생쥐의 뇌와 두개골에서 면역 세포 분리

요약

뇌 질환에 대한 면역 반응을 조사하기 위한 한 가지 일반적인 접근법은 면역 세포의 변화를 분석하는 것입니다. 여기에서는 쥐 뇌 조직과 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 간단하고 효과적인 프로토콜이 제공됩니다.

초록

뇌 질환(예: 뇌 허혈 및 자가면역 뇌척수염)에 의해 유발되는 면역 반응이 뇌뿐만 아니라 두개골에서도 발생한다는 증거가 늘어나고 있습니다. 뇌 손상(예: 뇌졸중) 후 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포 집단의 변화를 분석하기 위한 핵심 단계는 다운스트림 분석을 위한 충분한 수의 고품질 면역 세포를 얻는 것입니다. 여기에서는 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 두 가지 최적화된 프로토콜이 제공됩니다. 두 프로토콜의 장점은 단순성, 속도 및 많은 양의 생존 가능한 면역 세포를 생성하는 효능에 반영됩니다. 이러한 세포는 세포 분류, 유세포 분석 및 전사체 분석과 같은 다양한 다운스트림 응용 분야에 적합할 수 있습니다. 프로토콜의 효과를 입증하기 위해 유세포 분석을 사용하여 뇌졸중 뇌와 정상 뇌 두개골 골수에 대해 면역표현형 분석을 수행했으며, 결과는 발표된 연구의 결과와 일치했습니다.

서문

신경계의 중심 허브인 뇌는 두개골에 의해 보호됩니다. 두개골 아래에는 수막으로 알려진 세 층의 결합 조직, 즉 경막(dura mater), 거미막(arachnoid mater) 및 피아 마터(pia mater)가 있습니다. 뇌척수액(CSF)은 지주막하(subarachnoid)와 지주막(pia mater) 사이의 지주막하 공간을 순환하며 뇌를 완충하고 림프계를 통해 노폐물을 제거합니다 ^1,2. 이 독특한 아키텍처는 뇌의 안정성을 유지하고 잠재적인 손상으로부터 뇌를 보호하는 안전하고 지원적인 환경을 제공합니다.

뇌는 오랫동안 면역 특권을 가진 것으로 여겨져 왔습니다. 그러나 실질에 상주하는 미세아교세포 외에도 맥락총(choroid plexus)과 수막(meninges)을 포함한 뇌의 경계가 다양한 면역 세포를 수용한다는 증거가 늘어나면서 이 개념은 부분적으로 포기되었습니다³. 이 세포는 항상성을 유지하고, 뇌 건강을 감시하며, 뇌 손상에 대한 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을 합니다. 특히 최근의 연구 결과에 따르면 두개골은 뇌수 면역에 관여하며 손상 후 뇌의 면역 반응에 기여할 수 있습니다. 2018년, Herisson et al.은 두개골 골수와 수막을 연결하는 직접 혈관 채널을 발견하여 백혈구 이동을 위한 해부학적 경로를 확립했습니다 ^4,5. 나중에, Cugurra et al.은 수막의 많은 골수성 세포(예: 단핵구 및 호중구)와 B 세포가 혈액에서 유래하지 않는다는 것을 입증했습니다⁶. 저자들은 calvaria bone-flap transplantation 및 selective irradiation 요법과 같은 기술을 사용하여 두개골 골수가 CNS 손상 후 CNS 실질뿐만 아니라 수막의 골수성 세포에 대한 국소 공급원 역할을 한다는 설득력 있는 증거를 제시했다⁶. 또한, 또 다른 연구에서는 수막 B 세포가 두개골 골수에 의해 지속적으로 공급된다고 제안했다⁷. 최근에는 거미막 출구(arachnoid cuff exit, ACE)라고 불리는 새로운 구조가 면역 세포 이동을 위한 경막과 뇌 사이의 직접 관문으로 확인되었다⁸.

이러한 흥미로운 발견은 면역 세포가 손상된 뇌에 침투하는 기원(예: 허혈성 뇌졸중 후)에 중요한 의미를 갖습니다. 뇌졸중 후 많은 면역 세포가 뇌에 침투하여 급성 뇌 손상과 만성 뇌 회복에 기여한다는 많은 증거가 있습니다. 일반적인 개념은 이러한 세포가 뇌에 침투하는 혈액 속의 순환 백혈구라는 것인데, 이는 주로 뇌졸중으로 인한 혈액-뇌 장벽 손상에 의해 촉진됩니다. 그러나 이 개념은 도전을 받고 있습니다. 한 연구에서 쥐의 두개골과 경골의 면역 세포는 다르게 표지되었으며, 뇌졸중 후 6 시간에는 두개골에서 호중구와 단핵구의 감소가 크게 발견되었습니다. 경골과 더 많은 두개골 유래 호중구가 허혈성 뇌에 존재했습니다. 이러한 데이터는 급성 뇌졸중 단계에서 허혈성 뇌의 호중구가 주로 두개골 골수에서 발생한다는 것을 시사한다⁴. 흥미롭게도 CSF가 이 마이그레이션을 안내할 수 있습니다. 실제로, 최근의 두 가지 보고에 따르면, 뇌척수액은 두개골 채널을 통해 뇌에서 두개골 골수로 신호 신호를 직접 전달할 수 있으며, 중추신경계 손상 후 두개골 골수에서 세포 이동과 조혈을 지시할 수 있습니다 ^9,10.

이러한 최근의 발견에 비추어 볼 때, 뇌 질환에 대한 면역 반응을 연구할 때 뇌와 두개골 골수의 면역 세포의 변화를 분석하는 것이 중요해졌습니다. 이러한 연구에서는 세포 분류, 유세포 분석 및 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq)과 같은 다운스트림 분석을 위해 충분한 수의 고품질 면역 세포가 필요합니다. 여기에서 전반적인 목표는 뇌 조직과 두개골 골수에서 단세포 현탁액을 준비하기 위한 두 가지 최적화된 절차를 제시하는 것입니다. 두개골의 종골(전두골, 후두골 및 두정골)은 일반적으로 골수를 추출하는 데 사용되며, 이 골수는 이 연구에서 특별히 두개골 골수라고 합니다.

프로토콜

이 프로토콜은 Duke Institute Animal Care and Use Committee(IACUC)의 승인을 받았습니다. 본 연구에서는 수컷 C57Bl/6마리 마우스(3-4개월령, 22-28g)를 사용하였다. 시약 및 사용된 장비에 대한 자세한 내용은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 쥐 두뇌에서 단세포 현탁액

참고: 그림 1 은 뇌세포 분리 프로토콜의 개요를 보여줍니다.

1. 앞에서 설명한 것처럼 마우스를 마취하고, 삽관하고, 고정합니다¹¹.
2. 피부와 아래 근육층을 통해 상복부를 절개하고 횡격막과 갈비뼈를 조심스럽게 절단하여 흉강으로 들어가는 구멍을 만듭니다.
3. 30mL 주사기에 차가운 PBS를 채우고 실리콘 튜브를 통해 뭉툭한 관류 바늘에 부착합니다. 관류 바늘을 좌심실에 조심스럽게 삽입합니다.
4. 혈액이 배출될 수 있도록 우심방에 작은 흠집을 낸 다음^12-1 분 동안 ~ 10mL/min의 유속으로 마우스를 관류합니다.
   알림: 뇌의 혈액 청소를 개선하기 위해 관류 용액의 양을 늘리고 헤파린을 추가하는 것을 고려할 수 있습니다.
5. 쥐의 목을 베고 머리 꼭대기의 피부를 통해 정중선을 절개하여 두개골을 노출시킵니다.
6. 뭉툭한 집게를 사용하여 두개골 위에 있는 결합 조직을 조심스럽게 긁어냅니다.
7. 날카로운 해부 가위를 사용하여 정중선과 양쪽의 두개골 봉합사를 조심스럽게 잘라 플랩을 만듭니다.
8. 두개골 플랩을 부드럽게 들어 올려 뇌를 노출시키고 뭉툭한 집게를 사용하여 두개강에서 뇌를 조심스럽게 제거합니다.
9. 얼음처럼 차가운 PBS가 들어 있는 페트리 접시에 뇌를 담그고 남아 있는 뇌수 조직을 제거합니다.
   알림: 세포 생존력을 더 잘 보존하려면 얼음 또는 4 °C에서 다음 단계를 모두 수행하는 것이 좋습니다.
10. 20mL(전뇌) 또는 12mL(반뇌)의 얼음 오래된 HBSS 완충액이 포함된 사전 냉각된 15mL 유리 Dounce 균질화기에 뇌를 넣습니다.
11. 느슨한 Dounce 유봉을 사용하여 얼음 위에서 약 100-120번의 스트로크로 뇌 조직을 부드럽고 천천히 해리시킵니다.
    참고: 이 단계는 건강한 뇌 세포를 대량으로 얻는 데 중요합니다. 이 단계는 약 10분 정도 걸립니다. 현탁액에서 실질적인 뇌 조직 덩어리가 보이지 않을 때 균질화를 중지합니다. 이 시점에서 유봉은 힘없이 쉽게 아래로 이동할 수 있습니다.
12. 50mL 원심분리 튜브의 70μm 세포 여과기를 통해 생성된 뇌 조직 현탁액을 여과합니다.
13. Dounce 튜브를 5mL HBSS로 헹구고 여과를 진행하여 세포 수집을 최대화합니다.
14. 여과된 조직 현탁액을 550 x g 에서 4°C에서 6분 동안 원심분리합니다.
15. 진공 흡입기를 사용하여 상층액을 제거하고 세포 펠릿을 1mL의 30% 등장 밀도 구배 용액에 재현탁시킵니다.
    참고: 15mL의 30% 등장 밀도 그래디언트 용액을 만들려면 4.5mL의 100% 스톡 밀도 그래디언트 배지, 1.5mL의 10× PBS 및 9mL의 ddH_2O를 혼합합니다.
16. 세포 현탁액을 15mL 원심분리 튜브에 옮기고 9mL(전뇌) 또는 6mL(반뇌)의 30% 밀도 그래디언트 용액을 추가합니다.
17. 철저한 혼합을 위해 튜브를 부드럽게 뒤집습니다.
18. 가속하고 브레이크를 레벨 3으로 설정한 상태에서 845 x g 에서 튜브를 즉시 원심분리하여 4°C에서 20분 동안 분리합니다.
19. 원심분리기에서 튜브를 흔들지 않고 부드럽게 제거하고 진공에 연결된 1mL 팁을 사용하여 상부 미엘린층을 조심스럽게 흡입합니다.
    참고: 이 레이어를 방해하지 않는 것이 매우 중요합니다. 남아 있는 미엘린은 세포 건강에 부정적인 영향을 미치고 다운스트림 분석을 손상시킬 수 있습니다.
20. 1-2mL를 남기고 상층액을 흡인하고 최소 10mL의 차가운 HBSS로 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
21. 550 x g 에서 4 °C에서 6분 동안 원심분리합니다.
22. 최소 7mL의 차가운 HBSS로 한 번 더 세척합니다.
23. 가능한 한 많은 상층액을 제거하고 100-200 μL의 유세포 분석 버퍼를 사용하여 유세포 분석을 위해 세포를 재현탁시킵니다.
    참고: 이 연구에 사용된 유세포 분석 FACS 완충액에는 1× PBS에 0.5% BSA 및 2mM EDTA가 포함되어 있습니다. 세척 단계 중 세포 손실을 최소화하기 위해 세포 염색을 위한 96웰 V-바닥 플레이트를 사용하는 것이 좋습니다.
24. 개별 실험실에서 확립된 표준 프로토콜을 사용하여 유세포 분석 수행¹³.
    1. 간단히 말해서, 80 μL의 세포 현탁액과 20 μL의 항체 혼합물을 96-웰 V-바닥 플레이트에 혼합하고 4 °C에서 25분 동안 배양합니다.
    2. 200 μL의 FACS 완충액으로 세척한 다음 100 μL의 HBSS plus cell viability 염색 시약으로 세포를 재현탁시킵니다.
    3. 4°C에서 15분 배양한 후 FACS 완충액으로 세척하고 유세포 분석을 위해 200μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁시킵니다.

