Tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için yerinde nükleozom düzeneği

Özet

Bu makale, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu için nükleozom içeren DNA bağlarının yeniden yapılandırılması için ayrıntılı bir deneysel prosedür sunmaktadır. Ayrıca, kromatin ile etkileşime giren proteinlerin bağlanma davranışını görselleştirmek ve nükleozomların fiziksel özelliklerindeki değişiklikleri analiz etmek için yapılabilecek birkaç aşağı akış deneyini açıklar.

Özet

Nükleozomlar, ökaryotik kromatinin birincil birimini oluşturur ve biyofiziksel özellikleri ve kromatin bağlayıcı proteinlerle etkileşimleri hakkında çok sayıda bilgilendirici tek moleküllü araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu çalışmalar için DNA üzerinde nükleozom sulandırması tipik olarak, bir DNA bağı boyunca oluşan nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlayan bir tuz diyaliz prosedürünü içerir. Bununla birlikte, bu protokol zaman alıcıdır ve girdi olarak önemli miktarda DNA ve histon oktameri gerektirir. Alternatif bir strateji sunmak için, histon şaperon Nap1'i kullanan tek moleküllü kuvvet ve floresan mikroskobu için yerinde bir nükleozom sulandırma yöntemi açıklanmaktadır. Bu yöntem, kullanıcıların güçlü nükleozom konumlandırma dizilerine ihtiyaç duymadan herhangi bir DNA şablonunda nükleozomları birleştirmesine, talep üzerine nükleozom yoğunluğunu ayarlamasına ve daha az reaktif kullanmasına olanak tanır. Yerinde nükleozom oluşumu saniyeler içinde gerçekleşir ve daha basit bir deneysel iş akışı ve tek moleküllü ölçümlere uygun bir geçiş sunar. Nükleozom mekaniğini araştırmak ve tek tek proteinlerin kromatin üzerindeki davranışını görselleştirmek için iki aşağı akış testinin örnekleri daha fazla açıklanmaktadır.

Giriş

Ökaryotik kromatinin birincil paketleme birimi, ~147 baz çiftinin (bps) DNA'nın bir oktameri çekirdek histon proteinleri ^1,2 etrafına sarıldığı nükleozomdur. Genom paketlemeye ek olarak, nükleozom mimarisi, çeşitli işlevlerini yerine getirirken kromatin bağlayıcı proteinler tarafından kullanılabilecek başka bir zengin biyofiziksel düzenleme katmanı olarak hizmet eder ^3,4. Nükleozomların fiziksel özelliklerine deneysel olarak erişmek ve bunları ölçmek teknik olarak zor olmuştur, çünkü bu birimler küçük ölçeklerde (örneğin, nanometre uzunlukları, piconewton kuvvetleri) performans gösterir ve bu nedenle, sondalamaları, işlevi anlamlı bir şekilde bilgilendirmek için yeterli hassasiyet ve hassasiyet gerektirir. Ayrıca, kromatin bağlayıcı proteinler genellikle substratları ile geçici olarak etkileşime girer ve çoğu topluluk yaklaşımı, bu etkileşimlerin kinetiğini bilgilendirmek için uygun zamansal çözünürlükten yoksundur⁵. Neyse ki, tek moleküllü tekniklerin ortaya çıkışı, tek tek proteinleri ve etkileşimlerini gerçek zamanlı olarak görselleştirmeyi ve manipüle etmeyi mümkün kıldı ve nano ölçekte meydana gelen bu moleküler olaylar hakkında mekanik bilgileri ortaya çıkardı⁶. Özellikle, tek moleküllü korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu (smCFFM), kromatin ve kromatin-protein komplekslerinin^mekaniğini, bileşimini ve koordinasyonunu aynı anda çözmek için hem yüksek çözünürlüklü floresan algılama hem de kuvvet manipülasyon araçlarını kullanır ^7,8.

