Aislamiento de células inmunitarias del cerebro y el cráneo de ratones

Resumen

Para investigar la respuesta inmunitaria a los trastornos cerebrales, un enfoque común es analizar los cambios en las células inmunitarias. Aquí, se proporcionan dos protocolos simples y efectivos para aislar células inmunitarias del tejido cerebral murino y la médula ósea del cráneo.

Resumen

Cada vez hay más pruebas de que la respuesta inmunitaria desencadenada por los trastornos cerebrales (por ejemplo, isquemia cerebral y encefalomielitis autoinmunitaria) no sólo se produce en el cerebro, sino también en el cráneo. Un paso clave para analizar los cambios en las poblaciones de células inmunitarias tanto en el cerebro como en la médula ósea del cráneo después de un daño cerebral (por ejemplo, un accidente cerebrovascular) es obtener un número suficiente de células inmunitarias de alta calidad para los análisis posteriores. Aquí, se proporcionan dos protocolos optimizados para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Las ventajas de ambos protocolos se reflejan en su simplicidad, rapidez y eficacia para producir una gran cantidad de células inmunitarias viables. Estas células pueden ser adecuadas para una serie de aplicaciones posteriores, como la clasificación de células, la citometría de flujo y el análisis transcriptómico. Para demostrar la eficacia de los protocolos, se realizaron experimentos de inmunofenotipado en cerebros de accidente cerebrovascular y médula ósea de cráneo normal mediante análisis de citometría de flujo, y los resultados se alinearon con los hallazgos de los estudios publicados.

Introducción

El cerebro, el eje central del sistema nervioso, está protegido por el cráneo. Debajo del cráneo hay tres capas de tejido conectivo conocido como meninges: la duramadre, la aracnoides y la piamadre. El líquido cefalorraquídeo (LCR) circula en el espacio subaracnoideo entre la aracnoidea y la piamadre, amortiguando el cerebro y también eliminando los desechos a través del sistema glinfático ^1,2. En conjunto, esta arquitectura única proporciona un entorno seguro y de apoyo que mantiene la estabilidad del cerebro y lo protege de posibles lesiones.

Durante mucho tiempo se ha considerado....

Protocolo

El protocolo fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales del Instituto Duke (IACUC). En el presente estudio se utilizaron ratones machos C57Bl/6 (3-4 meses de edad; 22-28 g). Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Suspensión unicelular del cerebro de ratón

NOTA: La Figura 1 ilustra la descripción general del protocolo de aislamiento de células cerebrales.

1. Anestesia, intubar y asegurar el ratón, como se demostró anteriormente¹¹.
2. Haz una incis....

Discusión

Aquí, se presentan dos protocolos simples pero efectivos para aislar las células inmunitarias del cerebro y la médula ósea del cráneo. Estos protocolos pueden producir de forma fiable una gran cantidad de células inmunitarias viables que pueden ser adecuadas para diversas aplicaciones posteriores, en particular para la citometría de flujo.

Para estudiar la neuroinflamación en diversos trastornos cerebrales, se han establecido muchos protocolos para la preparación de células inmunitar.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544