Fare Beyninden ve Kafatasından İmmün Hücrelerin İzole Edilmesi

Özet

Beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini araştırmak için yaygın bir yaklaşım, bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmektir. Burada, murin beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ve etkili protokol sağlanmıştır.

Özet

Artan kanıtlar, beyin bozukluklarının (örneğin, beyin iskemisi ve otoimmün ensefalomiyelit) tetiklediği bağışıklık tepkisinin sadece beyinde değil, aynı zamanda kafatasında da meydana geldiğini göstermektedir. Beyin hasarından sonra hem beyin hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücresi popülasyonlarındaki değişiklikleri analiz etmeye yönelik önemli bir adım (ör., felç), aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresi elde etmektir. Burada, bağışıklık hücrelerini beyinden ve kafatası kemik iliğinden izole etmek için optimize edilmiş iki protokol sağlanmıştır. Her iki protokolün avantajları, basitlikleri, hızları ve büyük miktarda canlı bağışıklık hücresi elde etmedeki etkinliklerine yansır. Bu hücreler, hücre sıralama, akış sitometrisi ve transkriptomik analiz gibi bir dizi aşağı akış uygulaması için uygun olabilir. Protokollerin etkinliğini göstermek için, akış sitometrisi analizi kullanılarak inme beyinleri ve normal beyin kafatası kemik iliği üzerinde immünofenotip deneyleri yapıldı ve sonuçlar yayınlanmış çalışmalardan elde edilen bulgularla uyumlu hale getirildi.

Giriş

Sinir sisteminin merkezi merkezi olan beyin, kafatası tarafından korunur. Kafatasının altında meninksler olarak bilinen üç bağ dokusu tabakası vardır - dura mater, araknoid mater ve pia mater. Beyin omurilik sıvısı (BOS), araknoid mater ve pia mater arasındaki subaraknoid boşlukta dolaşır, beyni yastıklar ve ayrıca glifatik sistem ^1,2 yoluyla atıkları uzaklaştırır. Birlikte, bu benzersiz mimari, beynin stabilitesini koruyan ve onu olası yaralanmalardan koruyan güvenli ve destekleyici bir ortam sağlar.

Beyin uzun zamandır bağışıklık ayrıcalığına sahip olarak kabul edildi. Bununla birlikte, artan kanıtlar, parankimdeki yerleşik mikrogliaya ek olarak, koroid pleksus ve meninksler de dahil olmak üzere beynin sınırlarının çok çeşitli bağışıklık hücrelerine ev sahipliği yaptığını gösterdiğinden, bu kavram kısmen terk edilmiştir³. Bu hücreler homeostazın korunmasında, beyin sağlığının izlenmesinde ve beyin hasarına karşı bağışıklık tepkisinin başlatılmasında kritik roller oynar. Özellikle, son bulgular kafatasının meninks bağışıklığında rol oynadığını ve yaralanma sonrası beyindeki bağışıklık tepkisine katkıda bulunabileceğini göstermektedir. 2018'de Herisson ve ark. kafatası kemik iliğini meninkslere bağlayan doğrudan vasküler kanalların ufuk açıcı bir keşfini yaptılar^ve böylece lökosit göçü için anatomik bir yol oluşturdular ^4,5. Daha sonra Cugurra ve ark. meninkslerdeki birçok miyeloid hücrenin (örneğin monositler ve nötrofiller) ve B hücrelerinin kandan kaynaklanmadığını göstermiştir⁶. Yazarlar, kalvaria kemik flebi nakli ve seçici ışınlama rejimleri gibi teknikleri kullanarak, kafatası kemik iliğinin, CNS yaralanmasından sonra CNS parankiminin yanı sıra meninkslerdeki miyeloid hücreler için lokal bir kaynak olarak hizmet ettiğine dair ikna edici kanıtlar sağladılar⁶. Ayrıca, başka bir çalışma, meningeal B hücrelerinin sürekli olarak kafatası kemik iliği⁷ tarafından sağlandığını öne sürdü. Daha yakın zamanlarda, araknoid manşet çıkışı (ACE) olarak adlandırılan yeni bir yapı, bağışıklık hücresi kaçakçılığı için dura mater ile beyin arasında doğrudan bir geçit olarak tanımlanmıştır⁸.

Bu heyecan verici bulgular, bağışıklık hücrelerinin yaralı beyne sızmasının kökeni için önemli etkilere sahiptir (örneğin, iskemik inme sonrası). Çok sayıda kanıt, felçten sonra birçok bağışıklık hücresinin beyne sızdığını ve hem akut beyin hasarına hem de kronik beyin iyileşmesine katkıda bulunduğunu göstermiştir. Geleneksel fikir, bu hücrelerin beyne sızan kanda dolaşan lökositler olduğudur ve bu da büyük ölçüde inme kaynaklı kan-beyin bariyeri hasarı ile kolaylaştırılır. Ancak, bu fikre meydan okundu. Bir çalışmada, kafatasındaki ve farelerin tibiasındaki bağışıklık hücreleri farklı şekilde etiketlendi ve inmeden 6 saat sonra, kafatasında nötrofillerde ve monositlerde önemli ölçüde daha büyük bir azalma bulundu. iskemik beyinde tibia ve daha fazla kafatası kaynaklı nötrofil mevcuttu. Bu veriler, akut inme fazında, iskemik beyindeki nötrofillerin esas olarak kafatası kemik iliğinden^{kaynaklandığını göstermektedir 4}. İlginç bir şekilde, CSF bu geçişe rehberlik edebilir. Gerçekten de, yakın tarihli iki rapor, BOS'un sinyal ipuçlarını beyinden kafatası kemik iliğine kafatası kanalları aracılığıyla doğrudan iletebildiğini ve CNS hasarından sonra kafatası kemik iliğinde hücre göçü ve hematopoez talimatı verebildiğini göstermiştir ^9,10.

Bu son bulguların ışığında, beyin bozukluklarına karşı bağışıklık tepkisini incelerken, hem beyindeki hem de kafatası kemik iliğindeki bağışıklık hücrelerindeki değişiklikleri analiz etmek önemli hale gelmiştir. Bu tür araştırmalarda, hücre sıralama, akış sitometrisi analizi ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) gibi aşağı akış analizleri için yeterli sayıda yüksek kaliteli bağışıklık hücresine ihtiyaç vardır. Burada genel amaç, beyin dokusu ve kafatası kemik iliğinden tek hücreli süspansiyonlar hazırlamak için optimize edilmiş iki prosedür sunmaktır. Kafatasının kalvaryasının (frontal kemik, oksipital kemik ve parietal kemikler) tipik olarak kemik iliğini çıkarmak için kullanıldığını ve bu kemik iliğinin bu çalışma boyunca özellikle kafatası kemik iliği olarak adlandırıldığını belirtmek önemlidir.

Protokol

Protokol, Duke Enstitüsü Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylandı. Bu çalışmada erkek C57Bl / 6 fareler (3-4 aylık; 22-28 g) kullanıldı. Reaktiflerin ve kullanılan ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Fare beyninden tek hücreli süspansiyon

NOT: Şekil 1 , beyin hücresi izolasyon protokolüne genel bakışı göstermektedir.

1. Daha önce gösterildiği gibi fareyi uyuşturun, entübe edin ve sabitleyin¹¹.
2. Deriden ve alttaki kas katmanlarından bir üst karın kesisi yapın ve göğüs boşluğuna açıklık oluşturmak için diyaframı ve kaburgaları dikkatlice kesin.
3. 30 mL'lik bir şırıngayı soğuk PBS ile doldurun ve silikon boru ile künt perfüzyon iğnesine takın. Perfüzyon iğnesini dikkatlice sol ventriküle yerleştirin.
4. Kan drenajına izin vermek için sağ atriyumda küçük bir çentik uygulayın ve ardından^{fareyi 12-3} dakika boyunca ~ 10 mL / dk akış hızında perfüze edin.
   NOT: Beyindeki kan klirensini iyileştirmek için perfüzyon solüsyonunun hacmini artırmak ve heparin eklemek düşünülebilir.
5. Farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için başın üst kısmındaki deriden orta hat kesisi yapın.
6. Künt forseps kullanarak kafatasının üzerindeki bağ dokusunu dikkatlice kazıyın.
7. Orta hat boyunca ve her iki taraftaki kafatası dikişlerini dikkatlice kesmek için keskin diseksiyon makası kullanın ve bir flep oluşturun.
8. Beyni ortaya çıkarmak için kafatası kanadını yavaşça kaldırın ve beyni kraniyal boşluktan dikkatlice çıkarmak için künt forseps kullanın.
9. Beyni buz gibi soğuk PBS içeren bir Petri kabına daldırın ve kalan meninks dokularını çıkarın.
   NOT: Hücre canlılığını daha iyi korumak için, aşağıdaki tüm adımların buz üzerinde veya 4 °C'de gerçekleştirilmesi önerilir.
10. Beyni, 20 mL (tam beyin) veya 12 mL (yarım beyin) buz gibi HBSS tamponu içeren önceden soğutulmuş 15 mL cam Dounce homojenizatöre yerleştirin.
11. Buz üzerinde yaklaşık 100-120 vuruşla beyin dokusunu nazikçe ve yavaşça ayırmak için gevşek Dounce havaneli kullanın.
    NOT: Bu adım, büyük miktarda sağlıklı beyin hücresi elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu işlem yaklaşık 10 dakika sürer. Süspansiyonda önemli beyin dokusu parçaları görünmediğinde homojenizasyonu durdurun. Bu noktada, havaneli herhangi bir kuvvet olmadan kolayca aşağı hareket edebilir.
12. Elde edilen beyin dokusu süspansiyonunu 50 mL'lik bir santrifüj tüpünde 70 μm'lik bir hücre süzgecinden süzün.
13. Dounce tüpünü 5 mL HBSS ile durulayın ve hücre toplanmasını en üst düzeye çıkarmak için filtrasyona devam edin.
14. Filtrelenmiş doku süspansiyonunu 550 x g'da 4 ° C'de 6 dakika boyunca santrifüjleyin.
15. Bir vakum aspiratörü kullanarak süpernatanı çıkarın ve hücre peletini 1 mL% 30 izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi içinde yeniden süspanse edin.
    NOT: 15 mL %30 izotonik yoğunluk gradyan çözeltisi yapmak için, 4.5 mL %100 stok yoğunluğu gradyan ortamı, 1.5 mL 10× PBS ve 9 mL ddH₂O karıştırın.
16. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın ve 9 mL (tam beyin) veya 6 mL (yarım beyin)% 30 yoğunluk gradyan çözeltisi ekleyin.
17. İyice karıştırmayı sağlamak için tüpü yavaşça ters çevirin.
18. Tüpü hızlanma ve fren seviye 3'teyken, 4 °C'de 20 dakika boyunca 845 x g'da hemen santrifüjleyin.
19. Tüpü sallamadan santrifüjden nazikçe çıkarın ve vakuma bağlı 1 mL'lik bir uç kullanarak üst miyelin tabakasını dikkatlice aspire edin.
    NOT: Bu katmanı rahatsız etmemek son derece önemlidir. Kalan herhangi bir miyelin, hücre sağlığını olumsuz yönde etkileyebilir ve aşağı akış analizlerini tehlikeye atabilir.
20. Süpernatanı aspire edin, 1-2 mL geride bırakın ve hücre peletini en az 10 mL soğuk HBSS ile yeniden süspanse edin.
21. 550 x g'da 4 ° C'de 6 dakika santrifüjleyin.
22. En az 7 mL soğuk HBSS ile bir kez daha yıkayın.
23. Süpernatantın mümkün olduğu kadar çoğunu çıkarın ve 100-200 μL akış sitometrisi tamponu kullanarak akış sitometrisi analizi için hücreleri yeniden askıya alın.
    NOT: Bu çalışma için kullanılan akış sitometrisi FACS tamponu, 1× PBS'de %0,5 BSA ve 2 mM EDTA içerir. Yıkama adımları sırasında hücre kaybını en aza indirmek için hücre boyama için 96 oyuklu bir V-alt plakası önerilir.
24. Bireysel laboratuvarlarda oluşturulan standart bir protokol kullanarak akış sitometrisi analizi yapın¹³.
    1. Kısaca, 80 μL hücre süspansiyonunu 20 μL antikor karışımı ile 96 oyuklu bir V-alt plakada karıştırın ve 4 ° C'de 25 dakika inkübe edin.
    2. 200 μL FACS tamponu ile yıkayın ve ardından hücreleri 100 μL HBSS artı hücre canlılığı boyama reaktifi ile yeniden süspanse edin.
    3. 4 ° C'de 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra, FACS tamponu ile yıkayın ve hücreleri akış sitometrisi analizi için 200 μL FACS tamponunda yeniden süspanse edin.

2. Fare kalvaryasından kemik iliği tek hücreli süspansiyonun hazırlanması

NOT: Şekil 2 , kafatası kemik iliği izolasyon prosedürüne genel bakışı göstermektedir.

1. Fareyi adım 1.4'te açıklandığı gibi perfüze edin.
2. Farenin kafasını kesin ve kafatasını ortaya çıkarmak için kafa derisinde orta hatta bir cilt kesisi yapın.
3. Foramen magnum'dan başlayarak ve keskin bir makas kullanarak kalvaria'nın yan tarafları boyunca ilerleyerek kafatasını kesin. Ardından, kalvaria'yı kaldırın ve çıkarın.
   NOT: Beyin aynı fareden alınabilir ve hem beyin hem de kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerinin analizini sağlayan adım 1 kullanılarak işlenebilir.
4. Künt forseps kullanarak diseksiyon mikroskobu altında dura materini kafatasından dikkatlice soyun.
   NOT: Oksipital kemiğin kenarlarından başlamak, yavaşça ayrılmak ve içe doğru çalışarak ön bölgeye doğru istikrarlı bir şekilde ilerlemek daha kolaydır.
5. Calvaria'yı buz üzerindeki tabağa koyun ve calvaria'yı durulamak için 1 mL'lik bir pipet kullanın, böylece yüzeyindeki kan kalıntılarının giderilmesini sağlayın.
6. Calvaria'yı, calvaria'yı daldırmaya yetecek kadar taze, soğuk PBS ile yeni bir tabağa aktarın.
7. Calvaria'yı soğuk PBS'de yaklaşık 3 mm x 3 mm'lik parçalar halinde kesmek için steril makas kullanın.
   NOT: Kırpma yöntemleri, kalvaria kemik iliği ekstraksiyonunun etkinliğini etkileyebilir. Değişkenliği en aza indirmek için aynı kırpma yönteminin kullanılması önerilir. Dikişlerin kesilerek açılması da önemlidir. Şekil 2B'de bir yaklaşım gösterilmektedir.
8. 18 G'lik bir iğne kullanarak 500 μL'lik bir mikrosantrifüj tüpünün dibine bir delik açın.
9. Bu tüpü 20 μL soğuk PBS içeren 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne yerleştirin.
10. Calvaria parçalarını 500 μL'lik tüpe aktarın.
    NOT: Ekstraksiyon verimliliğini artırmak için kemik parçaları gevşek bir şekilde paketlenmelidir.
11. 4 °C'de 30 saniye boyunca 10.000 x g'da santrifüjleyin.
    NOT: Hücre iyileşmesini en üst düzeye çıkarmak için, kalvaria parçalarını hafifçe karıştırmak için 18 G'lik bir iğne kullanın ve bu adımı 1-2 kez daha tekrarlayın.
12. Toplanan kalvaria kemik iliği hücrelerini 500 μL Kırmızı Kan Hücresi lizis tamponunda yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında 30 saniye inkübe edin.
13. Süspansiyonu 4 mL soğuk PBS içeren 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne aktarın.
14. 4 ° C'de 6 dakika boyunca 400 x g'da santrifüjleyin.
15. 5 mL soğuk PBS ile bir kez daha yıkayın.
16. Hücre peletini uygun bir tamponda yeniden süspanse edin. Akış sitometrisi için tipik olarak 500 μL FACS tamponu kullanırız.
17. Akış sitometrisi analizi için hücre sayımı yapın ve antikor boyaması için yaklaşık 1 x 10⁶ hücre kullanın.
    NOT: Antikor boyamadan önce Fc blok adımını^{eklediğinizden emin olun 13}.

Sonuçlar

Fare beyin dokusundan bağışıklık hücreleri hazırlamak için, protokol genellikle yüksek canlılığa sahip hücreler verir (% 84.1 ±% 2.3 [ortalama ± SD]). Bu hücrelerin yaklaşık %70-80'i CD45 pozitiftir. Normal fare beyninde, neredeyse tüm CD45 ⁺ hücreleri beklendiği gibi mikrogliadır (CD45^DüşükCD11b ⁺). Bu protokol, laboratuvarda akış sitometrisi analizi, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırma (FACS) ve scRNA-seq analizi dahil olmak üzere çeşitli uygul...

Tartışmalar

Burada, beyin ve kafatası kemik iliğinden bağışıklık hücrelerini izole etmek için iki basit ama etkili protokol sunulmaktadır. Bu protokoller, özellikle akış sitometrisi olmak üzere çeşitli aşağı akış uygulamaları için uygun olabilecek büyük miktarda canlı bağışıklık hücresini güvenilir bir şekilde verebilir.

Çeşitli beyin bozukluklarında nöroinflamasyonu incelemek için, beyinden bağışıklık hücresi preparatları için birçok protokol oluşturulmuş...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544