בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

Summary

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

Abstract

ראיות מצטברות מצביעות על כך שהתגובה החיסונית המופעלת על ידי הפרעות מוחיות (למשל, איסכמיה מוחית ואנצפלומיאליטיס אוטואימונית) מתרחשת לא רק במוח, אלא גם בגולגולת. צעד מפתח לקראת ניתוח שינויים באוכלוסיית תאי מערכת החיסון במוח ובמח עצם הגולגולת לאחר נזק מוחי (למשל, שבץ) הוא להשיג מספר מספיק של תאי חיסון איכותיים לניתוחים במורד הזרם. כאן, שני פרוטוקולים אופטימליים מסופקים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. היתרונות של שני הפרוטוקולים באים לידי ביטוי בפשטותם, במהירותם וביעילותם בהפקת כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא. תאים אלה עשויים להתאים למגוון יישומים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ציטומטריית זרימה וניתוח תעתוק. כדי להדגים את יעילות הפרוטוקולים, בוצעו ניסויים אימונופנוטיפיים במוחות שבץ מוחי ובמח עצם גולגולת תקין באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, והתוצאות תאמו את ממצאי המחקרים שפורסמו.

Introduction

המוח, המרכז המרכזי של מערכת העצבים, מוגן על ידי הגולגולת. מתחת לגולגולת שלוש שכבות של רקמת חיבור הידועות בשם קרומי המוח - דורה מאטר, מאטר ארכנואיד ופיה מאטר. נוזל מוחי שדרתי (CSF) מסתובב בחלל התת עכבישי בין המאטר הארכנואיד לבין פיאה מאטר, מרפד את המוח וגם מסלק פסולת דרך המערכת הגלימפטית ^1,2. יחד, ארכיטקטורה ייחודית זו מספקת סביבה בטוחה ותומכת השומרת על יציבות המוח ומגינה עליו מפני פגיעה פוטנציאלית.

המוח נחשב כבר מזמן לחסינות-פריבילגית. עם זאת, רעיון זה נזנח חלקית מכיוון שראיות מצטברות מצביעות על כך שבנוסף לתאי מיקרוגליה בפרנכימה, גבולות המוח, כולל מקלעת הכורואיד וקרומי המוח, מארחים מערך מגוון של תאי חיסון³. תאים אלה ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס, שמירה על בריאות המוח וייזום התגובה החיסונית לפגיעה מוחית. יש לציין כי ממצאים אחרונים מצביעים על כך שהגולגולת מעורבת בחסינות קרומי המוח, ועשויה לתרום לתגובה החיסונית במוח לאחר פציעה. בשנת 2018, הריסון ועמיתיו גילו תגלית ראשונית של תעלות כלי דם ישירות המקשרות את מח עצם הגולגולת לקרומי המוח, ובכך ביססו נתיב אנטומי לנדידת לויקוציטים ^4,5. מאוחר יותר, Cugurra et al. הראו כי תאים מיאלואידים רבים (למשל, מונוציטים ונויטרופילים) ותאי B בקרומי המוח אינם מקורם בדם⁶. באמצעות טכניקות כגון השתלת עצם קלבריה ומשטרי הקרנה סלקטיבית, המחברים סיפקו ראיות משכנעות לכך שמח עצם הגולגולת משמש כמקור מקומי לתאים מיאלואידים בקרומי המוח, כמו גם פרנכימה CNS לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית⁶. יתר על כן, מחקר אחר הציע כי תאי B של קרום המוח מסופקים כל הזמן על ידי מח עצם^{הגולגולת 7}. לאחרונה, מבנה חדש, המכונה יציאת השרוול הארכנואידית (ACE), זוהה כשער ישיר בין הדורה מאטר למוח לסחר בתאי מערכת החיסון⁸.

לממצאים מרגשים אלה יש השלכות חשובות על מקור החדירה של תאי מערכת החיסון למוח הפגוע (למשל, לאחר שבץ איסכמי). עדויות רבות מצביעות על כך שלאחר שבץ, תאי חיסון רבים חודרים למוח, מה שתורם הן לנזק מוחי חריף והן להתאוששות מוחית כרונית. הרעיון המקובל הוא שתאים אלה מזרימים לויקוציטים בדם החודרים למוח, מה שמתאפשר במידה רבה על ידי נזק למחסום הדם-מוח שנגרם כתוצאה משבץ. עם זאת, רעיון זה אותגר. במחקר אחד, תאי מערכת החיסון בגולגולת ובשוקה של עכברים תויגו באופן שונה, ולאחר 6 שעות לאחר שבץ נמצאה ירידה משמעותית גדולה יותר בנויטרופילים ומונוציטים בגולגולת לעומת . הטיביה, ונויטרופילים נוספים שמקורם בגולגולת היו נוכחים במוח האיסכמי. נתונים אלה מצביעים על כך שבשלב השבץ החריף, נויטרופילים במוח האיסכמי מקורם בעיקר במח עצם^{הגולגולת 4}. מעניין, CSF עשוי להנחות הגירה זו. ואכן, שני דיווחים אחרונים הראו כי CSF יכול להעביר ישירות רמזי איתות מהמוח לתוך מח עצם הגולגולת דרך תעלות גולגולת, ולהורות נדידת תאים והמטופויזה במח עצם הגולגולת לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית ^9,10.

לאור ממצאים עדכניים אלה, נעשה חשוב לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון הן במוח והן במוח עצם הגולגולת, כאשר חוקרים את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות. בחקירות כאלה, יש צורך במספר מספיק של תאי חיסון באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ניתוח ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). כאן, המטרה הכוללת היא להציג שני הליכים אופטימליים להכנת תרחיפים חד-תאיים מרקמת המוח ומח עצם הגולגולת. חשוב לציין כי הקלבריה (עצם קדמית, עצם עורפית ועצמות קודקודיות) של הגולגולת משמשות בדרך כלל לחילוץ מח עצם, ומח עצם זה מכונה באופן ספציפי מח עצם גולגולת במהלך מחקר זה.

Protocol

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון דיוק (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 זכרים (בני 3-4 חודשים; 22-28 גרם). פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.

1. השעיה של תא בודד ממוח העכבר

הערה: איור 1 מדגים את הסקירה הכללית של פרוטוקול בידוד תאי המוח.

1. להרדים, לבצע אינטובציה ולאבטח את העכבר, כפי שהודגם קודם לכן¹¹.
2. בצעו חתך בבטן העליונה דרך העור ושכבות השרירים שמתחתיו, וחתכו בזהירות דרך הסרעפת והצלעות כדי ליצור את הפתח לחלל בית החזה.
3. ממלאים מזרק 30 מ"ל ב-PBS קר ומחברים אותו למחט הזילוח הקהה באמצעות צינורות סיליקון. הכנס בזהירות את מחט הזילוח לחדר השמאלי.
4. בצע ניק קטן באטריום הימני כדי לאפשר ניקוז דם ולאחר מכן לנקב¹² העכבר בקצב זרימה של ~ 10 מ"ל / דקה למשך 3-4 דקות.
   הערה: כדי לשפר את פינוי הדם במוח, ניתן לשקול להגדיל את נפח תמיסת הזילוח ולהוסיף הפרין.
5. ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך בקו האמצע דרך העור בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
6. יש לגרד בזהירות כל רקמת חיבור מעל הגולגולת באמצעות מלקחיים קהים.
7. השתמש מספריים דיסקציה חדה לחתוך בזהירות דרך תפרי הגולגולת לאורך קו האמצע משני הצדדים, יצירת דש.
8. הרימו בעדינות את דש הגולגולת כדי לחשוף את המוח, והשתמשו במלקחיים קהים כדי להסיר בזהירות את המוח מחלל הגולגולת.
9. טבלו את המוח בצלוחית פטרי המכילה PBS קר כקרח והסירו את כל רקמות קרום המוח שנותרו.
   הערה: כדי לשמר טוב יותר את יכולת הקיום של התא, מומלץ לבצע את כל השלבים הבאים על קרח או בטמפרטורה של 4°C.
10. הניחו את המוח בתוך זכוכית מקוררת מראש של 15 מ"ל Dounce homogenizer המכילה 20 מ"ל (מוח שלם) או 12 מ"ל (חצי מוח) של חיץ HBSS עתיק כקרח.
11. השתמש במזיק Dounce הרופף כדי לנתק בעדינות ובאיטיות את רקמת המוח עם כ 100-120 שבץ על קרח.
    הערה: שלב זה חיוני להשגת כמות גדולה של תאי מוח בריאים. שלב זה אורך כ-10 דקות. עצור הומוגניזציה כאשר לא נראים גושי רקמת מוח משמעותיים בתרחיף. בשלב זה, המזיק יכול בקלות לנוע למטה ללא כל כוח.
12. סנן את תרחיף רקמת המוח שנוצר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.
13. שטפו את צינור Dounce עם HBSS של 5 מ"ל, והמשיכו בסינון כדי למקסם את איסוף התאים.
14. צנטריפוגה את מתלה הרקמה המסונן ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
15. הסר את supernatant באמצעות שואב ואקום, והשהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של 30% צפיפות איזוטונית גרדיאנט פתרון.
    הערה: כדי ליצור 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 30%, ערבב 4.5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות מלאי של 100%, 1.5 מ"ל של 10× PBS ו- 9 מ"ל של ddH₂O.
16. מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ומוסיפים 9 מ"ל (מוח שלם) או 6 מ"ל (חצי מוח) של תמיסת שיפוע צפיפות של 30%.
17. הפוך בעדינות את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי.
18. מיד צנטריפוגה את הצינור ב 845 x g עם האצה ובלם להגדיר ברמה 3, במשך 20 דקות ב 4 ° C.
19. מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה מבלי לרעוד, ושאפו בזהירות את שכבת המיאלין העליונה באמצעות קצה של 1 מ"ל המחובר לוואקום.
    הערה: חשוב ביותר לא להפריע לשכבה זו. כל שארית המיאלין עלולה להשפיע לרעה על בריאות התאים ולפגוע בניתוחים במורד הזרם.
20. שאפו את הסופרנטנט, השאירו 1-2 מ"ל מאחור, והשעו מחדש את גלולת התא עם מינימום של 10 מ"ל HBSS קר.
21. צנטריפוגה ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
22. לשטוף פעם נוספת עם מינימום של 7 מ"ל של HBSS קר.
23. הסר כמה שיותר מהסופרנאטנט, והשהה מחדש את התאים לניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות 100-200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה.
    הערה: מאגר FACS של ציטומטריית זרימה המשמש למחקר זה מכיל 0.5% BSA ו- 2 mM EDTA ב- 1× PBS. פלטה תחתונה V בעלת 96 בארות לצביעת תאים מומלצת כדי למזער את אובדן התאים במהלך שלבי הכביסה.
24. ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שנקבע במעבדות בודדות¹³.
    1. בקצרה, לערבב 80 μL של תרחיף התא עם 20 μL של תערובת נוגדנים בצלחת V-תחתית 96-באר לדגור במשך 25 דקות ב 4 ° C.
    2. יש לשטוף עם 200 μL של מאגר FACS ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים עם 100 μL של HBSS בתוספת מגיב צביעת כדאיות התא.
    3. לאחר דגירה של 15 דקות ב-4°C, יש לשטוף עם חיץ FACS ולהשהות מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה.

2. הכנת מח עצם חד תאי השעיה מ calvaria עכבר

הערה: איור 2 מתאר סקירה כללית של הליך בידוד מח עצם הגולגולת.

1. נקב את העכבר כמתואר בשלב 1.4.
2. ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך עור בקו האמצע בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.
3. חותכים דרך הגולגולת, מתחילים מהפורמן מגנום ונעים קדימה לאורך הצדדים הרוחביים של הקלבריה באמצעות מספריים חדים. לאחר מכן, להרים ולהסיר את calvaria.
   הערה: ניתן לקצור את המוח מאותו עכבר ולעבד אותו באמצעות שלב 1, המאפשר ניתוח של תאי מערכת החיסון הן מהמוח והן ממח עצם הגולגולת.
4. מקלפים בזהירות את הדורה מאטר מהגולגולת תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מלקחיים קהים.
   הערה: קל יותר להתחיל בשולי העצם העורפית, להתנתק לאט, ולהתקדם בהתמדה לכיוון האזור הקדמי, לעבוד פנימה.
5. מניחים את calvaria בצלחת על קרח ולהשתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשטוף את calvaria, הבטחת הסרת שאריות דם מפני השטח שלה.
6. מעבירים את הקלבריה למאכל חדש עם PBS טרי וקר מספיק כדי לטבול את הקלבריה.
7. השתמש מספריים סטריליים לחתוך את calvaria לתוך כ 3 מ"מ x 3 מ"מ רסיסים PBS קר.
   הערה: שיטות חיתוך עשויות להשפיע על היעילות של מיצוי מח עצם קלווריה. מומלץ להשתמש באותה שיטת חיתוך כדי למזער את השונות. חשוב גם לחתוך את התפרים. איור 2B מדגים גישה אחת.
8. תקעו חור בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרוליטר באמצעות מחט של 18 גרם.
9. הכנס צינור זה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 20 μL של PBS קר.
10. מעבירים את שברי הקלבריה לצינור 500 μL.
    הערה: יש לארוז את שברי העצם באופן רופף כדי להגביר את יעילות החילוץ.
11. צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C.
    הערה: כדי למקסם את התאוששות התא, השתמש במחט 18 G כדי לערבב בעדינות את שברי הקלבריה, וחזור על שלב זה 1-2 פעמים נוספות.
12. להשהות מחדש את תאי מח העצם calvaria שנאספו ב 500 μL של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.
13. העבר את המתלה לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל PBS קר.
14. צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.
15. לשטוף פעם נוספת עם 5 מ"ל של PBS קר.
16. השהה מחדש את גלולת התא במאגר מתאים. עבור ציטומטריית זרימה, אנו משתמשים בדרך כלל ב- 500 μL של מאגר FACS.
17. לניתוח ציטומטריית זרימה, בצע ספירת תאים והשתמש בכ- 1 x 10⁶ תאים לצביעת נוגדנים.
    הערה: הקפד לכלול את שלב חסימת Fc לפני צביעת נוגדנים¹³.

תוצאות

כדי להכין תאי חיסון מרקמת המוח של עכבר, הפרוטוקול בדרך כלל מניב תאים עם כדאיות גבוהה (84.1% ± 2.3% [ממוצע ± SD]). כ 70%-80% של תאים אלה הם CD45 חיובי. במוח עכבר רגיל, כמעט כל תאי CD45⁺ הם מיקרוגליה (CD45 CD11b ^{נמוך +}), כצפוי. פרוטוקול זה שימש במעבדה ליישומים שונים, כולל ניתוח ציטומטריית זרימה, מיון...

Discussion

כאן מוצגים שני פרוטוקולים פשוטים אך יעילים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. פרוטוקולים אלה יכולים להניב באופן אמין כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא שעשויים להתאים ליישומים מגוונים במורד הזרם, במיוחד עבור ציטומטריית זרימה.

כדי לחקור דלקת עצבית בהפרעות מוח ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544