マウスの脳と頭蓋骨からの免疫細胞の単離

要約

脳疾患に対する免疫応答を調べるために、免疫細胞の変化を解析するアプローチが一般的です。ここでは、マウスの脳組織と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するための2つの簡単で効果的なプロトコルが提供されています。

要約

脳の障害(脳虚血や自己免疫性脳脊髄炎など)によって引き起こされる免疫応答は、脳だけでなく頭蓋骨でも起こるという証拠が増えています。脳損傷(脳卒中など)後の脳と頭蓋骨骨髄の両方の免疫細胞集団の変化を解析するための重要なステップは、ダウンストリーム解析に十分な数の高品質の免疫細胞を取得することです。ここでは、脳と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を単離するために、2つの最適化されたプロトコルが提供されています。両方のプロトコルの利点は、その簡便性、速度、および大量の生存免疫細胞の生成における有効性に反映されています。これらの細胞は、細胞ソーティング、フローサイトメトリー、トランスクリプトーム解析など、さまざまなダウンストリームアプリケーションに適している可能性があります。プロトコールの有効性を実証するために、フローサイトメトリー解析を用いて脳卒中脳と正常脳頭蓋骨髄のイムノフェノタイピング実験を行い、その結果は発表された研究結果と一致しました。

概要

神経系の中枢である脳は、頭蓋骨によって保護されています。頭蓋骨の下には、髄膜として知られる結合組織の3つの層(硬膜、くも膜、軟膜)があります。脳脊髄液(CSF)は、くも膜母と軟膜の間のくも膜下腔を循環し、脳を緩衝し、またリンパ系を介して老廃物を取り除きます^1,2。このユニークなアーキテクチャは、脳の安定性を維持し、潜在的な損傷から脳を保護する安全で支援的な環境を提供します。

脳は長い間、免疫特権があると考えられてきました。しかし、実質に常在するミクログリアに加えて、脈絡叢や髄膜を含む脳の境界には多様な免疫細胞が宿主であるという証拠が増えているため、この概念は部分的に放棄されています³。これらの細胞は、恒常性の維持、脳の健康の監視、および脳損傷に対する免疫応答の開始に重要な役割を果たします。特に、最近の知見では、頭蓋骨が髄膜免疫に関与しており、損傷後の脳内の免疫応答に寄与している可能性が示されています。2018年、Herissonらは、頭蓋骨骨髄と髄膜をつなぐ直接的な血管チャネルの独創的な発見をし、それによって白血球の移動の解剖学的経路を確立しました^4,5。その後、Cugurraらは、髄膜の多くの骨....

プロトコル

このプロトコルは、デューク研究所の動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されました。本研究では、雄のC57Bl/6マウス(生後3-4ヶ月;22-28g)を用いた。試薬や使用した機器の詳細は、 資料表に記載されています。

1. マウス脳からのシングルセル懸濁液

注: 図1 は、脳細胞単離プロトコルの概要を示しています。

1. 前に示したように、マウスに麻酔をかけ、挿管し、固定します¹¹.
2. 皮膚とその下の筋肉層を上腹部に切開し、横隔膜と肋骨を慎重に切り込んで胸腔への開口部を作ります。
3. 30mLのシリンジに冷たいPBSを入れ、シリコンチューブ を介して 鈍灌流針に取り付けます。灌流針を左心室に慎重に挿入します。
4. 右心房に小さな切り込みを入れて血液を排出し、その後、~10mL/minの流速でマウス¹² を3〜4分間灌流します。
   注:脳内の血液クリアランスを改善するために、灌流溶液の量を増やし、ヘパリンを追加することを検討することができます。
5. マウスの首を切り、頭頂部の皮膚に正中線を....

ディスカッション

ここでは、脳と頭蓋骨骨髄から免疫細胞を分離するための2つのシンプルかつ効果的なプロトコルを紹介します。これらのプロトコルは、多様なダウンストリームアプリケーション、特にフローサイトメトリーに適した大量の生存免疫細胞を確実に生成できます。

様々な脳障害における神経炎症を研究するために、脳からの免疫細胞調製のための多くのプロトコルが確立?.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544