בניית מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים המחקה את התקדמות המחלה ומנבא פעילויות תרופתיות

Summary

מחקר זה מציג מודל אורתוטופי של סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) המבוסס על חיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים של תאי A549-iRFP פלואורסצנטיים. המודל משחזר שלבים קליניים של NSCLC ומגיב לציספלטין, על פי ניטור דינמי in vivo של פלואורסצנטיות באורך גל ארוך.

Abstract

סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) הוא מחלה קטלנית ביותר עם מיקרו-סביבה סרטנית מורכבת והטרוגנית. כיום, מודלים נפוצים של בעלי חיים המבוססים על חיסון תת-עורי של תרחיפים של תאים סרטניים אינם משחזרים את המיקרו-סביבה של הגידול ב- NSCLC. במאמר זה אנו מתארים מודל סרטן ריאות אורתוטופי של מורין המשתמש בחיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים (MCS). באופן ספציפי, תאי NSCLC אנושיים פלואורסצנטיים (A549-iRFP) גודלו בתרבית במיקרו-צלחות בעלות חיבור נמוך של 96 בארות עם קולגן במשך 3 שבועות כדי ליצור MCS, אשר חוסנו לאחר מכן באופן בין-קוסטלי לתוך הריאה השמאלית של עכברים עירומים אתימיים כדי לבסס את מודל סרטן הריאה האורתוטופי.

בהשוואה לקו התאים המקורי של A549, MCS של קו התאים A549-iRFP הגיב באופן דומה לתרופות נגד סרטן. האות הפלואורסצנטי באורך הגל הארוך של תאי A549-iRFP נמצא בקורלציה חזקה עם סמנים נפוצים של צמיחת תאים סרטניים, כולל נפח ספרואידים, כדאיות התא ורמת החלבון התאי, ובכך מאפשר ניטור דינמי של צמיחת הסרטן in vivo על ידי הדמיה פלואורסצנטית. לאחר החיסון לעכברים, A549-iRFP MCS xenograft התקדם באופן אמין דרך שלבים דומים מאוד לשלבים הקליניים של NSCLC, כולל הרחבת הגידול הראשוני, הופעתם של גידולים משניים שכנים, וגרורות של תאים סרטניים לריאה הימנית הנגדית ולאיברים מרוחקים. יתר על כן, המודל הגיב לתרופה נגד סרטן ריאות, ציספלטין עם הרעילות הצפויה והתקדמות סרטן איטית יותר. לכן, מודל קסנוגרפט אורתוטופי זה של NSCLC ישמש פלטפורמה לשחזור התקדמות המחלה ולהקל על פיתוח תרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות.

Introduction

מבין כל ההפרעות האונקולוגיות, סרטן הריאות לא רק גורם לאובדן החיים הגבוה ביותר, אלא גם טוען למספר השני בגובהו של חולים חדשים מדי שנה בארה"ב¹. ממאירות הרסנית זו עומדת כמכשול מרכזי בשירותי הבריאות המודרניים, ודוחקת להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה המורכבת שלה ולשיטות טיפוליות יעילות יותר². סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה 85% ממקרי סרטן הריאה ונוטה להתפתח לגידולים מוצקים³. אחד האתגרים החשובים ביותר בסרטן הריאה הוא המיקרו-סביבה הדינמית וההטרוגנית של הגידול, המשפיעה עמוקות על התקדמות הסרטן ועל תגובותיו להתערבויות טיפוליות ^4,5,6

Protocol

המחקר בבעלי חיים בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת האוקיינוס השקט (פרוטוקולים לבעלי חיים 19R10 ו-22R10). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשמונה עכברים עירומים אתימיים זכרים בגילאי 5-6 שבועות, במשקל 20-25 גרם, שגודלו עם דיאטת המכרסמים הנזכרת ושוכנו בתנאים נטולי פתוגן (SPF). כלובים, מצעים ומי שתייה הוחלפו והוחלפו באופן קבוע. סכמה של חיסון גידולי בעכברים מוצגת באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.

1. הקמת MCS תלת מימדי של תאי A549-iRFP

1. לדגור על תאי A549-iRFP (אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות....

תוצאות

אפיון MCS A549-iRFP
A549-iRFP MCS תורבתו בהצלחה במיקרו-צלחות ספרואידים בעזרת קולגן וצנטריפוגה. כאשר MCS הגיע לקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבוע אחד, הן A549 והן A549-iRFP MCS נחשפו למגוון תרופות ותכשירים נגד סרטן במשך 3 ימים ולאחר מכן נשמרו במדיום גידול ללא תרופות במשך 4 ימים נוספים. A549-iRFP MCS הציג דפוס תגו.......

Discussion

הבנייה של A549-iRFP MCS היא הליך מעבדה פשוט וניתן לשכפול וניתן לתרגם אותו להיווצרות MCS עבור קווי תאים מרובים. MCS שנוצר בעזרת צנטריפוגה וקולגן מציג מבנה אינטגרלי יותר דמוי גידול מוצק בתוך 3-4 ימים. שיטה זו מבטיחה היווצרות של ספרואידים חזקים השומרים על המבנה האינטגרלי שלהם לתקופות ממושכות, בדרך כלל .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01