Konstruktion eines orthotopen Xenotransplantatmodells für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs, der das Fortschreiten der Krankheit nachahmt und die Wirkstoffaktivität vorhersagt

Zusammenfassung

In dieser Studie wird ein orthotopes Modell für nicht-kleinzelligen Lungenkrebs (NSCLC) vorgestellt, das auf der intrapulmonalen Inokulation von multizellulären Sphäroiden von fluoreszierenden A549-iRFP-Zellen basiert. Das Modell rekapituliert klinische NSCLC-Stadien und spricht auf Cisplatin an, entsprechend der dynamischen In-vivo-Überwachung der langwelligen Fluoreszenz.

Zusammenfassung

Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) ist eine hochgradig tödliche Erkrankung mit einer komplexen und heterogenen Tumormikroumgebung. Derzeit rekapitulieren gängige Tiermodelle, die auf der subkutanen Inokulation von Krebszellsuspensionen basieren, die Tumormikroumgebung bei NSCLC nicht. Darin beschreiben wir ein murines orthotopes Lungenkrebs-Xenotransplantatmodell, das die intrapulmonale Inokulation von dreidimensionalen multizellulären Sphäroiden (MCS) verwendet. Konkret wurden fluoreszierende humane NSCLC-Zellen (A549-iRFP) 3 Wochen lang in 96-Well-Mikrotiterplatten mit geringer Bindung mit Kollagen kultiviert, um MCS zu bilden, die dann interkostal in die linke Lunge von athymischen Nacktmäusen inokuliert wurden, um das orthotope Lungenkrebsmodell zu etablieren.

Im Vergleich zur ursprünglichen A549-Zelllinie reagierte die MCS der A549-iRFP-Zelllinie ähnlich auf Krebsmedikamente. Das langwellige Fluoreszenzsignal der A549-iRFP-Zellen korrelierte stark mit gängigen Markern des Krebszellwachstums, einschließlich des Sphäroidvolumens, der Zellviabilität und des zellulären Proteinspiegels, und ermöglichte so eine dynamische Überwachung des Krebswachstums in vivo durch Fluoreszenzbildgebung. Nach der Inokulation in Mäuse durchlief das A549-iRFP MCS-Xenotransplantat zuverlässig Phasen, die den klinischen Stadien des NSCLC sehr ähnlich waren, einschließlich der Expansion des Primärtumors, des Auftretens benachbarter Sekundärtumoren und der Metastasen von Krebszellen in die kontralaterale rechte Lunge und entfernte Organe. Darüber hinaus reagierte das Modell auf das Benchmark-Medikament gegen Lungenkrebs, Cisplatin, mit der erwarteten Toxizität und einem langsameren Fortschreiten des Krebses. Daher würde dieses murine orthotope Xenotransplantatmodell von NSCLC als Plattform dienen, um das Fortschreiten der Krankheit zu rekapitulieren und die Entwicklung potenzieller Krebsmedikamente zu erleichtern.

Einleitung

Unter allen onkologischen Erkrankungen verursacht Lungenkrebs nicht nur den höchsten Lebensverlust, sondern fordert auch die zweithöchste Anzahl neuer Patienten pro Jahr in den USA¹. Diese verheerende Malignität stellt ein großes Hindernis im modernen Gesundheitswesen dar und erfordert ein tieferes Verständnis ihrer komplizierten Biologie und wirksamere therapeutische Modalitäten². Nicht-kleinzelliger Lungenkrebs (NSCLC) macht 85 % des Lungenkrebses aus und neigt dazu, sich zu soliden Tumoren zu entwickeln³. Eine der größten Herausforderungen bei Lungenkrebs ist die dynamische und heterogene Tumor....

Protokoll

Die Tierstudie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of the Pacific durchgeführt (Tierprotokolle 19R10 und 22R10). Für die vorliegende Studie wurden acht männliche athyme Nacktmäuse im Alter von 5-6 Wochen mit einem Gewicht von 20-25 g verwendet, die mit der referenzierten Nagetierdiät gezüchtet und unter pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten wurden. Käfige, Einstreu und Trinkwasser wurden autoklaviert und regelmäßig gewechselt. Ein Schema der Tumorinokulation bei Mäusen ist in Abbildung 1 dargestellt. In der Materialtabelle finden Sie Einzelheiten zu allen Mat....

Diskussion

Die Konstruktion von A549-iRFP MCS ist ein unkompliziertes und hochgradig reproduzierbares Laborverfahren und kann auf die MCS-Bildung für mehrere Zelllinien übertragen werden. Das mit Hilfe von Zentrifugation und Kollagen erzeugte MCS weist innerhalb von 3-4 Tagen eine integralere und solidere, tumorähnliche Struktur auf. Diese Methode gewährleistet die Bildung robuster Sphäroide, die ihre integrale Struktur über längere Zeiträume beibehalten, typischerweise 2-3 Wochen oder sogar länger, bis kleine Knospen zu s.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 µL Glass Syringe	Hamilton	Part/REF #80601
20 G Needle	Thermo Fisher Scientific Inc.	14 826D
96-well Ultra-Low-Attachment Spheroid Microplate	Corning	15-100-173
A549-iRFP	Imanis Life Sciences	CL082-STAN
AIN-93M Mature Rodent Diet	Research Diets, Inc.	D10012M
Athymic Nude Mouse	Charles River Laboratories, Inc.	Strain Code: 490; homozygous
BCA	Pierce	23227
Buprenorphine Hydrochloride	Patterson Veterinary	NDC Number: 42023-179-05
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay	Promega	G9683
Collagen	Gibco	A1064401
DMEM	Corning	MT10013CV
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cytiva HyClone	SH3039603
ImageJ	Open source tool (https://imagej.net/ij/)	N/A
Image Studio	LI-COR	Version 5.2
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC Number: 17033-0091-25
Ketamine	Patterson Veterinary	NDC Number: 50989-0161-06
Microscope	Keyence	Model number: BZ-X710
Matrigel	Corning	CB-40234
Odyssey Infrared Imaging 205 System	LI-COR	Model number: 9140
PBS	Corning	MT21040CV
Pearl Trilogy small animal imaging system	LI-COR	Model number: 9430
Penicillin-Streptomycin	Corning	MT30002CI
Puromycin	Thermo Fisher Scientific Inc.	AAJ67236XF
ReViSP software from MATLAB	Open source tool on Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)	N/A
Surgical Clips--AutoClip System	Fine Science Tools	12020-00
Xylazine	Patterson Veterinary	NDC Number: 61133-6017-01