Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Riepilogo

Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell'analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.

Abstract

Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l'analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l'analisi trascrittomica. Per dimostrare l'efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l'analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.

Introduzione

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l'aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l'aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico ^1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-pr....

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo

NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali.

1. Anestetizzare, intubare e fissare il topo, come dimostrato in precedenza¹¹.
2. Praticare ....

Discussione

Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.

Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervel.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544