In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

요약

이 기사에서는 단일 분자 상관력 및 형광 현미경을 위해 뉴클레오솜 함유 DNA 테더를 재구성하는 자세한 실험 절차를 제시합니다. 또한 염색질 상호 작용 단백질의 결합 거동을 시각화하고 뉴클레오솜의 물리적 특성 변화를 분석하기 위해 수행할 수 있는 여러 다운스트림 실험에 대해 설명합니다.

초록

뉴클레오솜은 진핵생물 염색질의 주요 단위를 구성하며 생물물리학적 특성 및 염색질 결합 단백질과의 상호 작용에 관한 수많은 유익한 단일 분자 조사의 초점이었습니다. 이러한 연구를 위한 DNA의 뉴클레오솜 재구성에는 일반적으로 DNA 테더를 따라 형성된 뉴클레오솜의 배치와 수를 정밀하게 제어하는 염 투석 절차가 포함됩니다. 그러나 이 프로토콜은 시간이 많이 걸리고 입력으로 상당한 양의 DNA와 히스톤 옥타머가 필요합니다. 대안 전략을 제공하기 위해, 히스톤 샤페론 Nap1을 활용하는 단일 분자 힘 및 형광 현미경을 위한 현장 뉴클레오솜 재구성 방법에 대해 설명합니다. 이 방법을 통해 사용자는 강력한 뉴클레오솜 포지셔닝 서열 없이도 모든 DNA 템플릿에서 뉴클레오솜을 조립하고, 필요에 따라 뉴클레오솜 밀도를 조정하고, 더 적은 시약을 사용할 수 있습니다. In situ 뉴클레오솜 형성은 몇 초 내에 발생하여 실험 워크플로우가 더 간단하고 단일 분자 측정으로 편리하게 전환할 수 있습니다. 뉴클레오솜 역학을 조사하고 염색질에 대한 개별 단백질의 거동을 시각화하기 위한 두 가지 다운스트림 분석의 예가 자세히 설명되어 있습니다.

서문

진핵 염색질의 주요 포장 단위는 뉴클레오솜으로, DNA의 ~ 147 염기쌍 (bps)이 코어 히스톤 단백질 ^1,2의 옥타머를 감싸고 있습니다. 게놈 패키징 외에도 뉴클레오솜 아키텍처는 다양한 기능을 수행할 때 염색질 결합 단백질에 의해 활용될 수 있는 생물물리학적 조절의 또 다른 풍부한 층 역할을 합니다 ^3,4. 뉴클레오솜의 물리적 특성에 대한 실험적 접근 및 측정은 기술적으로 어려웠는데, 이는 이러한 단위가 미세한 규모(예: 나노미터 길이, 피코네톤 힘)에서 작동하기 때문에 프로빙에는 기능을 의미 있게 알려줄 수 있는 충분한 감도와 정밀도가 필요하기 때문입니다. 더욱이, 염색질 결합 단백질은 종종 기질과 일시적으로 결합하며, 대부분의 앙상블 접근법은 이러한 상호 작용의 동역학을 알려주는 적절한 시간적 해상도가 부족합니다⁵. 다행히도, 단 하나 분자 기술의 출현은 즉시에 있는 개인적인 단백질 및 그들의 상호 작용을 구상하고 교묘히 다루는 것을 가능하게 해, nanoscale

프로토콜

연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 비오틴화된 DNA의 제조

1. λ DNA 20μg, 비오틴-dCTP 33μM, 비오틴-dUTP 33μM, 비오틴-dATP 33μM, dGTP 33μM, Klenow 효소 10단위 및 1x NEB Buffer 2를 포함하는 120μL 부피 반응을 준비합니다.
   참고: 이 절차는 특히 12-뉴클레오티드(nt) 5' 단일 가닥(ss) DNA 돌출부(²³)를 포함하는 선형 이중 가닥(ds) 메틸화가 없는 박테리오파지 λ 게놈 DNA(48,502bps)를 사용합니다. 그러나, 프로토콜은 적어도 몇 개의 ss 5' 돌출부(nts)를 포함하는 경우, 선형 dsDNA의 모든 길이 또는 서열을 사용하도록 조정할 수 있으며, 길이 및 nt 서열은 광학 트랩 간의 다운스트림 테더링을 위해 각 말단에 설치된 비오틴화된 nt의 수를 나타냅니다. 또한 반응을 축소할 수 있습니다. 예를 들어, 5μg의 DNA를 30μL 부피 반응에 사용할 수 있습니다. 또한, 이러한 방식으로 생성된 DNA 기질은 비틀림에 의해 구....

토론

설명된 프로토콜은 시약 및 시간을 최소화하고 임의의 (잠재적으로 네이티브) DNA 서열을 따라 샤페론 의존성 뉴클레오솜 형성을 가능하게 하는 것을 포함하여 뉴클레오솜 재구성을 위한 여러 이점을 제공합니다. 또한, in situ 분석법은 더 간단한 실험 워크플로우를 가능하게 하고 뉴클레오솜 역학 및 단백질-염색질 상호 작용의 단일 분자 분석으로 편리하게 전환할.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate