Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Özet

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Özet

Nükleozomlar, ökaryotik kromatinin birincil birimini oluşturur ve biyofiziksel özellikleri ve kromatin bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri hakkında çok sayıda bilgilendirici tek moleküllü araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu çalışmalar için DNA üzerinde nükleozom sulandırması tipik olarak, bir DNA bağı boyunca oluşan nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlayan bir tuz diyaliz prosedürünü içerir. Bununla birlikte, bu protokol zaman alıcıdır ve girdi olarak önemli miktarda DNA ve histon oktameri gerektirir. Alternatif bir strateji sunmak için, histon şaperon Nap1'i kullanan tek moleküllü kuvvet ve floresan mikroskobu için yerinde bir nükleozom sulandırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcıların güçlü nükleozom konumlandırma dizilerine ihtiyaç duymadan herhangi bir DNA şablonunda nükleozomları birleştirmesine, talep üzerine nükleozom yoğunluğunu ayarlamasına ve daha az reaktif kullanmasına olanak tanır. Yerinde nükleozom oluşumu saniyeler içinde gerçekleşir ve daha basit bir deneysel iş akışı ve tek moleküllü ölçümlere uygun bir geçiş sunar. Nükleozom mekaniğini araştırmak ve tek tek proteinlerin kromatin üzerindeki davranışını görselleştirmek için iki aşağı akış testinin örnekleri daha fazla açıklanmaktadır.

Giriş

Ökaryotik kromatinin birincil paketleme birimi, ~147 baz çiftinin (bps) DNA'nın bir oktameri çekirdek histon proteinleri ^1,2 etrafına sarıldığı nükleozomdur. Genom paketlemeye ek olarak, nükleozom mimarisi, çeşitli işlevlerini yerine getirirken kromatin bağlayıcı proteinler tarafından kullanılabilecek başka bir zengin biyofiziksel düzenleme katmanı olarak hizmet eder ^3,4. Nükleozomların fiziksel özelliklerine deneysel olarak erişmek ve bunları ölçmek teknik olarak zor olmuştur, çünkü bu birimler küçük ölçeklerde (örneğ....

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Biyotinile DNA'nın hazırlanması

1. 20 μg λ DNA, 33 μM biotin-dCTP, 33 μM biotin-dUTP, 33 μM biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 ünite Klenow enzimi ve 1x NEB Tampon 2 içeren 120 μL'lik bir hacim reaksiyonu hazırlayın.
   NOT: Bu prosedür özellikle 12-nükleotid (nt) 5' tek sarmallı (ss) DNA çıkıntısı²³ içeren doğrusal çift sarmallı (ds) metilasyon içermeyen bakteriyofaj λ genomik DNA'yı (48,502 bps) kullanır. Bununla birlikte, protokol, en az birkaç nts ss....

Tartışmalar

Açıklanan protokol, nükleozomun yeniden yapılandırılması için, reaktifleri ve zamanı en aza indirmenin yanı sıra herhangi bir (potansiyel olarak doğal) DNA dizisi boyunca şaperona bağımlı nükleozom oluşumunu mümkün kılmak da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar. Ayrıca, yerinde yöntem, daha basit deneysel iş akışına ve nükleozom mekaniği ve protein-kromatin etkileşiminin tek moleküllü tahlillerine uygun bir geçişe izin verir. Öte yan.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate