In-situ-Nukleosomenassemblierung für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein detailliertes experimentelles Verfahren zur Rekonstitution von nukleosomenhaltigen DNA-Fesseln für die Einzelmolekül-Korrelativkraft- und Fluoreszenzmikroskopie vorgestellt. Des Weiteren werden mehrere nachgelagerte Experimente beschrieben, die durchgeführt werden können, um das Bindungsverhalten von Chromatin-interagierenden Proteinen zu visualisieren und Veränderungen der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen zu analysieren.

Zusammenfassung

Nukleosomen stellen die primäre Einheit des eukaryotischen Chromatins dar und standen im Mittelpunkt zahlreicher informativer Einzelmoleküluntersuchungen hinsichtlich ihrer biophysikalischen Eigenschaften und Wechselwirkungen mit Chromatin-bindenden Proteinen. Die Rekonstitution von Nukleosomen auf DNA für diese Studien beinhaltet in der Regel ein Salzdialyseverfahren, das eine genaue Kontrolle über die Platzierung und Anzahl der Nukleosomen ermöglicht, die entlang eines DNA-Haltegurts gebildet werden. Dieses Protokoll ist jedoch zeitaufwändig und erfordert eine beträchtliche Menge an DNA und Histon-Oktameren als Eingaben. Um eine alternative Strategie anbieten zu können, wird eine in situ Nukleosomen-Rekonstitutionsmethode für die Einzelmolekül-Kraft- und Fluoreszenzmikroskopie beschrieben, die das Histon-Chaperon Nap1 verwendet. Diese Methode ermöglicht es dem Benutzer, Nukleosomen auf jeder DNA-Vorlage zu assemblieren, ohne dass starke Nukleosomenpositionierungssequenzen erforderlich sind, die Nukleosomendichte bei Bedarf anzupassen und weniger Reagenzien zu verwenden. Die In-situ-Nukleosomenbildung erfolgt innerhalb von Sekunden, was einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang zu Einzelmolekülmessungen ermöglicht. Beispiele für zwei nachgeschaltete Assays zur Untersuchung der Nukleosomenmechanik und zur Visualisierung des Verhaltens einzelner Proteine auf dem Chromatin werden weiter beschrieben.

Einleitung

Die primäre Verpackungseinheit des eukaryotischen Chromatins ist das Nukleosom, in dem ~147 Basenpaare (bps) der DNA um ein Oktamer aus Kernhistonenproteinen ^1,2 gewickelt sind. Neben der Genomverpackung dient die Nukleosomenarchitektur als eine weitere reichhaltige Schicht biophysikalischer Regulation, die von Chromatin-bindenden Proteinen genutzt werden kann, wenn sie ihre verschiedenen Funktionen erfüllen ^3,4. Der experimentelle Zugang und die Messung der physikalischen Eigenschaften von Nukleosomen war eine technis....

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der in der Studie verwendeten Ausrüstung sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Herstellung von biotinylierter DNA

1. Bereiten Sie eine 120-μl-Volumenreaktion vor, die 20 μg λ-DNA, 33 μM Biotin-dCTP, 33 μM Biotin-dUTP, 33 μM Biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 Einheiten Klenow-Enzym und 1x NEB-Puffer 2 enthält.
   HINWEIS: Dieses Verfahren verwendet speziell lineare doppelsträngige (ds) methylierungsfreie Bakteriophagen λ genomische DNA (48.502 bps), die einen 12-Nukleotid (nt) 5' einzelsträngigen (ss) DNA-Überhang^....

Diskussion

Das beschriebene Protokoll bietet mehrere Vorteile für die Nukleosomenrekonstitution, einschließlich der Minimierung von Reagenzien und Zeit sowie der Ermöglichung der Chaperon-abhängigen Nukleosomenbildung entlang jeder (potenziell nativen) DNA-Sequenz. Darüber hinaus ermöglicht die In-situ-Methode einen einfacheren experimentellen Arbeitsablauf und einen bequemen Übergang in Einzelmolekül-Assays der Nukleosomenmechanik und der Protein-Chromatin-Interaktion. Auf der and.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate