Construcción de un modelo de xenoinjerto ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas que imita la progresión de la enfermedad y predice las actividades de los fármacos

Resumen

Este estudio presenta un modelo ortotópico de cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) basado en la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares de células fluorescentes A549-iRFP. El modelo recapitula los estadios clínicos del CPNM y responde al cisplatino, de acuerdo con la monitorización dinámica in vivo de la fluorescencia de longitud de onda larga.

Resumen

El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) es una enfermedad altamente letal con un microambiente tumoral complejo y heterogéneo. En la actualidad, los modelos animales comunes basados en la inoculación subcutánea de suspensiones de células cancerosas no recapitulan el microambiente tumoral en el CPCNP. En este trabajo describimos un modelo de xenoinjerto ortotópico murino de cáncer de pulmón que emplea la inoculación intrapulmonar de esferoides multicelulares tridimensionales (MCS). Específicamente, las células fluorescentes de NSCLC humano (A549-iRFP) se cultivaron en microplacas de 96 pocillos de baja adherencia con colágeno durante 3 semanas para formar MCS, que luego se inocularon intercostalmente en el pulmón izquierdo de ratones desnudos atímicos para establecer el modelo de cáncer de pulmón ortotópico.

En comparación con la línea celular A549 original, la MCS de la línea celular A549-iRFP respondió de manera similar a los medicamentos contra el cáncer. La señal fluorescente de longitud de onda larga de las células A549-iRFP se correlacionó fuertemente con marcadores comunes del crecimiento de células cancerosas, incluido el volumen de esferoides, la viabilidad celular y el nivel de proteínas celulares, lo que permitió el monitoreo dinámico del crecimiento del cáncer in vivo mediante imágenes fluorescentes. Después de la inoculación en ratones, el xenoinjerto A549-iRFP MCS progresó de manera confiable a través de fases muy parecidas a las etapas clínicas del NSCLC, incluida la expansión del tumor primario, la aparición de tumores secundarios vecinos y las metástasis de las células cancerosas en el pulmón derecho contralateral y órganos remotos. Además, el modelo respondió al fármaco de referencia contra el cáncer de pulmón, el cisplatino, con la toxicidad prevista y una progresión más lenta del cáncer. Por lo tanto, este modelo de xenoinjerto ortotópico murino de CPNM serviría como plataforma para recapitular la progresión de la enfermedad y facilitar el desarrollo de posibles fármacos contra el cáncer.

Introducción

Entre todos los trastornos oncológicos, el cáncer de pulmón no solo inflige la mayor pérdida de vidas, sino que también se cobra el segundo mayor número de nuevos pacientes cada año en^{los EE.} UU. Esta devastadora neoplasia maligna se erige como un obstáculo importante en la atención sanitaria moderna, lo que exige una comprensión más profunda de su intrincada biología y modalidades terapéuticas más eficaces². El cáncer de pulmón de células no pequeñas (CPCNP) representa el 85% de los cánceres de pulmón y tiende a convertirse en tumores sólidos³. Uno de los principales desafíos en el cáncer de pulm....

Protocolo

El estudio en animales se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad del Pacífico (Protocolos Animales 19R10 y 22R10). Para el presente estudio se utilizaron ocho ratones machos desnudos atímicos de 5-6 semanas de edad, con un peso de 20-25 g, criados con la dieta de roedores de referencia y alojados en condiciones libres de patógenos (SPF). Las jaulas, la ropa de cama y el agua potable se esterilizaban en autoclave y se cambiaban regularmente. En la Figura 1 se muestra un esquema de la inoculación tumoral en ratones. Consulte la Tabla de Materiales para obten....

Resultados

Caracterización del MCS A549-iRFP
Los MCS A549-iRFP se cultivaron con éxito en microplacas esferoides con la ayuda de colágeno y centrifugación. Cuando la SQM alcanzó un diámetro de aproximadamente 500 μm después de 1 semana, tanto la SQM A549 como la A549-iRFP se expusieron a una variedad de medicamentos y formulaciones contra el cáncer durante 3 días y luego se mantuvieron en un medio de crecimiento sin drogas durante 4 días adicionales. El MCS A549-iRFP exhibió un patrón de respuesta m.......

Discusión

La construcción de A549-iRFP MCS es un procedimiento de laboratorio sencillo y altamente reproducible y se puede traducir a la formación de MCS para múltiples líneas celulares. El SQM generado con la ayuda de la centrifugación y el colágeno exhibe una estructura más integral y similar a la de un tumor sólido en 3-4 días. Este método asegura la formación de esferoides robustos que mantienen su estructura integral durante períodos prolongados, generalmente de 2 a 3 semanas o incluso más hasta que comienzan a s.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01