Isolando células imunes do cérebro e crânio de camundongos

Resumo

Para investigar a resposta imune a distúrbios cerebrais, uma abordagem comum é analisar as mudanças nas células imunológicas. Aqui, dois protocolos simples e eficazes são fornecidos para isolar células imunes do tecido cerebral murino e da medula óssea do crânio.

Resumo

Evidências crescentes indicam que a resposta imune desencadeada por distúrbios cerebrais (por exemplo, isquemia cerebral e encefalomielite autoimune) ocorre não apenas no cérebro, mas também no crânio. Um passo fundamental para analisar as mudanças nas populações de células imunes no cérebro e na medula óssea do crânio após danos cerebrais (por exemplo, acidente vascular cerebral) é obter um número suficiente de células imunes de alta qualidade para análises posteriores. Aqui, dois protocolos otimizados são fornecidos para isolar células imunes do cérebro e da medula óssea do crânio. As vantagens de ambos os protocolos se refletem em sua simplicidade, velocidade e eficácia na produção de uma grande quantidade de células imunes viáveis. Essas células podem ser adequadas para uma variedade de aplicações downstream, como classificação de células, citometria de fluxo e análise transcriptômica. Para demonstrar a eficácia dos protocolos, experimentos de imunofenotipagem foram realizados em cérebros de AVC e medula óssea de crânio cerebral normal usando análise de citometria de fluxo, e os resultados se alinharam com os achados de estudos publicados.

Introdução

O cérebro, o centro do sistema nervoso, é protegido pelo crânio. Abaixo do crânio estão três camadas de tecido conjuntivo conhecidas como meninges - dura-máter, aracnóide e pia-máter. O líquido cefalorraquidiano (LCR) circula no espaço subaracnóideo entre a aracnóide e a pia-máter, amortecendo o cérebro e também removendo os resíduos pelo sistema glinfático ^1,2. Juntos, essa arquitetura exclusiva fornece um ambiente seguro e de suporte que mantém a estabilidade do cérebro e o protege de possíveis lesões.

O cérebro há muito é considerado imunoprivilegiado. No entanto, essa noção foi parcialmente abandonada, pois evidências crescentes indicam que, além da micróglia residente no parênquima, as bordas do cérebro, incluindo o plexo coróide e as meninges, hospedam uma gama diversificada de células imunes³. Essas células desempenham papéis críticos na manutenção da homeostase, na vigilância da saúde do cérebro e no início da resposta imune à lesão cerebral. Notavelmente, descobertas recentes indicam que o crânio está envolvido na imunidade das meninges e pode contribuir para a resposta imune no cérebro após a lesão. Em 2018, Herisson et al. fizeram uma descoberta seminal de canais vasculares diretos que ligam a medula óssea do crânio às meninges, estabelecendo assim uma rota anatômica para a migração de leucócitos ^4,5. Posteriormente, Cugurra e col. demonstraram que muitas células mieloides (por exemplo, monócitos e neutrófilos) e células B nas meninges não se originam do sangue⁶. Usando técnicas como transplante de retalho ósseo da calvária e regimes de irradiação seletiva, os autores forneceram evidências convincentes de que a medula óssea do crânio serve como fonte local de células mieloides nas meninges, bem como no parênquima do SNC após lesão do SNC⁶. Além disso, outro estudo propôs que as células B meníngeas são constantemente supridas pela medula óssea do crânio⁷. Mais recentemente, uma nova estrutura, denominada saída do manguito aracnóide (ECA), foi identificada como uma porta de entrada direta entre a dura-máter e o cérebro para o tráfego de células imunes⁸.

Essas descobertas empolgantes têm implicações importantes para a origem da infiltração de células imunes no cérebro lesionado (por exemplo, após acidente vascular cerebral isquêmico). Um grande corpo de evidências indicou que, após o AVC, muitas células imunológicas se infiltram no cérebro, contribuindo tanto para danos cerebrais agudos quanto para a recuperação crônica do cérebro. A noção convencional é que essas células são leucócitos circulantes no sangue que se infiltram no cérebro, o que é amplamente facilitado por danos na barreira hematoencefálica induzidos por derrame. No entanto, essa noção foi contestada. Em um estudo, as células imunes no crânio e na tíbia de camundongos foram rotuladas de forma diferente e, 6 h após o AVC, uma diminuição significativamente maior de neutrófilos e monócitos foi encontrada no crânio vs. a tíbia e mais neutrófilos derivados do crânio estavam presentes no cérebro isquêmico. Esses dados sugerem que, na fase aguda do AVC, os neutrófilos no cérebro isquêmico se originam principalmente da medula óssea do crânio⁴. Curiosamente, o LCR pode orientar essa migração. De fato, dois relatórios recentes demonstraram que o LCR pode transmitir diretamente sinais de sinalização do cérebro para a medula óssea do crânio através dos canais do crânio e instruir a migração celular e a hematopoiese na medula óssea do crânio após lesão do SNC ^9,10.

À luz dessas descobertas recentes, tornou-se importante analisar as mudanças nas células imunes no cérebro e na medula óssea do crânio, ao estudar a resposta imune a distúrbios cerebrais. Em tais investigações, um número suficiente de células imunes de alta qualidade é necessário para análises a jusante, como classificação de células, análise de citometria de fluxo e sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-seq). Aqui, o objetivo geral é apresentar dois procedimentos otimizados para a preparação de suspensões unicelulares a partir do tecido cerebral e da medula óssea do crânio. É importante notar que a calvária (osso frontal, osso occipital e ossos parietais) do crânio é normalmente usada para extrair medula óssea, e essa medula óssea é especificamente referida como medula óssea do crânio ao longo deste estudo.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Duke Institute (IACUC). Camundongos C57Bl/6 machos (3-4 meses de idade; 22-28 g) foram usados no presente estudo. Os detalhes dos reagentes e do equipamento utilizado estão listados na Tabela de Materiais.

1. Suspensão unicelular do cérebro do camundongo

NOTA: A Figura 1 ilustra a visão geral do protocolo de isolamento de células cerebrais.

1. Anestesiar, intubar e prender o mouse, conforme demonstrado anteriormente¹¹.
2. Faça uma incisão abdominal superior através da pele e das camadas musculares subjacentes e corte cuidadosamente o diafragma e as costelas para criar a abertura na cavidade torácica.
3. Encha uma seringa de 30 mL com PBS frio e conecte-a à agulha de perfusão romba por meio de um tubo de silicone. Insira cuidadosamente a agulha de perfusão no ventrículo esquerdo.
4. Faça um pequeno corte no átrio direito para permitir a drenagem do sangue e, em seguida, perfunda¹² o mouse a uma taxa de fluxo de ~ 10 mL / min por 3-4 min.
   NOTA: Para melhorar a depuração do sangue no cérebro, pode-se considerar o aumento do volume da solução de perfusão e a adição de heparina.
5. Decapite o camundongo e faça uma incisão na linha média através da pele no topo da cabeça para expor o crânio.
6. Raspe cuidadosamente qualquer tecido conjuntivo que recobre o crânio usando uma pinça romba.
7. Use uma tesoura de dissecção afiada para cortar cuidadosamente as suturas do crânio ao longo da linha média e em ambos os lados, criando uma aba.
8. Levante suavemente a aba do crânio para expor o cérebro e use uma pinça romba para remover cuidadosamente o cérebro da cavidade craniana.
9. Mergulhe o cérebro em uma placa de Petri contendo PBS gelado e remova todos os tecidos meninges restantes.
   NOTA: Para melhor preservar a viabilidade celular, recomenda-se realizar todas as etapas a seguir no gelo ou a 4 ° C.
10. Coloque o cérebro em um homogeneizador Dounce de vidro pré-resfriado de 15 mL contendo 20 mL (cérebro inteiro) ou 12 mL (meio cérebro) de tampão HBSS antigo.
11. Use o pilão Dounce solto para dissociar suave e lentamente o tecido cerebral com cerca de 100-120 golpes no gelo.
    NOTA: Esta etapa é fundamental para obter uma grande quantidade de células cerebrais saudáveis. Esta etapa leva aproximadamente 10 min. Pare a homogeneização quando nenhum pedaço substancial de tecido cerebral for visível na suspensão. Neste ponto, o pilão pode facilmente se mover para baixo sem qualquer força.
12. Filtrar a suspensão de tecido cerebral resultante através de um filtro de células de 70 μm num tubo de centrifugação de 50 ml.
13. Enxágue o tubo Dounce com 5 mL de HBSS e prossiga com a filtração para maximizar a coleta de células.
14. Centrifugar a suspensão de tecido filtrado a 550 x g durante 6 min a 4 °C.
15. Remova o sobrenadante usando um aspirador a vácuo e ressuspenda o pellet celular em 1 mL de solução de gradiente de densidade isotônica a 30%.
    NOTA: Para fazer 15 mL de solução de gradiente de densidade isotônica a 30%, misture 4,5 mL de meio de gradiente de densidade de estoque a 100%, 1,5 mL de 10× PBS e 9 mL de ddH₂O.
16. Transfira a suspensão celular para um tubo de centrífuga de 15 mL e adicione 9 mL (cérebro inteiro) ou 6 mL (meio cérebro) de solução de gradiente de densidade a 30%.
17. Inverta suavemente o tubo para garantir uma mistura completa.
18. Centrifugar imediatamente o tubo a 845 x g com aceleração e travão regulados para o nível 3, durante 20 min a 4 °C.
19. Remova suavemente o tubo da centrífuga sem agitar e aspire cuidadosamente a camada superior de mielina usando uma ponta de 1 mL conectada ao vácuo.
    NOTA: É extremamente importante não perturbar esta camada. Qualquer mielina remanescente pode afetar negativamente a saúde celular e comprometer as análises a jusante.
20. Aspire o sobrenadante, deixando 1-2 mL para trás, e ressuspenda o pellet celular com um mínimo de 10 mL de HBSS frio.
21. Centrifugue a 550 x g durante 6 min a 4 °C.
22. Lave mais uma vez com um mínimo de 7 mL de HBSS frio.
23. Remova o máximo possível do sobrenadante e ressuspenda as células para análise de citometria de fluxo usando 100-200 μL de tampão de citometria de fluxo.
    NOTA: O tampão FACS de citometria de fluxo usado para este estudo contém 0,5% de BSA e 2 mM de EDTA em 1× PBS. Recomenda-se uma placa de fundo em V de 96 poços para coloração celular para minimizar a perda de células durante as etapas de lavagem.
24. Realizar análise de citometria de fluxo usando um protocolo padrão estabelecido em laboratórios individuais¹³.
    1. Resumidamente, misturar 80 μl de suspensão celular com 20 μl da mistura de anticorpos numa placa de fundo em V de 96 poços e incubar durante 25 min a 4 °C.
    2. Lave com 200 μL de tampão FACS e, em seguida, ressuspenda as células com 100 μL de HBSS mais reagente de coloração de viabilidade celular.
    3. Após uma incubação de 15 minutos a 4 °C, lavar com tampão FACS e ressuspender as células em 200 μL de tampão FACS para análise por citometria de fluxo.

