우 셀(flow cell)의 채널 준비

참고: 이 절차는 상업적으로 이용 가능한 미세유체 칩( 재료 표 참조)을 기반으로 하지만 다중 채널 플로우 셀이 있는 모든 smCFFM 기기에 적용할 수 있습니다.

1. 부동태화 채널(ch.) 4 및 5(또는 단백질을 포함할 모든 ch. )( 그림 1A의 채널 개략도 참조). 각 채널에 500μL의 0.1% BSA를 추가하고 0.8bar(내경이 0.010인치인 튜빙의 경우 ~0.45μL/s)로 8분 동안 흐릅니다. 용액을 제거합니다.
2. 각 채널에 500μL의 0.05% Pluronic-F127을 추가하고 0.8bar에서 8분 동안 흐릅니다. 용액을 제거하고 1x PBS로 주사기를 헹굽니다. 각 채널에 2mL의 1x PBS를 추가하고 0.8bar에서 27분 동안 흐릅니다.
3. 스트렙타비딘 코팅 비드의 원액을 소용돌이치고(이 절차에서는 3.13μm 크기의 비드 사용) 비드 용액 2.15μL를 1x PBS 1mL에 추가합니다. ch. 1에 추가하십시오.
   참고: 스트렙타비딘 코팅 비드의 크기와 농도는 사용자 선호도에 따라 조정할 수 있습니다.
4. 30-80ng의 비오틴화 λ DNA를 1x PBS 1mL에 추가합니다. ch. 2에 추가하십시오.
   참고: 비오틴화된 DNA의 농도는 사용자 취향에 맞게 조정할 수 있습니다. 더 많은 양의 DNA는 DNA 밧줄을 형성하는 빈도를 증가시키지만 한 번에 여러 DNA 분자를 밧줄로 묶는 빈도도 증가하여 실험의 어려움을 가중시킬 수 있습니다.

3. Nap1 매개 in situ nucleosome formation

1. 500μL의 protein-free 이미지 버퍼를 ch. 3에 추가합니다.
   참고: ch. 3 의 완충액 조성은 유연하며 뉴클레오솜과 관심 특정 단백질 모두에 적합해야 합니다. 선택적으로, 사용자는 뉴클레오솜으로 적절하게 감싸지지 않은 히스톤 옥타머를 제거하기 위해 형광단 및/또는 경쟁사 DNA의 광표백을 줄이기 위해 산소 제거 시스템을 추가하도록 선택할 수 있습니다.
2. 2 nM S. cerevisiae Nap1 및 2-5 nM LD655 표지 H4 히스톤 옥타머 (HO)를 1x HR 완충액¹⁸의 500 μL에 첨가하십시오. ch. 4에 추가하십시오.
   알림: 히스톤 옥타머 및 Nap1은 상업적으로 구입하거나 사내에서 준비할 수 있습니다( 재료 표 참조). 테더링된 각 DNA를 따라 형성되는 뉴클레오솜의 수는 옥타머 농도와 이 채널에서 보낸 시간에 따라 달라집니다. 각 DNA 분자를 따라 사용자가 원하는 대략적인 뉴클레오솜 밀도는 이러한 매개변수 중 하나 또는 모두를 조정하여 조절할 수 있습니다. 또한 사용자는 선호하는 형광단으로 히스톤 옥타머를 라벨링하도록 선택할 수 있습니다.
3. 선택 사항: 염색질 결합 단백질 또는 기타 관심 단백질을 적절한 완충액에 ch. 5 에 추가합니다.
4. 모든 채널을 1.0bar(현재 실험 설정에서 ~0.55μL/s)에서 30초 동안 흐르게 하여 플로우 셀 채널을 샘플로 플러시합니다.
5. 유량을 0.2bar(현재 실험 설정에서 ~0.16μL/s)로 설정합니다. 광학 트랩(OT)을 ch. 1 로 이동하고 적절한 스트렙타비딘 코팅 비드 쌍을 포착합니다.
6. OT를 ch. 3으로 이동하고, 비드 쌍에 대한 힘 보정을 수행하고, 적색 공초점 레이저(또는 선택한 다른 레이저 라인)를 켜고, 이미징 영역을 보정합니다.
7. 흐름을 0.2bar로 설정하고 OT를 ch. 2로 이동합니다. 비오틴화된 DNA를 포착합니다.
8. OT를 ch. 3 으로 이동하고 흐름을 중지합니다. OT 사이의 거리를 늘려 DNA를 늘리고 관련 힘-거리(FD) 곡선을 모니터링하여 단일 DNA 테더(여러 테더와 반대)의 존재를 확인합니다. 곡선은 주어진 윤곽 길이²⁶에서 dsDNA에 대한 웜 유사 사슬 모델을 따라야 합니다.
9. DNA 장력이 약 1pN이 되도록 OT 사이의 거리를 조정합니다.
   참고: 1pN의 장력은 뉴클레오솜이 DNA²⁷ 로 둘러싸인 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분히 낮지만 전체 DNA 분자를 라인 스캐닝 이미징 축 내에 배치할 수 있을 만큼 충분히 높습니다.
10. 라인 스캔을 켜서 빨간색 레이저가 켜진 상태에서 카이모그래프 수집을 시작합니다.
    참고: 사용자 선호도에 따라 테더링된 DNA의 Kymographs 또는 2D 스캔을 얻을 수 있습니다.
11. 흐름이 꺼진 상태에서 OT를 ch. 4 로 이동합니다. Nap1에 의해 촉진된 HO는 DNA에 로드되고 래핑되어 실시간으로 뉴클레오솜을 형성합니다. 뉴클레오솜 로딩은 카이모그래프 내의 DNA에 나타나는 형광 궤적으로 시각화됩니다. 동시에, DNA의 뉴클레오솜 형성은 OT의 위치가 일정하게 유지될 때 더 많은 HO가 로드됨에 따라 힘 증가에 의해 모니터링될 수 있습니다.
    참고: 형광 여기 레이저는 형광단의 광표백을 방지하기 위해 뉴클레오솜 형성 단계에서 끌 수 있습니다. 또한, 히스톤 옥타머가 뉴클레오솜으로 싸여 있지 않은 DNA에 대한 히스톤 옥타머의 비특이적 결합은 이 프로토콜을 사용하여 발생할 수 있습니다. 이러한 결합 이벤트는 아래의 Unwrapping Nucleosomes (step 4) 프로토콜에 설명된 대로 DNA가 늘어날 때 "rip"을 생성하지 않으며, 특히 완충액에 자유 경쟁자 DNA가 포함된 경우 부드러운 완충액 흐름에 의해 씻겨질 수 있습니다.
12. 대략적으로 원하는 수의 뉴클레오솜이 형성되면 데이터 수집을 시작합니다.

4. 뉴클레오솜 풀기

1. 2단계와 3단계를 완료합니다.
2. 뉴클레오솜을 포함하는 DNA 테더를 형성한 후 OT를 ch. 3으로 이동합니다.
3. 힘이 대략 0이 될 때까지 OT 사이의 거리를 줄여 뉴클레오솜 해제 실험을 준비합니다. 힘을 0으로 만듭니다.
4. 0.1μm/s의 일정한 속도로 OT 1을 OT 2에서 멀어지게 합니다. 카이모그래프에서 OT 1의 비드는 시각적으로 OT 2의 비드에서 더 멀리 이동합니다. FD 곡선에서 거리가 증가함에 따라 힘이 증가합니다. 뉴클레오솜이 풀리면 힘(~8-37 pN)에 "찢어짐" 또는 전이가 나타나는데, 이는 개별 뉴클레오솜 27,28,29의 내부 랩이 풀리는 것을 의미합니다.
   참고: 언래핑이 발생하는 힘은 평형이 아닌 프로세스에서 예상되는 풀링 속도에 따라 달라집니다. 때로는 여러 개의 뉴클레오솜이 한 번에 풀리면서 FD 곡선의 전이에서 더 큰 거리 변화를 일으킵니다. 또한, 뉴클레오솜의 외부 랩이 풀리는 것은 이 실험 환경에서 쉽게 볼 수 없습니다(토론 섹션 참조).

5. 염색질에 결합하는 단백질 시각화

1. 2단계와 3단계를 완료합니다.
2. ch. 5에서 500μL의 이미지 버퍼에 10nM의 Cy3 표지 링커 히스톤 H1.4를 추가합니다.
   참고: 관심 있는 모든 단백질을 원하는 농도로 ch. 5 에 추가할 수 있습니다(일반적으로 단일 분자 시각화의 경우 100nM 미만).
3. 뉴클레오솜을 포함하는 DNA 테더를 형성한 후 적색 레이저 외에 녹색 레이저를 켜고 OT를 ch. 5 로 이동하여 크로마틴에 결합하는 H1의 실시간 이미징을 수행합니다.
4. 충분한 통계가 달성될 때까지 카이모그래프 또는 스캔을 계속 수집합니다(이벤트 빈도 및 실험 난이도에 따라 최소 10~20개의 카이모그래프).

결과

3단계(그림 1A)에 설명된 설정을 사용하여 DNA 테더를 따른 뉴클레오솜 형성을 2D 스캔(그림 1B, 왼쪽)에서 빨간색 형광 병소의 모양 또는 카이모그래프(그림 1B, 오른쪽)에서 시간 경과에 따른 궤적으로 시각화했습니다. 적절하게 래핑된 뉴클레오솜은 컨포칼 검출의 회절 한계(~300nm) 내에서 시간이 지남에 따...

토론

설명된 프로토콜은 시약 및 시간을 최소화하고 임의의 (잠재적으로 네이티브) DNA 서열을 따라 샤페론 의존성 뉴클레오솜 형성을 가능하게 하는 것을 포함하여 뉴클레오솜 재구성을 위한 여러 이점을 제공합니다. 또한, in situ 분석법은 더 간단한 실험 워크플로우를 가능하게 하고 뉴클레오솜 역학 및 단백질-염색질 상호 작용의 단일 분자 분석으로 편리하게 전환할...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate