In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

Zusammenfassung

Nukleosomen stellen die primäre Einheit des eukaryotischen Chromatins dar und standen im Mittelpunkt zahlreicher informativer Einzelmoleküluntersuchungen hinsichtlich ihrer biophysikalischen Eigenschaften und Wechselwirkungen mit Chromatin-bindenden Proteinen. Die Rekonstitution von Nukleosomen auf DNA für diese Studien beinhaltet in der Regel ein Salzdialyseverfahren, das eine genaue Kontrolle über die Platzierung und Anzahl der Nukleosomen ermöglicht, die entlang eines DNA-Haltegurts gebildet werden. Dieses Protokoll ist jedoch zeitaufwändig und erfordert eine beträchtliche Menge an DNA und Histon-Oktameren als Eingaben. Um eine alternative Strategie anbieten zu können, wird eine in situ Nukleosomen-Rekonstitutionsmethode für die Einzelmolekül-Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, die das Histon-Chaperon Nap1 verwendet. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, Nukleosomen auf jeder DNA-Vorlage zu assemblieren, ohne dass starke Nukleosomenpositionierungssequenzen erforderlich sind, die Nukleosomendichte bei Bedarf anzupassen und weniger Reagenzien zu verwenden. Die In-situ-Nukleosomenbildung erfolgt innerhalb von Sekunden, was einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang zu Einzelmolekülmessungen ermöglicht. Beispiele für zwei nachgeschaltete Assays zur Untersuchung der Nukleosomenmechanik und zur Visualisierung des Verhaltens einzelner Proteine auf dem Chromatin werden weiter beschrieben.

Einleitung

Die primäre Verpackungseinheit des eukaryotischen Chromatins ist das Nukleosom, in dem ~147 Basenpaare (bps) der DNA um ein Oktamer aus Kernhistonenproteinen ^1,2 gewickelt sind. Neben der Genomverpackung dient die Nukleosomenarchitektur als eine weitere reichhaltige Schicht biophysikalischer Regulation, die von Chromatin-bindenden Proteinen genutzt werden kann, wenn sie ihre verschiedenen Funktionen erfüllen ^3,4. Der experimentelle Zugang und die Messung der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen war eine technische Herausforderung, da diese Einheiten auf winzigen Skalen (z. B. Nanometerlängen, Piconewtonkräfte) arbeiten und ihre Sondierung daher eine ausreichende Empfindlichkeit und Präzision erfordert, um die Funktion sinnvoll zu informieren. Darüber hinaus binden sich Chromatin-bindende Proteine oft vorübergehend an ihre Substrate, und den meisten Ensemble-Ansätzen fehlt eine angemessene zeitliche Auflösung, um die Kinetik dieser Wechselwirkungen zu informieren⁵. Glücklicherweise hat das Aufkommen von Einzelmolekültechniken es ermöglicht, einzelne Proteine und ihre Wechselwirkungen in Echtzeit zu visualisieren und zu manipulieren, wodurch mechanistische Informationen über diese molekularen Ereignisse auf der Nanoskala enthüllt^{werden 6}. Insbesondere die Einzelmolekül-Korrelative Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie (smCFFM) nutzt sowohl hochauflösende Fluoreszenzdetektions- als auch Kraftmanipulationswerkzeuge, um gleichzeitig die Mechanik, Zusammensetzung und Koordination von Chromatin- und Chromatin-Protein-Komplexen aufzuklären ^7,8.

Bei der smCFFM, bei der speziell eine "optische Pinzette" als Kraftmanipulationsmethode verwendet wird, wird ein eng fokussierter Laser verwendet, um ein dielektrisches Objekt, typischerweise eine mikrometergroße Kunststoffperle, in drei Dimensionen einzufangen⁹. Ein Biopolymer, wie z. B. ein Stück DNA, kann an die Kugel konjugiert werden (z. B. über Streptavidin-Biotin, Digoxigenin-Anti-Digoxigenin-Antikörperbindung), und der Benutzer kann sowohl eine kalibrierte Kraft aufbringen als auch die von dem System¹⁰ erzeugte Kraft/Verschiebung messen. Das zusätzliche Fluoreszenzmodul ermöglicht die gleichzeitige mehrfarbige Fluoreszenzbildgebung, um die Zusammensetzung und das Verhalten von Proteinen zu verfolgen.

Die gängige Methode zur Rekonstitution von Nukleosomen-Templates für smCFFM beinhaltet die Assemblierung von Nukleosomen auf benutzerdefinierten DNA-Templates durch Salzdialyse 11,12,13. Bei diesem Verfahren werden gereinigte Histon-Oktamere mit DNA-Templates in einem Puffer mit hohem Salzgehalt (~1 M Natriumchlorid) inkubiert, und während das Salz langsam wegdialysiert wird, lagern sich Nukleosomen spontan auf der DNA in einer sequenzabhängigen Positionsweise an^14,15 an. Daher ist es üblich, dass starke Nukleosomenpositionierungssequenzen (z. B. Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷) in die DNA-Templates eingebaut werden, um benutzerdefinierte Nukleosomenarrays zu generieren. Obwohl diese gut etablierte Methode eine präzise Kontrolle über die Platzierung und Anzahl der Nukleosomen in der DNA bietet, hat sie mehrere Nachteile: (1) Der Einbau von DNA-Sequenzen mit starker Nukleosomenpositionierung kann künstlich stabile Nukleosomen erzeugen, die die Aktivität von Chromatin-bindenden Proteinen beeinflussen, (2) der Prozess der Salzdialyse zur Nukleosomenbildung erfordert große Mengen an DNA und Oktamern, und (3) das Verfahren erfordert einen bis mehrere Tage Arbeit sowie einen erheblichen Aufwand, um das korrekte DNA-zu-Oktamer-Verhältnis für eine optimale Nukleosomenarray-Dichte zu titrieren.

In diesem Manuskript beschreiben wir eine alternative Methode zur Bildung von Nukleosomen entlang der DNA in situ in einem Einzelmolekül-Korrelationskraft- und Fluoreszenzmikroskop unter Verwendung des rekombinanten Histon-Chaperons Nap1, das dem physiologischen Weg der Nukleosomenbildung in vivo ähnelt 18,19,20,21,22. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, Nukleosomen auf unspezifischen DNA-Sequenzen zu assemblieren, die Nukleosomendichte einfach einzustellen und deutlich weniger Reagenzien zu verbrauchen – und das alles innerhalb von Minuten. Darüber hinaus ermöglicht die Bildung von nukleosomalen DNA-Fesseln in situ einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und den Komfort der integrierten Einzelmolekül-Visualisierung und -Manipulation. Wenn also eine einheitliche und spezifische Nukleosomenpositionierung nicht erforderlich ist, bietet dieses Protokoll eine nützliche Option für die Untersuchung der Nukleosomenmechanik oder des Proteinverhaltens auf Chromatin, für die wir auch Beispielassays beschreiben.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von biotinylierter DNA

1. Bereiten Sie eine 120-μl-Volumenreaktion vor, die 20 μg λ-DNA, 33 μM Biotin-dCTP, 33 μM Biotin-dUTP, 33 μM Biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 Einheiten Klenow-Enzym und 1x NEB-Puffer 2 enthält.
   HINWEIS: Dieses Verfahren verwendet speziell lineare doppelsträngige (ds) methylierungsfreie Bakteriophagen λ genomische DNA (48.502 bps), die einen 12-Nukleotid (nt) 5' einzelsträngigen (ss) DNA-Überhang²³ enthält. Das Protokoll kann jedoch so angepasst werden, dass es eine beliebige Länge oder Sequenz linearer dsDNA verwendet, vorausgesetzt, dass es mindestens mehrere nts von ss 5'-Überhängen enthält, wobei die Länge und nt-Sequenz die Anzahl der biotinylierten nts vorgibt, die an jedem Ende für das stromabwärts liegende Tethering zwischen optischen Fallen installiert sind. Zusätzlich kann die Reaktion verkleinert werden. So können beispielsweise 5 μg DNA in einer 30 μL Volumenreaktion verwendet werden. Darüber hinaus sind die auf diese Weise erzeugten DNA-Substrate nicht torsionsgebunden. Für Protokolle zur Erstellung torsionsbeschränkter DNA verweisen wir auf die zuvor veröffentlichten Berichte^24,25.
2. Inkubieren Sie die Reaktion 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
3. 10 mM EDTA zugeben und 20 min bei 75 °C inkubieren.
4. Führen Sie eine Ethanolfällung durch, um das biotinylierte DNA-Produkt zu erhalten.
   1. Fügen Sie 0,1x Volumen 3 M Natriumacetat und 3x Volumen eiskaltes 100% Ethanol hinzu. Bei -20 °C mindestens 1 h bis über Nacht aufbewahren. Zentrifugieren bei 13.500 x g für 30 min bei 4 °C.
   2. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand, ohne das Pellet zu stören, und fügen Sie 1 ml 75%iges Ethanol hinzu. Zentrifugieren Sie bei 13.500 x g für 1 min bei 4 °C.
   3. Wiederholen Sie die Schritte zur Entfernung des Überstands, zur Zugabe von Ethanol und zur Zentrifugation.
   4. Entfernen Sie vorsichtig den gesamten Überstand und lassen Sie das Pellet 10 Minuten an der Luft trocknen. Das Pellet wird in 100-200 μl TE-Puffer oder ddH₂O aufgelöst (kann bei 37 °C inkubiert werden, um das Auflösen zu erleichtern). Messen Sie die Konzentration mit einem Nanodrop-Spektralphotometer.

2. Vorbereitung der Kanäle in einer Durchflusszelle

HINWEIS: Dieses Verfahren basiert auf einem kommerziell erhältlichen Mikrofluidik-Chip (siehe Materialtabelle), kann aber an jedes smCFFM-Gerät mit einer Mehrkanal-Durchflusszelle angepasst werden.

1. Passivieren Sie die Kanäle (Kap.) 4 und 5 (oder alle Kap. , die Proteine enthalten) (siehe Schema der Kanäle in Abbildung 1A). Geben Sie 500 μl 0,1 % BSA in jeden Kanal und fließen Sie 8 Minuten lang mit 0,8 bar (~0,45 μl/s für Schläuche mit einem Innendurchmesser von 0,010 Zoll).
2. Geben Sie 500 μl 0,05 % Pluronic-F127 in jeden Kanal und fließen Sie 8 Minuten lang mit 0,8 bar. Entfernen Sie die Lösung und spülen Sie die Spritzen mit 1x PBS aus. Geben Sie 2 mL 1x PBS in jeden Kanal und fließen Sie 27 Minuten lang mit 0,8 bar.
3. Ziehen Sie die Stammlösung aus Streptavidin-beschichteten Kügelchen vor (bei diesem Verfahren werden Kügelchen mit einer Größe von 3,13 μm verwendet) und fügen Sie 2,15 μl der Bead-Lösung zu 1 mL 1x PBS hinzu. Zu L. 1 hinzufügen.
   HINWEIS: Die Größe und Konzentration der mit Streptavidin beschichteten Kügelchen kann je nach Benutzerwunsch angepasst werden.
4. Fügen Sie 30-80 ng biotinylierte λ-DNA zu 1 ml 1x PBS hinzu. Zu Kap. 2 hinzufügen.
   HINWEIS: Die Konzentration der biotinylierten DNA kann nach den Wünschen des Benutzers angepasst werden. Größere DNA-Mengen erhöhen die Häufigkeit der Bildung von DNA-Fesseln, erhöhen aber auch die Häufigkeit der gleichzeitigen Bindung mehrerer DNA-Moleküle, was das Experiment erschweren kann.

3. Nap1-vermittelte in situ Nukleosomenbildung

1. Fügen Sie 500 μl proteinfreien Bildpuffer zu Kap. 3 hinzu.
   HINWEIS: Die Pufferzusammensetzung in Kapitel 3 ist flexibel und sollte sowohl für die Nukleosomen als auch für das/die spezifische(n) Protein(e) von Interesse geeignet sein. Optional können Anwender Sauerstoff-Scavenging-Systeme hinzufügen, um die Photobleiche von Fluorophoren und/oder Konkurrenz-DNA zu reduzieren, um Histon-Oktamere zu entfernen, die nicht richtig in Nukleosomen verpackt sind.
2. 2 nM S. cerevisiae Nap1 und 2-5 nM LD655-markiertes H4-Histon-Oktamer (HO) werden zu 500 μl 1x HR-Puffer¹⁸ hinzugefügt. Zu Kap. 4 hinzufügen.
   HINWEIS: Histon-Oktamere und Nap1 können kommerziell erworben oder im eigenen Haus hergestellt werden (siehe Materialtabelle). Die Anzahl der Nukleosomen, die entlang jeder angebundenen DNA gebildet werden sollen, hängt von der Oktamerkonzentration sowie der in diesem Kanal verbrachten Zeit ab. Die vom Benutzer gewünschte und ungefähre Nukleosomendichte entlang jedes DNA-Moleküls kann durch Anpassen eines oder beider dieser Parameter moduliert werden. Darüber hinaus kann der Benutzer wählen, Histon-Oktamere mit seinem bevorzugten Fluorophor zu markieren.
3. Optional: Geben Sie das Chromatin-bindende Protein oder ein anderes Protein von Interesse zu Kap. 5 in einem geeigneten Puffer.
4. Fließen Sie alle Kanäle mit 1,0 bar (~0,55 μL/s im aktuellen Versuchsaufbau) für 30 s, um die Kanäle der Durchflusszelle mit Proben zu spülen.
5. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 bar ein (~0,16 μL/s im aktuellen Versuchsaufbau). Bewegen Sie die optischen Fallen (OTs) auf Kanal 1 und fangen Sie ein geeignetes Paar Streptavidin-beschichteter Kügelchen.
6. Bewegen Sie die OTs auf Kanal 3, führen Sie eine Kraftkalibrierung für das Perlenpaar durch, schalten Sie den roten konfokalen Laser (oder eine andere Laserlinie Ihrer Wahl) ein und kalibrieren Sie den Bildgebungsbereich.
7. Stellen Sie den Durchfluss auf 0,2 bar ein und verschieben Sie OTs auf Kanal 2. Fangen Sie biotinylierte DNA.
8. Verschieben Sie die OTs nach Kanal 3 und stoppen Sie den Fluss. Vergrößern Sie den Abstand zwischen den OTs, um die DNA zu dehnen, und überwachen Sie die zugehörige Kraft-Entfernungs-Kurve (FD), um das Vorhandensein eines einzigen DNA-Tethers (im Gegensatz zu mehreren Tethers) zu bestätigen. Die Kurve sollte dem wurmartigen Kettenmodell für dsDNA bei der gegebenen Konturlänge²⁶ folgen.
9. Passen Sie den Abstand zwischen den OTs so an, dass die DNA-Spannung etwa 1 pN anzeigt.
   HINWEIS: Die Spannung von 1 pN ist niedrig genug, damit die Nukleosomen von DNA²⁷ umhüllt bleiben können, aber hoch genug, um das gesamte DNA-Molekül innerhalb der Zeilenabtastachse zu platzieren.
10. Schalten Sie die Zeilenabtastung ein, um mit eingeschaltetem roten Laser einen Kymographen zu erfassen.
    HINWEIS: Kymographen oder 2D-Scans von angebundener DNA können je nach Benutzerwunsch erhalten werden.
11. Bewegen Sie die OTs bei ausgeschaltetem Durchfluss nach Kanal 4 . Mit Hilfe von Nap1 werden HOs auf DNA geladen und in Echtzeit zu Nukleosomen umwickelt. Die Nukleosomenbeladung wird als fluoreszierende Trajektorien visualisiert, die auf der DNA in Kymographen erscheinen. Gleichzeitig kann die Nukleosomenbildung auf der DNA durch die Krafterhöhung überwacht werden, da mehr HOs geladen werden, wenn die Positionen der OTs konstant gehalten werden.
    HINWEIS: Der Fluoreszenzanregungslaser kann während der Schritte zur Nukleosomenbildung ausgeschaltet werden, um ein Photobleichen von Fluorophoren zu vermeiden. Zusätzlich könnte eine unspezifische Bindung von Histon-Oktameren an DNA, bei der die Oktamere nicht in Nukleosomen eingewickelt sind, unter Verwendung dieses Protokolls auftreten. Diese Bindungsereignisse erzeugen keinen "Riss", wenn die DNA gedehnt wird, wie im Protokoll zum Auspacken von Nukleosomen (Schritt 4) unten beschrieben, und können manchmal durch einen sanften Pufferfluss abgewaschen werden, insbesondere wenn der Puffer freie Konkurrenz-DNA enthält.
12. Wenn die ungefähr gewünschte Anzahl von Nukleosomen gebildet ist, beginnen Sie mit dem Sammeln von Daten.

