Isolement des cellules immunitaires du cerveau et du crâne de souris

Résumé

Pour étudier la réponse immunitaire aux troubles cérébraux, une approche courante consiste à analyser les changements dans les cellules immunitaires. Ici, deux protocoles simples et efficaces sont fournis pour isoler les cellules immunitaires du tissu cérébral murin et de la moelle osseuse du crâne.

Résumé

De plus en plus de preuves indiquent que la réponse immunitaire déclenchée par les troubles cérébraux (par exemple, l’ischémie cérébrale et l’encéphalomyélite auto-immune) se produit non seulement dans le cerveau, mais aussi dans le crâne. Une étape clé vers l’analyse des changements dans les populations de cellules immunitaires dans le cerveau et la moelle osseuse du crâne après des lésions cérébrales (p. ex., un accident vasculaire cérébral) consiste à obtenir un nombre suffisant de cellules immunitaires de haute qualité pour les analyses en aval. Ici, deux protocoles optimisés sont fournis pour isoler les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne. Les avantages des deux protocoles se reflètent dans leur simplicité, leur rapidité et leur efficacité à produire une grande quantité de cellules immunitaires viables. Ces cellules peuvent convenir à une gamme d’applications en aval, telles que le tri cellulaire, la cytométrie en flux et l’analyse transcriptomique. Pour démontrer l’efficacité des protocoles, des expériences d’immunophénotypage ont été réalisées sur des cerveaux d’AVC et de la moelle osseuse normale du crâne du cerveau à l’aide d’une analyse par cytométrie en flux, et les résultats ont été alignés avec les résultats des études publiées.

Introduction

Le cerveau, plaque tournante centrale du système nerveux, est protégé par le crâne. Sous le crâne se trouvent trois couches de tissu conjonctif appelées méninges : la dure-mère, l’arachnoïde et la pie-mère. Le liquide céphalo-rachidien (LCR) circule dans l’espace sous-arachnoïdien entre l’arachnoïde et la pie-mère, amortissant le cerveau et éliminant également les déchets via le système glymphatique ^1,2. Ensemble, cette architecture unique fournit un environnement sûr et favorable qui maintient la stabilité du cerveau et le protège contre les blessures potentielles.

Le cerveau a longtemps été considéré comme immuno-privilégié. Cependant, cette notion a été partiellement abandonnée car de plus en plus de preuves de plus en plus de la microglie résidente dans le parenchyme, les frontières du cerveau, y compris le plexus choroïde et les méninges, hébergent un large éventail de cellules immunitaires³. Ces cellules jouent un rôle essentiel dans le maintien de l’homéostasie, la surveillance de la santé du cerveau et l’initiation de la réponse immunitaire aux lésions cérébrales. Notamment, des découvertes récentes indiquent que le crâne est impliqué dans l’immunité des méninges et peut contribuer à la réponse immunitaire dans le cerveau après une blessure. En 2018, Herisson et al. ont fait une découverte fondamentale des canaux vasculaires directs qui relient la moelle osseuse du crâne aux méninges, établissant ainsi une voie anatomique pour la migration des leucocytes ^4,5. Plus tard, Cugurra et al. ont démontré que de nombreuses cellules myéloïdes (par exemple, les monocytes et les neutrophiles) et les lymphocytes B dans les méninges ne proviennent pas du sang⁶. À l’aide de techniques telles que la transplantation par lambeau osseux calvaria et les régimes d’irradiation sélective, les auteurs ont fourni des preuves convaincantes que la moelle osseuse du crâne sert de source locale de cellules myéloïdes dans les méninges ainsi que le parenchyme du SNC après une lésion du SNC⁶. De plus, une autre étude a suggéré que les lymphocytes B méningés sont constamment alimentés par la moelle osseuse du crâne⁷. Plus récemment, une nouvelle structure, appelée sortie de la coiffe arachnoïdienne (ACE), a été identifiée comme une passerelle directe entre la dure-mère et le cerveau pour le trafic des cellules immunitaires⁸.

Ces découvertes passionnantes ont des implications importantes sur l’origine de l’infiltration des cellules immunitaires dans le cerveau blessé (par exemple, après un accident vasculaire cérébral ischémique). De nombreuses preuves ont indiqué qu’après un AVC, de nombreuses cellules immunitaires s’infiltrent dans le cerveau, contribuant à la fois à des lésions cérébrales aiguës et à une récupération cérébrale chronique. L’idée conventionnelle est que ces cellules sont des leucocytes circulants dans le sang qui s’infiltrent dans le cerveau, ce qui est largement facilité par les dommages à la barrière hémato-encéphalique induits par les accidents vasculaires cérébraux. Cependant, cette notion a été remise en question. Dans une étude, les cellules immunitaires du crâne et du tibia des souris ont été étiquetées différemment, et 6 heures après l’AVC, une diminution significativement plus importante des neutrophiles et des monocytes a été observée dans le crâne par rapport à l’AVC. Le tibia et d’autres neutrophiles dérivés du crâne étaient présents dans le cerveau ischémique. Ces données suggèrent que dans la phase aiguë de l’AVC, les neutrophiles dans le cerveau ischémique proviennent principalement de la moelle osseuse du crâne⁴. Il est intéressant de noter que le LCR peut guider cette migration. En effet, deux rapports récents ont démontré que le LCR peut relayer directement les signaux de signalisation du cerveau dans la moelle osseuse du crâne via les canaux crâniens, et instruire la migration cellulaire et l’hématopoïèse dans la moelle osseuse du crâne après une lésion du SNC ^9,10.

À la lumière de ces découvertes récentes, il est devenu important d’analyser les changements dans les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne, lors de l’étude de la réponse immunitaire aux troubles cérébraux. Dans de telles études, un nombre suffisant de cellules immunitaires de haute qualité est nécessaire pour les analyses en aval telles que le tri cellulaire, l’analyse par cytométrie en flux et le séquençage de l’ARN sur cellule unique (scRNA-seq). Ici, l’objectif global est de présenter deux procédures optimisées pour la préparation de suspensions unicellulaires à partir de tissu cérébral et de moelle osseuse du crâne. Il est important de noter que la calvaria (os frontal, os occipital et os pariétaux) du crâne est généralement utilisée pour extraire la moelle osseuse, et cette moelle osseuse est spécifiquement appelée moelle osseuse du crâne tout au long de cette étude.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le comité de protection et d’utilisation des animaux de l’Institut Duke (IACUC). Des souris mâles C57Bl/6 (âgées de 3 à 4 mois ; 22 à 28 g) ont été utilisées dans la présente étude. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisé sont répertoriés dans la table des matériaux.

1. Suspension unicellulaire à partir du cerveau de souris

REMARQUE : La figure 1 illustre la vue d’ensemble du protocole d’isolement des cellules cérébrales.

