Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädel von Mäusen

Zusammenfassung

Um die Immunantwort auf Hirnerkrankungen zu untersuchen, ist ein gängiger Ansatz die Analyse von Veränderungen in Immunzellen. Hier werden zwei einfache und effektive Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus murinem Hirngewebe und Schädelknochenmark bereitgestellt.

Zusammenfassung

Es gibt immer mehr Hinweise darauf, dass die Immunantwort, die durch Erkrankungen des Gehirns (z. B. Hirnischämie und autoimmune Enzephalomyelitis) ausgelöst wird, nicht nur im Gehirn, sondern auch im Schädel auftritt. Ein wichtiger Schritt zur Analyse von Veränderungen in Immunzellpopulationen sowohl im Gehirn als auch im Schädelknochenmark nach einer Hirnschädigung (z. B. Schlaganfall) ist die Gewinnung einer ausreichenden Anzahl hochwertiger Immunzellen für nachgelagerte Analysen. Hier werden zwei optimierte Protokolle für die Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark zur Verfügung gestellt. Die Vorteile beider Protokolle spiegeln sich in ihrer Einfachheit, Geschwindigkeit und Wirksamkeit bei der Gewinnung einer großen Menge lebensfähiger Immunzellen wider. Diese Zellen können für eine Reihe von Downstream-Anwendungen geeignet sein, wie z. B. Zellsortierung, Durchflusszytometrie und Transkriptomanalyse. Um die Wirksamkeit der Protokolle zu demonstrieren, wurden Immunphänotypisierungsexperimente an Schlaganfallgehirnen und normalem Hirnschädelknochenmark mittels Durchflusszytometrie durchgeführt, und die Ergebnisse stimmten mit den Ergebnissen veröffentlichter Studien überein.

Einleitung

Das Gehirn, der zentrale Knotenpunkt des Nervensystems, wird durch den Schädel geschützt. Unter dem Schädel befinden sich drei Schichten Bindegewebe, die als Hirnhäute bekannt sind - die Dura mater, die Arachnoidea mater und die Pia mater. Im Subarachnoidalraum zwischen Arachnoidalflüssigkeit und Pia mater zirkuliert der Liquor cerebrospinalis, der das Gehirn abfedert und auch Abfallstoffe über das glymphatische System abtransportiert ^1,2. Zusammen bietet diese einzigartige Architektur eine sichere und unterstützende Umgebung, die die Stabilität des Gehirns aufrechterhält und es vor möglichen Verletzungen schü....

Protokoll

Das Protokoll wurde vom Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigt. In der aktuellen Studie wurden männliche C57Bl/6-Mäuse (3-4 Monate alt; 22-28 g) verwendet. Die Details zu den Reagenzien und den verwendeten Geräten sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Einzellige Suspension aus dem Gehirn der Maus

HINWEIS: Abbildung 1 zeigt einen Überblick über das Protokoll zur Isolierung von Gehirnzellen.

1. Anästhesieren, intubieren und sichern Sie die Maus, wie zuvor gezeigt¹¹.
2. Machen Sie einen ....

Diskussion

Hier werden zwei einfache, aber effektive Protokolle zur Isolierung von Immunzellen aus dem Gehirn und dem Schädelknochenmark vorgestellt. Diese Protokolle können zuverlässig eine große Menge lebensfähiger Immunzellen liefern, die für verschiedene nachgelagerte Anwendungen, insbesondere für die Durchflusszytometrie, geeignet sein können.

Um die Neuroinflammation bei verschiedenen Erkrankungen des Gehirns zu untersuchen, wurden viele Protokolle für Immunzellpräparate aus dem Gehirn et.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544