2. Preparação da suspensão unicelular da medula óssea a partir da calvária de camundongo

NOTA: A Figura 2 mostra a visão geral do procedimento de isolamento da medula óssea do crânio.

1. Perfunda o mouse conforme descrito na etapa 1.4.
2. Decapite o camundongo e faça uma incisão na linha média da pele no couro cabeludo para expor o crânio.
3. Corte o crânio, começando pelo forame magno e avançando ao longo dos lados laterais da calvária usando uma tesoura afiada. Em seguida, levante e remova a calvária.
   NOTA: O cérebro pode ser colhido do mesmo camundongo e processado usando a etapa 1, permitindo a análise de células imunes do cérebro e da medula óssea do crânio.
4. Retire cuidadosamente a dura-máter do crânio sob um microscópio de dissecação usando uma pinça romba.
   NOTA: É mais fácil começar nas bordas do osso occipital, desprender-se lentamente e progredir de forma constante em direção à área frontal, trabalhando para dentro.
5. Coloque a calvária no prato sobre gelo e use uma pipeta de 1 mL para enxaguar a calvária, garantindo a remoção de resíduos de sangue de sua superfície.
6. Transfira a calvária para um novo prato com PBS fresco e frio, suficiente para mergulhar a calvária.
7. Use uma tesoura estéril para cortar a calvária em fragmentos de aproximadamente 3 mm x 3 mm em PBS frio.
   NOTA: Os métodos de corte podem afetar a eficiência da extração da medula óssea da calvária. Recomenda-se que o mesmo método de corte seja usado para minimizar a variabilidade. Também é importante abrir as suturas. A Figura 2B ilustra uma abordagem.
8. Faça um furo no fundo de um tubo de microcentrífuga de 500 μL usando uma agulha de 18 G.
9. Insira este tubo em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL contendo 20 μL de PBS frio.
10. Transferir os fragmentos da calvária para o tubo de 500 μL.
    NOTA: Os fragmentos ósseos devem ser compactados frouxamente para aumentar a eficiência da extração.
11. Centrifugar a 10.000 x g durante 30 s a 4 °C.
    NOTA: Para maximizar a recuperação celular, use uma agulha de 18 G para mexer suavemente os fragmentos da calvária e repita esta etapa mais 1-2 vezes.
12. Ressuspenda as células da medula óssea da calvária coletadas em 500 μL de tampão de lise de glóbulos vermelhos e incube em temperatura ambiente por 30 s.
13. Transfira a suspensão para um tubo de centrífuga de 15 mL contendo 4 mL de PBS frio.
14. Centrifugue a 400 x g por 6 min a 4 °C.
15. Lave mais uma vez com 5 mL de PBS frio.
16. Ressuspenda o pellet celular em um tampão apropriado. Para citometria de fluxo, normalmente usamos 500 μL de tampão FACS.
17. Para análise de citometria de fluxo, realize a contagem de células e use aproximadamente 1 x 10⁶ células para coloração de anticorpos.
    NOTA: Certifique-se de incluir a etapa do bloqueio Fc antes da coloração do anticorpo¹³.

Resultados

Para preparar células imunes a partir do tecido cerebral do camundongo, o protocolo geralmente produz células com alta viabilidade (84,1% ± 2,3% [média ± DP]). Aproximadamente 70% -80% dessas células são CD45 positivas. No cérebro normal de camundongos, quase todas as células CD45⁺ são microglia (CD45 CD11b^{+ baixo}), como esperado. Este protocolo tem sido usado em laboratório para várias aplicações, incluindo análise de citometria de fluxo, classificação de células ativad...

Discussão

Aqui, dois protocolos simples, mas eficazes, são apresentados para isolar células imunes do cérebro e da medula óssea do crânio. Esses protocolos podem produzir de forma confiável uma grande quantidade de células imunes viáveis que podem ser adequadas para diversas aplicações a jusante, em particular para citometria de fluxo.

Para estudar a neuroinflamação em vários distúrbios cerebrais, muitos protocolos para preparações de células imunes do cérebro foram estabelecidos e usa...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544