4. Auspacken von Nukleosomen

1. Führen Sie Schritt 2 und Schritt 3 aus.
2. Nachdem Sie ein DNA-Tether mit Nukleosomen gebildet haben, verschieben Sie die OTs nach Kap. 3.
3. Bereiten Sie sich auf Experimente zum Auspacken von Nukleosomen vor, indem Sie den Abstand zwischen den OPs verringern, bis die Kraft ungefähr Null ist. Null die Kraft.
4. Beginnen Sie, den OT 1 mit einer konstanten Geschwindigkeit von 0,1 μm/s vom OT 2 weg zu bewegen. Auf einem Kymographen bewegt sich die Perle in OT 1 visuell weiter von der Perle in OT 2 entfernt. Auf der FD-Kurve steigt die Kraft mit zunehmender Entfernung. Wenn sich die Nukleosomen aufwickeln, treten "Risse" oder Übergänge in der Kraft (~8-37 pN) auf, die das Auflösen der inneren Umhüllung der einzelnen Nukleosomen 27,28,29 bedeuten.
   HINWEIS: Die Kraft, mit der das Abwickeln erfolgt, hängt von der Zuggeschwindigkeit ab, die für Nichtgleichgewichtsprozesse erwartet wird. Manchmal wickeln sich mehrere Nukleosomen gleichzeitig ab, was zu einer größeren Abstandsänderung des Übergangs auf der FD-Kurve führt. Darüber hinaus ist die Entwirrung der äußeren Hülle des Nukleosoms in dieser experimentellen Umgebung nicht ohne weiteres sichtbar (siehe Abschnitt Diskussion).

5. Visualisierung der Proteinbindung an Chromatin

1. Führen Sie Schritt 2 und Schritt 3 aus.
2. Fügen Sie 10 nM Cy3-markiertes Linker-Histon H1.4 zu 500 μl Bildpuffer in Kap. 5 hinzu.
   HINWEIS: Jedes Protein, das von Interesse ist, kann in einer Konzentration Ihrer Wahl zu Kanal 5 hinzugefügt werden (typischerweise unter 100 nM für die Einzelmolekül-Visualisierung).
3. Nachdem Sie einen DNA-Tether gebildet haben, der Nukleosomen enthält, schalten Sie zusätzlich zum roten Laser den grünen Laser ein und bewegen Sie die OTs auf Kanal 5 , um die Bindung von H1 an das Chromatin in Echtzeit abzubilden.
4. Sammeln Sie weiterhin Kymographen oder Scans, bis ausreichende Statistiken vorliegen (mindestens ~10-20 Kymographen, abhängig von der Häufigkeit der Ereignisse und der experimentellen Schwierigkeit).

Ergebnisse

Unter Verwendung des in Schritt 3 beschriebenen Aufbaus (Abbildung 1A) wurde die Nukleosomenbildung entlang des DNA-Tethers als das Auftreten von rot fluoreszierenden Herden auf einem 2D-Scan (Abbildung 1B, links) oder die Trajektorien im Zeitverlauf auf einem Kymographen (Abbildung 1B, rechts) visualisiert. Richtig verpackte Nukleosomen ergaben Fluoreszenztrajektorien, die über die Zeit innerhalb ...

Diskussion

Das beschriebene Protokoll bietet mehrere Vorteile für die Nukleosomenrekonstitution, einschließlich der Minimierung von Reagenzien und Zeit sowie der Ermöglichung der Chaperon-abhängigen Nukleosomenbildung entlang jeder (potenziell nativen) DNA-Sequenz. Darüber hinaus ermöglicht die In-situ-Methode einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang in Einzelmolekül-Assays der Nukleosomenmechanik und der Protein-Chromatin-Interaktion. Auf der and...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate