Isolamento delle cellule immunitarie dal cervello e dal cranio del topo

Riepilogo

Per studiare la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali, un approccio comune consiste nell'analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie. Qui, vengono forniti due protocolli semplici ed efficaci per isolare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale murino e dal midollo osseo del cranio.

Abstract

Prove crescenti indicano che la risposta immunitaria innescata da disturbi cerebrali (ad esempio, ischemia cerebrale ed encefalomielite autoimmune) si verifica non solo nel cervello, ma anche nel cranio. Un passo fondamentale verso l'analisi dei cambiamenti nelle popolazioni di cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio dopo un danno cerebrale (ad esempio, ictus) è ottenere un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle. Qui, vengono forniti due protocolli ottimizzati per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. I vantaggi di entrambi i protocolli si riflettono nella loro semplicità, velocità ed efficacia nel produrre una grande quantità di cellule immunitarie vitali. Queste cellule possono essere adatte per una vasta gamma di applicazioni a valle, come lo smistamento cellulare, la citometria a flusso e l'analisi trascrittomica. Per dimostrare l'efficacia dei protocolli, sono stati eseguiti esperimenti di immunofenotipizzazione su cervelli colpiti da ictus e midollo osseo cranio cerebrale normale utilizzando l'analisi della citometria a flusso, e i risultati sono stati allineati con i risultati degli studi pubblicati.

Introduzione

Il cervello, il fulcro centrale del sistema nervoso, è protetto dal cranio. Sotto il cranio ci sono tre strati di tessuto connettivo noti come meningi: la dura madre, l'aracnoide e la pia madre. Il liquido cerebrospinale (CSF) circola nello spazio subaracnoideo tra l'aracnoide e la pia madre, ammortizzando il cervello e rimuovendo anche i rifiuti attraverso il sistema glinfatico ^1,2. Insieme, questa architettura unica fornisce un ambiente sicuro e di supporto che mantiene la stabilità del cervello e lo protegge da potenziali lesioni.

Il cervello è stato a lungo considerato immuno-privilegiato. Tuttavia, questa nozione è stata parzialmente abbandonata poiché prove crescenti indicano che, oltre alle microglia residenti nel parenchima, i bordi del cervello, compreso il plesso coroideo e le meningi, ospitano una vasta gamma di cellule immunitarie³. Queste cellule svolgono un ruolo fondamentale nel mantenimento dell'omeostasi, nella sorveglianza della salute del cervello e nell'avvio della risposta immunitaria alle lesioni cerebrali. In particolare, recenti scoperte indicano che il cranio è coinvolto nell'immunità delle meningi e può contribuire alla risposta immunitaria nel cervello dopo una lesione. Nel 2018, Herisson et al. hanno fatto una scoperta fondamentale dei canali vascolari diretti che collegano il midollo osseo del cranio alle meningi, stabilendo così un percorso anatomico per la migrazione dei leucociti ^4,5. Successivamente, Cugurra et al. hanno dimostrato che molte cellule mieloidi (ad esempio, monociti e neutrofili) e le cellule B nelle meningi non originano dal sangue⁶. Utilizzando tecniche come il trapianto di lembo osseo calvario e regimi di irradiazione selettiva, gli autori hanno fornito prove convincenti che il midollo osseo del cranio funge da fonte locale per le cellule mieloidi nelle meningi e per il parenchima del SNC dopo una lesione del SNC⁶. Inoltre, un altro studio ha proposto che le cellule B meningee siano costantemente fornite dal midollo osseo del cranio⁷. Più recentemente, una nuova struttura, chiamata uscita della cuffia aracnoidea (ACE), è stata identificata come una porta diretta tra la dura madre e il cervello per il traffico di cellule immunitarie⁸.

Questi interessanti risultati hanno importanti implicazioni per l'origine dell'infiltrazione delle cellule immunitarie nel cervello danneggiato (ad esempio, dopo un ictus ischemico). Un ampio corpus di prove ha indicato che dopo l'ictus, molte cellule immunitarie si infiltrano nel cervello, contribuendo sia al danno cerebrale acuto che al recupero cerebrale cronico. L'idea convenzionale è che queste cellule siano leucociti circolanti nel sangue che si infiltrano nel cervello, il che è in gran parte facilitato dal danno alla barriera emato-encefalica indotto dall'ictus. Tuttavia, questa nozione è stata messa in discussione. In uno studio, le cellule immunitarie nel cranio e nella tibia dei topi sono state etichettate in modo diverso e, a 6 ore dall'ictus, è stata riscontrata una diminuzione significativamente maggiore dei neutrofili e dei monociti nel cranio rispetto all'ictus. La tibia e altri neutrofili derivati dal cranio erano presenti nel cervello ischemico. Questi dati suggeriscono che nella fase acuta di ictus, i neutrofili nel cervello ischemico originano principalmente dal midollo osseo del cranio⁴. È interessante notare che il liquido cerebrospinale può guidare questa migrazione. Infatti, due recenti rapporti hanno dimostrato che il liquido cerebrospinale può trasmettere direttamente segnali di segnalazione dal cervello al midollo osseo del cranio attraverso i canali del cranio e istruire la migrazione cellulare e l'emopoiesi nel midollo osseo del cranio dopo una lesione del SNC ^9,10.

Alla luce di queste recenti scoperte, è diventato importante analizzare i cambiamenti nelle cellule immunitarie sia nel cervello che nel midollo osseo del cranio, quando si studia la risposta immunitaria ai disturbi cerebrali. In tali indagini, è necessario un numero sufficiente di cellule immunitarie di alta qualità per le analisi a valle come lo smistamento cellulare, l'analisi della citometria a flusso e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq). Qui, l'obiettivo generale è quello di presentare due procedure ottimizzate per la preparazione di sospensioni unicellulari dal tessuto cerebrale e dal midollo osseo del cranio. È importante notare che la calvaria (osso frontale, osso occipitale e ossa parietali) del cranio viene tipicamente utilizzata per estrarre il midollo osseo e questo midollo osseo è specificamente indicato come midollo osseo del cranio in questo studio.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dal Duke Institute Animal Care and Use Committee (IACUC). Nel presente studio sono stati utilizzati topi maschi C57Bl/6 (3-4 mesi; 22-28 g). I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate sono elencati nella Tabella dei Materiali.

1. Sospensione di una singola cellula dal cervello di topo

NOTA: La Figura 1 illustra la panoramica del protocollo di isolamento delle cellule cerebrali.

1. Anestetizzare, intubare e fissare il topo, come dimostrato in precedenza¹¹.
2. Praticare un'incisione addominale superiore attraverso la pelle e gli strati muscolari sottostanti e tagliare con cura il diaframma e le costole per creare l'apertura nella cavità toracica.
3. Riempire una siringa da 30 ml con PBS freddo e collegarla all'ago di perfusione smussato tramite un tubo di silicone. Inserire con cautela l'ago di perfusione nel ventricolo sinistro.
4. Eseguire un piccolo taglio nell'atrio destro per consentire il drenaggio del sangue e quindi perfondere¹² il topo a una velocità di flusso di ~ 10 ml/min per 3-4 minuti.
   NOTA: Per migliorare la clearance del sangue nel cervello, può essere preso in considerazione l'aumento del volume della soluzione di perfusione e l'aggiunta di eparina.
5. Decapita il topo e fai un'incisione sulla linea mediana attraverso la pelle sulla parte superiore della testa per esporre il cranio.
6. Raschiare via con cura il tessuto connettivo sovrastante il cranio utilizzando una pinza smussata.
7. Usa le forbici da dissezione affilate per tagliare con cura le suture del cranio lungo la linea mediana e su entrambi i lati, creando un lembo.
8. Sollevare delicatamente il lembo cranico per esporre il cervello e utilizzare una pinza smussata per rimuovere con cura il cervello dalla cavità cranica.
9. Immergere il cervello in una capsula di Petri contenente PBS ghiacciato e rimuovere eventuali residui di tessuto meningale.
   NOTA: Per preservare al meglio la vitalità cellulare, si consiglia di eseguire tutti i passaggi seguenti su ghiaccio o a 4 °C.
10. Mettere il cervello in un omogeneizzatore Dounce in vetro da 15 ml pre-raffreddato contenente 20 ml (cervello intero) o 12 ml (mezzo cervello) di tampone HBSS vecchio ghiaccio.
11. Usa il pestello Dounce sciolto per dissociare delicatamente e lentamente il tessuto cerebrale con circa 100-120 colpi di ghiaccio.
    NOTA: Questo passaggio è fondamentale per ottenere una grande quantità di cellule cerebrali sane. Questo passaggio dura circa 10 minuti. Interrompere l'omogeneizzazione quando non sono visibili pezzi sostanziali di tessuto cerebrale nella sospensione. A questo punto, il pestello può facilmente abbassarsi senza alcuna forza.
12. Filtrare la sospensione di tessuto cerebrale risultante attraverso un filtro cellulare da 70 μm in una provetta da centrifuga da 50 mL.
13. Sciacquare la provetta Dounce con 5 mL di HBSS e procedere con la filtrazione per massimizzare la raccolta cellulare.
14. Centrifugare la sospensione di tessuto filtrato a 550 x g per 6 minuti a 4 °C.
15. Rimuovere il surnatante utilizzando un aspiratore a vuoto e risospendere il pellet cellulare in 1 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%.
    NOTA: Per ottenere 15 mL di soluzione a gradiente di densità isotonica al 30%, miscelare 4,5 mL di terreno a gradiente di densità stock al 100%, 1,5 mL di 10× PBS e 9 mL di ddH₂O.
16. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL e aggiungere 9 mL (cervello intero) o 6 mL (mezzo cervello) di soluzione con gradiente di densità al 30%.
17. Capovolgere delicatamente il tubo per garantire una miscelazione accurata.
18. Centrifugare immediatamente la provetta a 845 x g con accelerazione e freno impostati al livello 3, per 20 min a 4 °C.
19. Rimuovere delicatamente la provetta dalla centrifuga senza agitare e aspirare con cura lo strato di mielina superiore utilizzando una punta da 1 ml collegata al vuoto.
    NOTA: È di fondamentale importanza non disturbare questo strato. La mielina residua può avere un impatto negativo sulla salute delle cellule e compromettere le analisi a valle.
20. Aspirare il surnatante, lasciando 1-2 mL, e risospendere il pellet cellulare con un minimo di 10 mL di HBSS freddo.
21. Centrifugare a 550 x g per 6 min a 4 °C.
22. Lavare ancora una volta con un minimo di 7 ml di HBSS freddo.
23. Rimuovere la maggior parte possibile del surnatante e risospendere le cellule per l'analisi della citometria a flusso utilizzando 100-200 μl di tampone per citometria a flusso.
    NOTA: Il tampone FACS per citometria a flusso utilizzato per questo studio contiene lo 0,5% di BSA e 2 mM di EDTA in 1× PBS. Si consiglia una piastra con fondo a V a 96 pozzetti per la colorazione delle cellule per ridurre al minimo la perdita di cellule durante le fasi di lavaggio.
24. Eseguire l'analisi della citometria a flusso utilizzando un protocollo standard stabilito nei singoli laboratori¹³.
    1. In breve, miscelare 80 μl di sospensione cellulare con 20 μl di miscela di anticorpi in una piastra con fondo a V a 96 pozzetti e incubare per 25 minuti a 4 °C.
    2. Lavare con 200 μl di tampone FACS e quindi risospendere le cellule con 100 μl di HBSS più reagente per la colorazione della vitalità cellulare.
    3. Dopo un'incubazione di 15 minuti a 4 °C, lavare con tampone FACS e risospendere le cellule in 200 μL di tampone FACS per l'analisi di citometria a flusso.

2. Preparazione di una sospensione unicellulare di midollo osseo da calvaria di topo

NOTA: La Figura 2 illustra la panoramica della procedura di isolamento del midollo osseo del cranio.

1. Perfondere il mouse come descritto nel passaggio 1.4.
2. Decapita il topo e fai un'incisione cutanea sulla linea mediana sul cuoio capelluto per esporre il cranio.
3. Tagliare il cranio, partendo dal forame magno e avanzando lungo i lati laterali della calvaria con forbici affilate. Quindi, sollevare e rimuovere la calvaria.
   NOTA: Il cervello può essere prelevato dallo stesso topo ed elaborato utilizzando la fase 1, consentendo l'analisi delle cellule immunitarie sia dal cervello che dal midollo osseo del cranio.
4. Staccare con cura la dura madre dal cranio al microscopio da dissezione utilizzando una pinza smussata.
   NOTA: È più facile iniziare dai bordi dell'osso occipitale, staccarsi lentamente e progredire costantemente verso l'area frontale, lavorando verso l'interno.
5. Mettere la calvaria nella pirofila con ghiaccio e sciacquare la calvaria con una pipetta da 1 ml, assicurandosi di rimuovere i residui di sangue dalla sua superficie.
6. Trasferire la calvaria in un nuovo piatto con PBS fresco e freddo sufficiente per immergere la calvaria.
7. Utilizzare forbici sterili per tagliare la calvaria in frammenti di circa 3 mm x 3 mm in PBS freddo.
   NOTA: I metodi di ritaglio possono influire sull'efficienza dell'estrazione del midollo osseo calvaria. Si consiglia di utilizzare lo stesso metodo di ritaglio per ridurre al minimo la variabilità. È anche importante tagliare le suture. La Figura 2B illustra un approccio.
8. Praticare un foro sul fondo di una provetta da microcentrifuga da 500 μL utilizzando un ago da 18 G.
9. Inserire questa provetta in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL contenente 20 μL di PBS freddo.
10. Trasferire i frammenti di calvaria nella provetta da 500 μl.
    NOTA: I frammenti ossei devono essere impacchettati in modo lasco per aumentare l'efficienza dell'estrazione.
11. Centrifugare a 10.000 x g per 30 s a 4 °C.
    NOTA: Per massimizzare il recupero cellulare, utilizzare un ago da 18 G per mescolare delicatamente i frammenti di calvaria e ripetere questo passaggio altre 1-2 volte.
12. Risospendere le cellule del midollo osseo di calvaria raccolte in 500 μL di tampone di lisi dei globuli rossi e incubare a temperatura ambiente per 30 s.
13. Trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 15 mL contenente 4 mL di PBS freddo.
14. Centrifugare a 400 x g per 6 min a 4 °C.
15. Lavare ancora una volta con 5 ml di PBS freddo.
16. Risospendere il pellet della cella in un tampone appropriato. Per la citometria a flusso, in genere utilizziamo 500 μL di tampone FACS.
17. Per l'analisi della citometria a flusso, eseguire il conteggio delle cellule e utilizzare circa 1 x 10⁶ cellule per la colorazione degli anticorpi.
    NOTA: Assicurarsi di includere il passaggio del blocco Fc prima della colorazione degli anticorpi¹³.

Risultati

Per preparare le cellule immunitarie dal tessuto cerebrale del topo, il protocollo produce generalmente cellule con un'elevata vitalità (84,1% ± 2,3% [media ± SD]). Circa il 70%-80% di queste cellule sono CD45 positive. Nel cervello di topo normale, quasi tutte le cellule CD45⁺ sono microglia (CD45^LowCD11b⁺), come previsto. Questo protocollo è stato utilizzato in laboratorio per varie applicazioni, tra cui l'analisi della citometria a flusso, la selezione cellulare attivata dalla fluo...

Discussione

Qui, vengono presentati due protocolli semplici ma efficaci per isolare le cellule immunitarie dal cervello e dal midollo osseo del cranio. Questi protocolli possono produrre in modo affidabile una grande quantità di cellule immunitarie vitali che possono essere adatte per diverse applicazioni a valle, in particolare per la citometria a flusso.

Per studiare la neuroinfiammazione in vari disturbi cerebrali, sono stati stabiliti molti protocolli per i preparati di cellule immunitarie dal cervel...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544