Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Zusammenfassung

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Zusammenfassung

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Immunantwort, die durch Erkrankungen des Gehirns (z. B. Hirnischämie und autoimmune Enzephalomyelitis) ausgelöst wird, nicht nur im Gehirn, sondern auch im Schädel auftritt. Ein wichtiger Schritt zur Analyse von Veränderungen in Immunzellpopulationen sowohl im Gehirn als auch im Schädelknochenmark nach einer Hirnschädigung (z. B. Schlaganfall) ist die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl hochwertiger Immunzellen für nachgelagerte Analysen. Hier werden zwei optimierte Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark zur Verfügung gestellt. Die Vorteile beider Protokolle spiegeln sich in ihrer Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirksamkeit bei der Gewinnung einer großen Menge lebensfähiger Immunzellen wider. Diese Zellen können für eine Reihe von Downstream-Anwendungen geeignet sein, wie z. B. Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Transkriptomanalyse. Um die Wirksamkeit der Protokolle zu demonstrieren, wurden Immunphänotypisierungsexperimente an Schlaganfallgehirnen und normalem Hirnschädelknochenmark mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, und die Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen veröffentlichter Studien überein.

Einleitung

Das Gehirn, der zentrale Knotenpunkt des Nervensystems, wird durch den Schädel geschützt. Unter dem Schädel befinden sich drei Schichten Bindegewebe, die als Hirnhäute bekannt sind - die Dura mater, die Arachnoidea mater und die Pia mater. Im Subarachnoidalraum zwischen Arachnoidalflüssigkeit und Pia mater zirkuliert der Liquor cerebrospinalis, der das Gehirn abfedert und auch Abfallstoffe über das glymphatische System abtransportiert ^1,2. Zusammen bietet diese einzigartige Architektur eine sichere und unterstützende Umgebung, die die Stabilität des Gehirns aufrechterhält und es vor möglichen Verletzungen schützt.

Das Gehirn galt lange Zeit als immunprivilegiert. Diese Vorstellung wurde jedoch teilweise aufgegeben, da sich die Beweise häufen, dass neben den residenten Mikroglia im Parenchym auch die Grenzen des Gehirns, einschließlich des Plexus choroideus und der Hirnhäute, eine Vielzahl von Immunzellen beherbergen³. Diese Zellen spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Homöostase, der Überwachung der Gehirngesundheit und der Initiierung der Immunantwort auf Hirnverletzungen. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass der Schädel an der Immunität der Hirnhäute beteiligt ist und zur Immunantwort im Gehirn nach einer Verletzung beitragen kann. Im Jahr 2018 machten Herisson et al. eine bahnbrechende Entdeckung von direkten Gefäßkanälen, die das Schädelknochenmark mit den Hirnhäuten verbinden, und etablierten damit einen anatomischen Weg für die Leukozytenmigration ^4,5. Später zeigten Cugurra et al., dass viele myeloische Zellen (z.B. Monozyten und Neutrophile) und B-Zellen in den Hirnhäuten nicht aus dem Blut stammen⁶. Mit Techniken wie der Transplantation von Knochenlappen der Kalvaria und selektiven Bestrahlungsschemata lieferten die Autoren überzeugende Beweise dafür, dass das Schädelknochenmark als lokale Quelle für myeloische Zellen in den Hirnhäuten sowie als ZNS-Parenchym nach ZNS-Verletzung dient⁶. Darüber hinaus schlug eine andere Studie vor, dass meningeale B-Zellen ständig vom Schädelknochenmark versorgt werden⁷. In jüngerer Zeit wurde eine neuartige Struktur, der sogenannte Arachnoidalmanschettenausgang (ACE), als direktes Tor zwischen der Dura mater und dem Gehirn für den Transport von Immunzellen identifiziert⁸.