Kuvvet manipülasyon yöntemi olarak özellikle "optik cımbız" kullanan smCFFM'de,^{üç boyutlu 9} bir dielektrik nesneyi, tipik olarak mikron boyutunda bir plastik boncuk yakalamak için sıkıca odaklanmış bir lazer kullanılır. Bir DNA parçası gibi bir biyopolimer, boncuğa konjuge edilebilir (örneğin, streptavidin-biotin, digoksijenenin-anti-digoksigenin antikor bağlantısı yoluyla) ve kullanıcı hem kalibre edilmiş bir kuvvet uygulayabilir hem de sistem tarafından üretilen kuvveti/yer değiştirmeyi ölçebilir¹⁰. Eklenen floresan modülü, protein bileşimini ve davranışını izlemek için eş zamanlı çok renkli floresan görüntülemeyi mümkün kılar.

smCFFM için nükleozom şablonlarının yeniden oluşturulması için ana yöntem, tuz diyalizi 11,12,13 ile özel DNA şablonları üzerinde nükleozomların birleştirilmesini içerir. Bu prosedürde, saflaştırılmış histon oktamerleri, yüksek tuzlu bir tamponda (~ 1 M sodyum klorür) DNA şablonları ile inkübe edilir ve tuz yavaşça diyalize edilirken, nükleozomlar, diziye bağlı konumsal bir şekilde DNA üzerinde kendiliğinden toplanır^14,15. Bu nedenle, güçlü nükleozom konumlandırma dizilerinin (örneğin, Widom 601¹⁶, X. laevis 5S rDNA¹⁷) özel nükleozom dizileri oluşturmak için DNA şablonlarına dahil edilmesi gelenekseldir. Bu iyi bilinen yöntem, DNA boyunca nükleozomların yerleşimi ve sayısı üzerinde hassas kontrol sağlasa da, birkaç dezavantajdan muzdariptir: (1) güçlü nükleozom konumlandırma DNA dizilerinin dahil edilmesi, kromatin bağlayıcı proteinlerin aktivitesini önyargılı hale getiren yapay olarak kararlı nükleozomlar üretebilir, (2) nükleozom oluşumu için tuz diyalizi işlemi yüksek miktarda DNA ve oktamer gerektirir, ve (3) prosedür, bir ila birkaç günlük çalışmanın yanı sıra, optimum nükleozom dizi yoğunluğu için doğru DNA/oktamer oranını titre etmek için önemli bir çaba gerektirir.

Bu el yazmasında, in vivo nükleozom oluşumunun fizyolojik yoluna benzeyen rekombinant histon şaperon Nap1 kullanarak tek moleküllü bir korelasyon kuvveti ve floresan mikroskobu içinde yerinde DNA boyunca nükleozomlar oluşturmak için alternatif bir yöntem açıklanmaktadır 18,19,20,21,22. Bu yöntem, kullanıcıların nükleozomları spesifik olmayan DNA dizileri üzerinde birleştirmesine, nükleozom yoğunluğunu kolayca ayarlamasına ve önemli ölçüde daha az miktarda reaktif kullanmasına olanak tanır, hepsi de dakikalar içinde. Ek olarak, yerinde nükleozomal DNA bağlarının oluşturulması, daha basit deneysel iş akışı ve yerleşik tek moleküllü görselleştirme ve manipülasyonun rahatlığını sağlar. Bu nedenle, tek tip ve spesifik nükleozom konumlandırması bir gereklilik olmadığında, bu protokol, nükleozom mekaniğinin veya kromatin üzerindeki protein davranışının araştırılması için yararlı bir seçenek sunar, bunun için örnek tahlilleri de tanımladık.

Protokol

Çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Biyotinile DNA'nın hazırlanması