1. Anesthésier, intuber et sécuriser la souris, comme démontré précédemment¹¹.
2. Faites une incision abdominale supérieure à travers la peau et les couches musculaires sous-jacentes, et coupez soigneusement le diaphragme et les côtes pour créer l’ouverture dans la cavité thoracique.
3. Remplissez une seringue de 30 ml de PBS froid et fixez-la à l’aiguille de perfusion émoussée à l’aide d’un tube en silicone. Insérez soigneusement l’aiguille de perfusion dans le ventricule gauche.
4. Effectuez une petite entaille à l’oreillette droite pour permettre le drainage sanguin, puis perfuser¹² la souris à un débit de ~ 10 mL/min pendant 3-4 min.
   REMARQUE : Pour améliorer la clairance sanguine dans le cerveau, l’augmentation du volume de la solution de perfusion et l’ajout d’héparine peuvent être envisagés.
5. Décapitez la souris et faites une incision médiane à travers la peau sur le dessus de la tête pour exposer le crâne.
6. Grattez soigneusement tout tissu conjonctif recouvrant le crâne à l’aide d’une pince émoussée.
7. À l’aide de ciseaux de dissection tranchants, coupez soigneusement les sutures du crâne le long de la ligne médiane et des deux côtés, créant ainsi un rabat.
8. Soulevez doucement le rabat du crâne pour exposer le cerveau et utilisez une pince émoussée pour retirer soigneusement le cerveau de la cavité crânienne.
9. Plongez le cerveau dans une boîte de Pétri contenant du PBS glacé et retirez tous les tissus méninges restants.
   REMARQUE : Pour mieux préserver la viabilité cellulaire, il est recommandé d’effectuer toutes les étapes suivantes sur de la glace ou à 4 °C.
10. Placez le cerveau dans un homogénéisateur en verre prérefroidi de 15 ml contenant 20 ml (cerveau entier) ou 12 ml (demi-cerveau) de tampon HBSS glacé.
11. Utilisez le pilon lâche Dounce pour dissocier doucement et lentement le tissu cérébral avec environ 100 à 120 coups sur de la glace.
    REMARQUE : Cette étape est essentielle pour obtenir une grande quantité de cellules cérébrales saines. Cette étape dure environ 10 min. Arrêtez l’homogénéisation lorsqu’aucun morceau substantiel de tissu cérébral n’est visible dans la suspension. À ce stade, le pilon peut facilement se déplacer vers le bas sans aucune force.
12. Filtrez la suspension de tissu cérébral résultante à travers une crépine cellulaire de 70 μm dans un tube à centrifuger de 50 mL.
13. Rincez le tube Dounce avec 5 mL de HBSS et procédez à la filtration pour maximiser la collecte des cellules.
14. Centrifuger la suspension tissulaire filtrée à 550 x g pendant 6 min à 4 °C.
15. Retirer le surnageant à l’aide d’un aspirateur et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de solution à gradient de densité isotonique à 30 %.
    REMARQUE : Pour préparer 15 mL de solution de gradient de densité isotonique à 30%, mélanger 4,5 mL de milieu à gradient de densité de 100%, 1,5 mL de PBS 10× et 9 mL de ddH₂O.
16. Transférez la suspension cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 ml et ajoutez 9 ml (cerveau entier) ou 6 ml (demi-cerveau) de solution à gradient de densité de 30 %.
17. Retournez doucement le tube pour assurer un mélange complet.
18. Centrifuger immédiatement le tube à 845 x g avec l’accélération et le freinage réglés au niveau 3, pendant 20 min à 4 °C.
19. Retirez délicatement le tube de la centrifugeuse sans le secouer et aspirez soigneusement la couche supérieure de myéline à l’aide d’une pointe de 1 mL reliée au vide.
    REMARQUE : Il est extrêmement important de ne pas déranger cette couche. Toute myéline restante peut avoir un impact négatif sur la santé des cellules et compromettre les analyses en aval.
20. Aspirez le surnageant, en laissant 1 à 2 mL derrière, et remettez en suspension la pastille cellulaire avec un minimum de 10 mL de HBSS froid.
21. Centrifugeuse à 550 x g pendant 6 min à 4 °C.
22. Laver une fois de plus avec un minimum de 7 ml de HBSS froid.
23. Retirez la plus grande partie possible du surnageant et remettez les cellules en suspension pour l’analyse par cytométrie en flux à l’aide de 100 à 200 μL de tampon de cytométrie en flux.
    REMARQUE : Le tampon FACS de cytométrie en flux utilisé pour cette étude contient 0,5 % de BSA et 2 mM d’EDTA dans 1× PBS. Une plaque à fond en V de 96 puits pour la coloration des cellules est recommandée pour minimiser la perte de cellules pendant les étapes de lavage.
24. Effectuer une analyse par cytométrie en flux à l’aide d’un protocole standard établi dans chaque laboratoire¹³.
    1. Mélangez brièvement 80 μL de suspension cellulaire avec 20 μL du mélange d’anticorps dans une plaque à fond en V de 96 puits et incubez pendant 25 min à 4 °C.
    2. Laver avec 200 μL de tampon FACS, puis remettre les cellules en suspension avec 100 μL de réactif de coloration HBSS plus viabilité cellulaire.
    3. Après une incubation de 15 minutes à 4 °C, laver avec un tampon FACS et remettre les cellules en suspension dans 200 μL de tampon FACS pour l’analyse par cytométrie en flux.

2. Préparation d’une suspension unicellulaire de moelle osseuse à partir de calvaria de souris

REMARQUE : La figure 2 présente un aperçu de la procédure d’isolement de la moelle osseuse du crâne.

1. Perfusez la souris comme décrit à l’étape 1.4.
2. Décapitez la souris et faites une incision cutanée médiane sur le cuir chevelu pour exposer le crâne.
3. Coupez à travers le crâne, en commençant par le foramen magnum et en avançant le long des côtés latéraux du calvaria à l’aide de ciseaux tranchants. Ensuite, soulevez et retirez la calvaria.
   REMARQUE : Le cerveau peut être prélevé sur la même souris et traité à l’aide de l’étape 1, ce qui permet d’analyser les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne.
4. Décollez soigneusement la dure-mère du crâne à l’aide d’un microscope à disséquer à l’aide d’une pince émoussée.
   REMARQUE : Il est plus facile de commencer par les bords de l’os occipital, de se détacher lentement et de progresser progressivement vers la zone frontale, en travaillant vers l’intérieur.
5. Placez le calvaria dans le plat sur de la glace et utilisez une pipette de 1 mL pour rincer le calvaria, en veillant à ce que les résidus sanguins de sa surface soient éliminés.
6. Transférez la calvaria dans un nouveau plat avec du PBS frais et froid suffisant pour immerger la calvaria.
7. À l’aide de ciseaux stériles, coupez la calvaria en fragments d’environ 3 mm x 3 mm dans du PBS froid.
   REMARQUE : Les méthodes de culture peuvent affecter l’efficacité de l’extraction de la moelle osseuse de la calvaria. Il est recommandé d’utiliser la même méthode de culture pour minimiser la variabilité. Il est également important de couper les sutures. La figure 2B illustre une approche.
8. Percez un trou dans le fond d’un tube de microcentrifugation de 500 μL à l’aide d’une aiguille de 18 G.
9. Insérez ce tube dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL contenant 20 μL de PBS froid.
10. Transférez les fragments de calvaria dans le tube de 500 μL.
    REMARQUE : Les fragments d’os doivent être compactés sans serrer pour augmenter l’efficacité de l’extraction.
11. Centrifugeuse à 10 000 x g pendant 30 s à 4 °C.
    REMARQUE : Pour maximiser la récupération cellulaire, utilisez une aiguille de 18 G pour remuer doucement les fragments de calvaria, et répétez cette étape 1 à 2 fois de plus.
12. Remettre en suspension les cellules de moelle osseuse de calvaria collectées dans 500 μL de tampon de lyse des globules rouges et incuber à température ambiante pendant 30 s.
13. Transférez la suspension dans un tube à centrifuger de 15 mL contenant 4 mL de PBS froid.
14. Centrifuger à 400 x g pendant 6 min à 4 °C.
15. Laver une fois de plus avec 5 ml de PBS froid.
16. Remettez en suspension la pastille de cellule dans un tampon approprié. Pour la cytométrie en flux, nous utilisons généralement 500 μL de tampon FACS.
17. Pour l’analyse par cytométrie en flux, effectuez le comptage des cellules et utilisez environ 1 x 10⁶ cellules pour la coloration des anticorps.
    REMARQUE : Assurez-vous d’inclure l’étape de blocage Fc avant la coloration des anticorps¹³.

Résultats

Pour préparer des cellules immunitaires à partir du tissu cérébral de la souris, le protocole produit généralement des cellules à haute viabilité (84,1 % ± 2,3 % [moyenne ± écart-type]). Environ 70 à 80 % de ces cellules sont CD45 positives. Dans le cerveau normal d’une souris, presque toutes les cellules CD45⁺ sont microgliales (CD45^LowCD11b⁺), comme prévu. Ce protocole a été utilisé en laboratoire pour diverses applications, notamment l’analyse par cytométrie en flu...

Discussion

Ici, deux protocoles simples mais efficaces sont présentés pour isoler les cellules immunitaires du cerveau et de la moelle osseuse du crâne. Ces protocoles peuvent produire de manière fiable une grande quantité de cellules immunitaires viables qui peuvent convenir à diverses applications en aval, en particulier pour la cytométrie en flux.

Pour étudier la neuroinflammation dans divers troubles cérébraux, de nombreux protocoles pour la préparation de cellules immunitaires à partir d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544