Diese aufregenden Erkenntnisse haben wichtige Implikationen für die Entstehung der Infiltration von Immunzellen in das verletzte Gehirn (z. B. nach einem ischämischen Schlaganfall). Eine Vielzahl von Beweisen deutet darauf hin, dass nach einem Schlaganfall viele Immunzellen das Gehirn infiltrieren und sowohl zu akuten Hirnschäden als auch zu chronischer Gehirnerholung beitragen. Die gängige Vorstellung ist, dass es sich bei diesen Zellen um zirkulierende Leukozyten im Blut handelt, die das Gehirn infiltrieren, was weitgehend durch eine durch einen Schlaganfall verursachte Schädigung der Blut-Hirn-Schranke erleichtert wird. Diese Vorstellung wurde jedoch in Frage gestellt. In einer Studie wurden Immunzellen im Schädel und in der Tibia von Mäusen unterschiedlich markiert, und 6 Stunden nach dem Schlaganfall wurde eine signifikant stärkere Abnahme der Neutrophilen und Monozyten im Schädel im Vergleich zum Schädel festgestellt. Die Tibia und weitere vom Schädel stammende Neutrophile waren im ischämischen Gehirn vorhanden. Diese Daten deuten darauf hin, dass in der akuten Schlaganfallphase die Neutrophilen im ischämischen Gehirn hauptsächlich aus dem Schädelknochenmark stammen⁴. Interessanterweise kann CSF diese Migration leiten. In der Tat zeigten zwei kürzlich erschienene Berichte, dass Liquor Signalsignale vom Gehirn über Schädelkanäle direkt an das Schädelknochenmark weiterleiten und die Zellmigration und Hämatopoese im Schädelknochenmark nach einer ZNS-Verletzung anweisen^{kann 9,10}.

Angesichts dieser jüngsten Erkenntnisse ist es wichtig geworden, Veränderungen in Immunzellen sowohl im Gehirn als auch im Schädelknochenmark zu analysieren, um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen. Für solche Untersuchungen wird eine ausreichende Anzahl hochwertiger Immunzellen für nachgelagerte Analysen wie Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) benötigt. Hier geht es darum, zwei optimierte Verfahren zur Herstellung von Einzelzellsuspensionen aus Hirngewebe und Schädelknochenmark vorzustellen. Es ist wichtig zu beachten, dass die Schädeldecke (Stirnbein, Hinterhauptbein und Scheitelknochen) des Schädels typischerweise zur Entnahme von Knochenmark verwendet wird, und dieses Knochenmark wird in dieser Studie ausdrücklich als Schädelknochenmark bezeichnet.

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der aktuellen Studie wurden männliche C57Bl/6-Mäuse (3-4 Monate alt; 22-28 g) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Einzellige Suspension aus dem Gehirn der Maus

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Protokoll zur Isolierung von Gehirnzellen.