1. 20 μg λ DNA, 33 μM biotin-dCTP, 33 μM biotin-dUTP, 33 μM biotin-dATP, 33 μM dGTP, 10 ünite Klenow enzimi ve 1x NEB Tampon 2 içeren 120 μL'lik bir hacim reaksiyonu hazırlayın.
   NOT: Bu prosedür özellikle 12-nükleotid (nt) 5' tek sarmallı (ss) DNA çıkıntısı²³ içeren doğrusal çift sarmallı (ds) metilasyon içermeyen bakteriyofaj λ genomik DNA'yı (48,502 bps) kullanır. Bununla birlikte, protokol, en az birkaç nts ss 5' çıkıntısı içermesi koşuluyla, optik tuzaklar arasında aşağı akış bağlantısı için her iki uca monte edilen biyotinillenmiş ntlerin sayısını belirleyen uzunluk ve nt dizisi içermesi koşuluyla, herhangi bir uzunluk veya doğrusal dsDNA dizisini kullanacak şekilde uyarlanabilir. Ek olarak, reaksiyon küçültülebilir. Örneğin, 30 μL'lik bir hacim reaksiyonunda 5 μg DNA kullanılabilir. Ek olarak, bu şekilde üretilen DNA substratları burulma ile sınırlı değildir. Burulma ile kısıtlanmış DNA oluşturma protokolleri için lütfen daha önce yayınlanan^{raporlara bakın 24,25}.
2. Reaksiyonu oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
3. 10 mM EDTA ekleyin ve 75 °C'de 20 dakika inkübe edin.
4. Biyotinile DNA ürününü elde etmek için etanol çökeltme işlemi yapın.
   1. 0,1 kat 3 M sodyum asetat ve 3 kat buz gibi soğuk %100 etanol ekleyin. -20 °C'de en az 1 saatten gece boyunca tutun. 4 °C'de 30 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüjleyin.
   2. Peleti rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın ve 1 mL %75 etanol ekleyin. 4 ° C'de 1 dakika boyunca 13.500 x g'da santrifüjleyin.
   3. Süpernatan çıkarma, etanol ekleme ve santrifüjleme adımlarını tekrarlayın.
   4. Tüm süpernatanı dikkatlice çıkarın ve pelet havasının 10 dakika kurumasını bekleyin. Peleti 100-200 μL TE tamponu veya ddH_2O'daçözün (çözünmeyi kolaylaştırmak için 37 ° C'de inkübe edilebilir). Bir Nanodrop spektrofotometresi kullanarak konsantrasyonu ölçün.

2. Bir akış hücresinde kanalların hazırlanması

NOT: Bu prosedür, ticari olarak temin edilebilen bir mikroakışkan çipe dayanmaktadır (Malzeme Tablosuna bakınız), ancak çok kanallı bir akış hücresine sahip herhangi bir smCFFM cihazına uyarlanabilir.

1. Kanalları pasifleştirin (ch.), 4 ve 5 (veya protein içerecek herhangi bir kanal ) ( Şekil 1A'daki kanalların şemasına bakınız). Her kanala 500 μL %0,1 BSA ekleyin ve 8 dakika boyunca 0,8 bar'da (0,010 inç iç çapa sahip borular için ~ 0,45 μL/sn) akıtın. Çözeltiyi çıkarın.
2. Her kanala 500 μL %0,05 Pluronic-F127 ekleyin ve 0,8 bar'da 8 dakika boyunca akıtın. Solüsyonu çıkarın ve şırıngaları 1x PBS ile durulayın. Her kanala 2 mL 1x PBS ekleyin ve 27 dakika boyunca 0,8 bar'da akıtın.
3. Streptavidin kaplı boncukların stok çözeltisini girdaplayın (bu prosedür 3.13 μm boyutunda boncuklar kullanır) ve 1 mL 1x PBS'ye 2.15 μL boncuk çözeltisi ekleyin. Bölüm 1'e ekleyin.
   NOT: Streptavidin kaplı boncukların boyutu ve konsantrasyonu kullanıcı tercihine göre ayarlanabilir.
4. 1 mL 1x PBS'ye 30-80 ng biyotinile λ λ DNA ekleyin. Bölüm 2'ye ekleyin.
   NOT: Biyotinile DNA konsantrasyonu kullanıcı tercihine göre ayarlanabilir. Daha fazla miktarda DNA, DNA bağları oluşturma sıklığını artıracak, ancak aynı anda birden fazla DNA molekülünü bağlama sıklığını da artıracaktır, bu da deneyin zorluğunu artırabilir.

3. Nap1 aracılı in situ nükleozom oluşumu

1. Bölüm 3'e 500 μL proteinsiz görüntü tamponu ekleyin.
   NOT: Bölüm 3'teki tampon bileşimi esnektir ve hem nükleozomlar hem de ilgilenilen spesifik protein(ler) için uygun olmalıdır. İsteğe bağlı olarak, kullanıcılar, nükleozomlara düzgün şekilde sarılmamış histon oktamerlerini çıkarmak için floroforların ve/veya rakip DNA'nın azaltılmış fotoağartması için oksijen temizleme sistemleri eklemeyi seçebilirler.
2. 500 μL 1x HR tamponuna 2 nM S. cerevisiae Nap1 ve 2-5 nM LD655 etiketli H4 histon oktamer (HO) ekleyin¹⁸. Bölüm 4'e ekleyin.
   NOT: Histon oktamerleri ve Nap1 ticari olarak satın alınabilir veya şirket içinde hazırlanabilir (Malzeme Tablosuna bakınız). Her bağlı DNA boyunca oluşturulacak nükleozom sayısı, oktamer konsantrasyonuna ve bu kanalda geçirilen süreye bağlıdır. Kullanıcının her bir DNA molekülü boyunca arzu ettiği ve yaklaşık nükleozom yoğunluğu, bu parametrelerden biri veya her ikisi ayarlanarak modüle edilebilir. Ek olarak, kullanıcı histon oktamerlerini tercih ettikleri floroforla etiketlemeyi seçebilir.
3. İsteğe bağlı: Kromatin bağlayıcı proteini veya ilgilenilen başka bir proteini uygun bir tamponda bölüm 5'e ekleyin.
4. Akış hücresi kanallarını numunelerle yıkamak için tüm kanalları 1,0 bar'da (mevcut deney düzeneğinde ~0,55 μL/s) 30 saniye boyunca akıtın.
5. Akışı 0,2 bar'a ayarlayın (mevcut deney düzeneğinde ~0,16 μL/s). Optik tuzakları (OT'ler) bölüm 1'e getirin ve uygun bir çift streptavidin kaplı boncuk yakalayın.
6. OT'leri kanal 3'e getirin, boncuk çifti için bir kuvvet kalibrasyonu yapın, kırmızı konfokal lazeri (veya tercih edilen başka bir lazer çizgisini) açın ve görüntüleme alanını kalibre edin.
7. Akışı 0,2 bar'a ayarlayın ve OT'leri kanal 2'ye taşıyın. Biyotinile DNA'yı yakalayın.
8. OT'leri bölüm 3'e taşıyın ve akışı durdurun. DNA'yı germek için OT'ler arasındaki mesafeyi artırın ve tek bir DNA bağının varlığını doğrulamak için (çoklu bağların aksine) ilişkili kuvvet-mesafe (FD) eğrisini izleyin. Eğri, verilen kontur uzunluğu^26'da dsDNA için solucan benzeri zincir modelini takip etmelidir.
9. OT'ler arasındaki mesafeyi, DNA gerilimi yaklaşık 1 pN olacak şekilde ayarlayın.
   NOT: 1 pN gerilim, nükleozomların DNA²⁷ tarafından sarılı kalmasına izin verecek kadar düşüktür, ancak tüm DNA molekülünü çizgi taramalı görüntüleme ekseni içine yerleştirecek kadar yüksektir.
10. Kırmızı lazer açıkken bir kymograph almaya başlamak için satır taramasını açın.
    NOT: Kullanıcı tercihine bağlı olarak kimografiler veya bağlı DNA'nın 2D taramaları elde edilebilir.
11. OT'leri akış kapalıyken bölüm 4'e taşıyın. Nap1 tarafından kolaylaştırılan HO'lar DNA'ya yüklenir ve gerçek zamanlı olarak nükleozomlar oluşturmak üzere sarılır. Nükleozom yüklemesi, kimografilerde DNA üzerinde görünen floresan yörüngeler olarak görselleştirilir. Aynı zamanda, DNA üzerindeki nükleozom oluşumu, OT'lerin konumları sabit tutulduğunda daha fazla HO yüklendiği için kuvvet artışı ile izlenebilir.
    NOT: Floresan uyarma lazeri, floroforların fotoağartılmasını önlemek için nükleozom oluşum adımları sırasında kapatılabilir. Ek olarak, histon oktamerlerinin DNA'ya spesifik olmayan bağlanması, oktamerlerin nükleozomlara sarılmadığı durumlarda bu protokol kullanılarak gerçekleşebilir. Bu bağlanma olayları, aşağıdaki Nükleozomları Açma (adım 4) protokolünde açıklandığı gibi, DNA gerildiğinde bir "yırtılma" oluşturmaz ve bazen, özellikle tampon serbest rakip DNA içeriyorsa, hafif bir tampon akışıyla yıkanabilir.
12. Yaklaşık istenen sayıda nükleozom oluştuğunda, veri toplamaya başlayın.

4. Nükleozomların açılması

1. 2. ve 3. adımları tamamlayın.
2. Nükleozom içeren bir DNA bağı oluşturduktan sonra, OT'leri bölüm 3'e taşıyın.
3. Kuvvet yaklaşık sıfır olana kadar OT'ler arasındaki mesafeyi azaltarak nükleozom açma deneylerine hazırlanın. Kuvveti sıfırlayın.
4. OT 1'i 0,1 μm/s'lik sabit bir hızla OT 2'den uzaklaştırmaya başlayın. Bir kymografta, OT 1'deki boncuk görsel olarak OT 2'deki boncuktan daha uzağa hareket edecektir. FD eğrisinde, mesafe arttıkça kuvvet artacaktır. Nükleozomlar açılırken, tek tek nükleozomların 27,28,29 iç sargısının çözülmesini gösteren kuvvette (~ 8-37 pN) "yırtılmalar" veya geçişler görünecektir.
   NOT: Sarmanın meydana geldiği kuvvet, denge dışı işlemler için beklenen çekme hızına bağlıdır. Bazen, birden fazla nükleozom aynı anda açılır ve FD eğrisi üzerindeki geçişte daha büyük bir mesafe değişikliği üretir. Ek olarak, nükleozomun dış sargısının çözülmesi bu deneysel ortamda kolayca görülemez (Tartışma bölümüne bakın).

5. Proteinin kromatine bağlanmasını görselleştirmek

1. 2. ve 3. adımları tamamlayın.
2. Bölüm 5'te 10 nM Cy3 etiketli histon H1.4'ü 500 μL görüntü arabelleğine ekleyin.
   NOT: İlgilenilen herhangi bir protein, tercih edilen bir konsantrasyonda (tipik olarak tek moleküllü görselleştirme için 100 nM'nin altında) kanal 5'e eklenebilir.
3. Nükleozom içeren bir DNA bağı oluşturduktan sonra, kırmızı lazere ek olarak yeşil lazeri açın ve H1'in kromatine bağlanmasının gerçek zamanlı görüntülenmesi için OT'leri bölüm 5'e taşıyın.
4. Yeterli istatistik elde edilene kadar kimografi veya tarama toplamaya devam edin (olayların sıklığına ve deneysel zorluğa bağlı olarak en az ~ 10-20 kimografi).

Sonuçlar

Adım 3'te (Şekil 1A) açıklanan kurulum kullanılarak, DNA bağı boyunca nükleozom oluşumu, bir 2D taramada kırmızı floresan odakların görünümü (Şekil 1B, solda) veya bir kimografide zaman içinde yörüngeler (Şekil 1B, sağ) olarak görselleştirildi. Düzgün bir şekilde sarılmış nükleozomlar, konfokal tespitin kırınım sınırı (~ 300 nm) içinde zaman içinde sabit olan ...

Tartışmalar

Açıklanan protokol, nükleozomun yeniden yapılandırılması için, reaktifleri ve zamanı en aza indirmenin yanı sıra herhangi bir (potansiyel olarak doğal) DNA dizisi boyunca şaperona bağımlı nükleozom oluşumunu mümkün kılmak da dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar. Ayrıca, yerinde yöntem, daha basit deneysel iş akışına ve nükleozom mekaniği ve protein-kromatin etkileşiminin tek moleküllü tahlillerine uygun bir geçişe izin verir. Öte yan...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x HR buffer	N/A	N/A	30 mM tris acetate pH 7.5, 20 mM magnesium acetate, 50 mM potassium chloride, 0.1 mg/mL BSA
1x PBS (Phosphate-buffered saline)	N/A	N/A	137 mM sodium chloride, 2.7 mM potassium chloride, 10 mM sodium phosphate dibasic, 1.8 mM potassium phophate monobasic
Acetic acid, glacial	Millipore Sigma	AX0074-6	Use to make tris acetate
Biotin-11-dUTP	Jena Bioscience	NU-803-BIOX-S
Biotin-14-dATP	Jena Bioscience	NU-835-BIO14-S
Biotin-14-dCTP	Jena Bioscience	NU-956-BIO14-S
Bovine Serum Albumin	Millipore Sigma	A9418-50G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Cy3 Maleimide Mono-Reactive Dye	Cytiva	PA23031	Maleimide functionalized Cy3 fluorophore
dGTP	New England Biolabs	N0442S
Eppendorf Centrifuge 5425 R	Fisher Scientific	05-414-051	Benchtop centrifuge with cooling
Ethyl alcohol, Pure	Millipore Sigma	459844
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Millipore Sigma	E9884	Dissolve in H2O to 0.5 M
Human histone octamer (H4, L50C; H2A, K119C)	N/A	N/A	Recombinant histone proteins and those harboring labeling mutations were purified in-house as described previously (see refs. 33, 34, 35, 36). Briefly, recombinant histones were expressed in BL21 (De3) pLySS cells (Promega). Inclusion bodies were isolated after sonication, and histones were extracted under denaturing conditions. Histones were dialyzed into buffer A (7 M urea, 10 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride, 1 mM EDTA, and 5 mM 2-mercaptoethanol), and the solution was added to a gravity column loaded with Q Sepharose Fast Flow (Cytiva). The flow through was then added to a gravity column loaded SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), and the histones were eluted from the column by adding buffer A supplemented with 600 mM sodium chloride. Histones harboring labeling mutations (H4, L50C; H2A, K119C) were purified and then conjugated to the desired fluorophore via maleimide-functionalized dyes (Cytiva, Lumidyne) using a 20:1 dye-to-protein molar ratio (see refs. 33, 34). Histone octamers were assembled by adding an equal molar ratio of each wild-type or fluorophore-labeled histone under denaturing conditions, dialyzed into a high-salt buffer containing 2 M sodium chloride, and then purified by size exclusion chromatography as described previously (see refs. 36, 37). Alternatively, individual histone proteins and ready-made histone octamers can be purchased commercially (e.g., Epicypher).
Image buffer	N/A	N/A	20 mM tris hydrochloride pH 8.0, 100 mM sodium chloride
Klenow Fragment (3' to 5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
Lambda DNA (dam-, dcm-)	Thermo Fisher Scientific	SD0021	Methylation-free λ DNA
LD655-MAL	Lumidyne Technologies	9	Maleimide functionalized LD655 fluorophore
Linker histone H1.4 (A4C)	N/A	N/A	Purified recombinant protein made in-house (see ref. 38)
LUMICKS C-Trap Dymo	LUMICKS	N/A	Dual-trap configuration; standard materials for instrument provided by manufacturer
Magnesium acetate solution	Millipore Sigma	63052-100ML	Use to make HR buffer
NEBuffer 2	New England Biolabs	B7002S	Included with Klenow Fragment kit
Pluronic F-127	Millipore Sigma	P2443-250G	Dissolve in H2O and run through 0.22 um filter
Potassium chloride	Millipore Sigma	P3911	Use to make PBS and HR buffer
Potassium phosphate monobasic	Millipore Sigma	P0662	Use to make PBS
S. cerevisiae Nap1	N/A	N/A	Nap1 was purified in-house as previously described (see refs. 33, 34). Alternatively, Nap1 can be purchased commercially (e.g., Active Motif).
Sodium acetate	Millipore Sigma	241245	Dissolve in H2O to 3 M
Sodium chloride	Millipore Sigma	S9888	Use to make PBS and image buffer
Sodium phosphate dibasic	Millipore Sigma	S9763	Use to make PBS
SPHERO Biotin Coated Particles (3.0-3.4 µm)	Spherotech	TP-30-5
Thermo Scientific NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer	Fisher Scientific	ND2000	NanoDrop Spectrophotometer
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	Dissolve in H2O and adjust to appropriate pH; use to make image buffer and tris acetate