1. Anästhesieren, intubieren und sichern Sie die Maus, wie zuvor gezeigt¹¹.
2. Machen Sie einen Schnitt im Oberbauch durch die Haut und die darunter liegenden Muskelschichten und schneiden Sie vorsichtig durch das Zwerchfell und die Rippen, um die Öffnung in die Brusthöhle zu schaffen.
3. Füllen Sie eine 30-ml-Spritze mit kaltem PBS und befestigen Sie sie über einen Silikonschlauch an der stumpfen Perfusionsnadel. Führen Sie die Perfusionsnadel vorsichtig in die linke Herzkammer ein.
4. Führen Sie eine kleine Kerbe am rechten Vorhof durch, um den Blutabfluss zu ermöglichen, und perfundieren Sie dann die Maus¹² mit einer Flussrate von ~ 10 mL/min für 3-4 Minuten.
   HINWEIS: Um die Blutclearance im Gehirn zu verbessern, kann eine Erhöhung des Volumens der Perfusionslösung und die Zugabe von Heparin in Betracht gezogen werden.
5. Enthaupte die Maus und mache einen Schnitt durch die Haut auf der Oberseite des Kopfes, um den Schädel freizulegen.
6. Kratzen Sie das Bindegewebe, das über dem Schädel liegt, vorsichtig mit einer stumpfen Pinzette ab.
7. Schneide mit einer scharfen Präparierschere vorsichtig durch die Schädelnähte entlang der Mittellinie und auf beiden Seiten, so dass ein Lappen entsteht.
8. Heben Sie den Schädellappen vorsichtig an, um das Gehirn freizulegen, und verwenden Sie eine stumpfe Pinzette, um das Gehirn vorsichtig aus der Schädelhöhle zu entfernen.
9. Tauchen Sie das Gehirn in eine Petrischale, die eiskaltes PBS enthält, und entfernen Sie das restliche Hirnhautgewebe.
   HINWEIS: Um die Lebensfähigkeit der Zellen besser zu erhalten, wird empfohlen, alle folgenden Schritte auf Eis oder bei 4 °C durchzuführen.
10. Legen Sie das Gehirn in einen vorgekühlten 15-ml-Glas-Dounce-Homogenisator, der 20 mL (ganzes Gehirn) oder 12 mL (halbes Gehirn) eisalten HBSS-Puffer enthält.
11. Verwenden Sie den losen Dounce Stößel, um das Hirngewebe mit etwa 100-120 Schlägen auf Eis sanft und langsam zu dissoziieren.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist entscheidend, um eine große Menge gesunder Gehirnzellen zu erhalten. Dieser Schritt dauert ca. 10 Minuten. Stoppen Sie die Homogenisierung, wenn keine wesentlichen Hirngewebestücke in der Suspension sichtbar sind. An dieser Stelle kann sich der Stößel leicht und ohne Kraft nach unten bewegen.
12. Die resultierende Suspension des Hirngewebes wird durch ein 70-μm-Zellsieb in einem 50-ml-Zentrifugenröhrchen filtriert.
13. Spülen Sie das Dounce-Röhrchen mit 5 mL HBSS und fahren Sie mit der Filtration fort, um die Zellentnahme zu maximieren.
14. Die filtrierte Gewebesuspension bei 550 x g für 6 min bei 4 °C zentrifugieren.
15. Entfernen Sie den Überstand mit einem Vakuumsauger und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1 ml 30%iger isotonischer Dichtegradientenlösung.
    HINWEIS: Um 15 ml 30 % isotonische Dichtegradientenlösung herzustellen, mischen Sie 4,5 ml 100 % Stammdichtegradientenmedium, 1,5 ml 10× PBS und 9 ml ddH₂O.
16. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 9 ml (ganzes Gehirn) oder 6 ml (halbes Gehirn) mit 30 % Dichtegradientenlösung hinzu.
17. Drehen Sie das Rohr vorsichtig um, um eine gründliche Durchmischung zu gewährleisten.
18. Das Röhrchen sofort bei 845 x g zentrifugieren, Beschleunigung und Bremse auf Stufe 3 stellen, 20 min lang bei 4 °C.
19. Nehmen Sie das Röhrchen vorsichtig und ohne Schütteln aus der Zentrifuge und saugen Sie die obere Myelinschicht vorsichtig mit einer 1-ml-Spitze ab, die mit dem Vakuum verbunden ist.
    HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, diese Schicht nicht zu stören. Verbleibendes Myelin kann sich negativ auf die Zellgesundheit auswirken und nachgelagerte Analysen beeinträchtigen.
20. Aspirieren Sie den Überstand, lassen Sie 1-2 mL zurück und resuspendieren Sie das Zellpellet mit mindestens 10 mL kaltem HBSS.
21. Zentrifugieren bei 550 x g für 6 min bei 4 °C.
22. Waschen Sie sich noch einmal mit mindestens 7 ml kaltem HBSS.
23. Entfernen Sie so viel Überstand wie möglich und resuspendieren Sie die Zellen für die Durchflusszytometrie-Analyse mit 100-200 μl Durchflusszytometrie-Puffer.
    HINWEIS: Der für diese Studie verwendete FACS-Puffer für die Durchflusszytometrie enthält 0,5 % BSA und 2 mM EDTA in 1× PBS. Eine 96-Well-V-Bodenplatte für die Zellfärbung wird empfohlen, um den Zellverlust während der Waschschritte zu minimieren.
24. Durchführung von Durchflusszytometrie-Analysen unter Verwendung eines Standardprotokolls, das in den einzelnen Labors etabliert ist¹³.
    1. Kurz gesagt, 80 μl Zellsuspension mit 20 μl des Antikörpergemisches in einer 96-Well-V-Bodenplatte mischen und 25 min bei 4 °C inkubieren.
    2. Waschen Sie die Zellen mit 200 μl FACS-Puffer und resuspendieren Sie die Zellen dann mit 100 μl HBSS plus Reagenz zur Färbung der Zellviabilität.
    3. Nach einer 15-minütigen Inkubation bei 4 °C waschen Sie die Zellen mit FACS-Puffer und resuspendieren Sie sie in 200 μl FACS-Puffer für die Durchflusszytometrie-Analyse.

2. Herstellung einer einzelligen Suspension aus dem Knochenmark aus dem Schädeldach der Maus

HINWEIS: Abbildung 2 zeigt einen Überblick über das Verfahren zur Isolierung des Schädelknochenmarks.

1. Persolidieren Sie die Maus wie in Schritt 1.4 beschrieben.
2. Enthaupten Sie die Maus und machen Sie einen Hautschnitt in der Mittellinie, um den Schädel freizulegen.
3. Schneiden Sie den Schädel durch, beginnend mit dem Foramen magnum und mit einer scharfen Schere entlang der lateralen Seiten der Schädeldecke. Heben Sie dann den Schädelball an und entfernen Sie ihn.
   HINWEIS: Das Gehirn kann von derselben Maus entnommen und mit Schritt 1 bearbeitet werden, was die Analyse von Immunzellen sowohl aus dem Gehirn als auch aus dem Schädelknochenmark ermöglicht.
4. Ziehen Sie die Dura mater vorsichtig unter einem Präpariermikroskop mit einer stumpfen Pinzette vom Schädel ab.
   HINWEIS: Es ist einfacher, an den Rändern des Hinterhauptbeins zu beginnen, sich langsam zu lösen und sich stetig in Richtung des vorderen Bereichs zu bewegen, indem man sich nach innen arbeitet.
5. Legen Sie die Schädeldecke in die Schale auf Eis und spülen Sie die Schädeldecke mit einer 1-ml-Pipette ab, um sicherzustellen, dass Blutrückstände von der Oberfläche entfernt werden.
6. Übertragen Sie die Schädeldecke in eine neue Schüssel mit frischem, kaltem PBS, das ausreicht, um die Schädeldecke einzutauchen.
7. Schneiden Sie die Schädeldecke mit einer sterilen Schere in ca. 3 mm x 3 mm große Fragmente bei kaltem PBS.
   HINWEIS: Die Schnittmethoden können die Effizienz der Knochenmarkentnahme aus dem Kalvarienberg beeinträchtigen. Es wird empfohlen, die gleiche Zuschnittmethode zu verwenden, um die Variabilität zu minimieren. Wichtig ist auch, die Nähte aufzuschneiden. Abbildung 2B veranschaulicht einen Ansatz.
8. Bohren Sie mit einer 18-G-Nadel ein Loch in den Boden eines 500-μl-Mikrozentrifugenröhrchens.
9. Führen Sie dieses Röhrchen in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen ein, das 20 μl kaltes PBS enthält.
10. Übertragen Sie die Schädeldachfragmente in das 500-μl-Röhrchen.
    HINWEIS: Die Knochenfragmente sollten locker gepackt werden, um die Extraktionseffizienz zu erhöhen.
11. Zentrifugieren Sie bei 10.000 x g für 30 s bei 4 °C.
    HINWEIS: Um die Zellrückgewinnung zu maximieren, rühren Sie die Schädeldachfragmente mit einer 18-G-Nadel vorsichtig um und wiederholen Sie diesen Schritt noch 1-2 Mal.
12. Resuspendieren Sie die gesammelten Knochenmarkzellen der Kalvaria in 500 μl Lysepuffer der roten Blutkörperchen und inkubieren Sie sie 30 s lang bei Raumtemperatur.
13. Die Suspension wird in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 4 ml kaltem PBS überführt.
14. Zentrifugieren bei 400 x g für 6 min bei 4 °C.
15. Waschen Sie noch einmal mit 5 ml kaltem PBS.
16. Resuspendieren Sie das Zellpellet in einem geeigneten Puffer. Für die Durchflusszytometrie verwenden wir in der Regel 500 μl FACS-Puffer.
17. Führen Sie für die durchflusszytometrische Analyse eine Zellzählung durch und verwenden Sie ca. 1 x 10⁶ Zellen für die Antikörperfärbung.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Fc-Blockschritt vor der Antikörperfärbung¹³ eingeschlossen wird.

Ergebnisse

Zur Präparation von Immunzellen aus dem Hirngewebe der Maus liefert das Protokoll im Allgemeinen Zellen mit hoher Lebensfähigkeit (84,1 % ± 2,3 % [mittlere ± SD]). Etwa 70%-80% dieser Zellen sind CD45-positiv. Im normalen Mäusegehirn sind erwartungsgemäß fast alle CD45⁺-Zellen Mikroglia (CD45^LowCD11b⁺). Dieses Protokoll wurde im Labor für verschiedene Anwendungen verwendet, darunter Durchflusszytometrie-Analysen, fluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) und scRNA-seq-Analysen. ...

Diskussion

Hier werden zwei einfache, aber effektive Protokolle zur Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark vorgestellt. Diese Protokolle können zuverlässig eine große Menge lebensfähiger Immunzellen liefern, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen, insbesondere für die Durchflusszytometrie, geeignet sein können.

Um die Neuroinflammation bei verschiedenen Erkrankungen des Gehirns zu untersuchen, wurden viele Protokolle für Immunzellpräparate aus dem Gehirn et...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544