2. 마우스 calvaria에서 골수 단세포 현탁액의 제조

참고: 그림 2 는 두개골 골수 분리 절차의 개요를 보여줍니다.

1. 1.4단계에서 설명한 대로 마우스를 관류합니다.
2. 쥐의 목을 베고 두피의 정중선 피부를 절개하여 두개골을 노출시킵니다.
3. 날카로운 가위를 사용하여 유공 매그넘에서 시작하여 두개골의 측면을 따라 앞으로 이동하여 두개골을 자릅니다. 그런 다음 종아리를 들어 올려 제거합니다.
   참고: 동일한 마우스에서 뇌를 채취하여 1단계를 사용하여 처리할 수 있으므로 뇌와 두개골 골수 모두에서 면역 세포를 분석할 수 있습니다.
4. 뭉툭한 집게를 사용하여 해부 현미경으로 두개골에서 경막을 조심스럽게 벗겨냅니다.
   참고: 후두골의 가장자리에서 시작하여 천천히 분리하고 안쪽으로 작업하면서 전두부를 향해 꾸준히 진행하는 것이 더 쉽습니다.
5. 얼음 위에 접시에 종아리를 놓고 1mL 피펫을 사용하여 종아리를 헹구어 표면에서 혈액 잔류물을 제거합니다.
6. calvaria를 담그기에 충분한 신선하고 차가운 PBS가 있는 새 접시로 calvaria를 옮깁니다.
7. 멸균 가위를 사용하여 차가운 PBS에서 calvaria를 약 3mm x 3mm 조각으로 자릅니다.
   참고: 자르기 방법은 calvaria 골수 추출의 효율성에 영향을 미칠 수 있습니다. 변동성을 최소화하기 위해 동일한 자르기 방법을 사용하는 것이 좋습니다. 봉합사를 잘라 내는 것도 중요합니다. 그림 2B 는 한 가지 접근 방식을 보여줍니다.
8. 500G 바늘을 사용하여 18μL 미세 원심분리기 튜브 바닥에 구멍을 뚫습니다.
9. 이 튜브를 20μL의 차가운 PBS가 들어 있는 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 삽입합니다.
10. calvaria 단편을 500 μL 튜브로 옮깁니다.
    참고: 뼈 조각은 추출 효율성을 높이기 위해 느슨하게 포장해야 합니다.
11. 10,000 x g 에서 4 °C에서 30초 동안 원심분리기.
    알림: 세포 회수를 최대화하려면 18G 바늘을 사용하여 종골 조각을 부드럽게 저어주고 이 단계를 1-2회 더 반복합니다.
12. 수집된 calvaria 골수 세포를 500μL의 적혈구 용해 완충액에 재현탁시키고 실온에서 30초 동안 배양합니다.
13. 현탁액을 4mL의 콜드 PBS가 들어 있는 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
14. 400 x g 에서 4 °C에서 6분 동안 원심분리기.
15. 콜드 PBS 5mL로 한 번 더 세척합니다.
16. 세포 펠릿을 적절한 완충액에 재현탁시킵니다. 유세포 분석의 경우 일반적으로 500μL의 FACS 완충액을 사용합니다.
17. 유세포 분석을 위해 세포 계수를 수행하고 항체 염색을 위해 약 1 x 10⁶ 세포를 사용합니다.
    참고: 항체 염색¹³ 전에 Fc 차단 단계를 포함해야 합니다.

결과

쥐의 뇌 조직으로부터 면역 세포를 준비하기 위해, 프로토콜은 일반적으로 생존율이 높은 세포를 생성합니다(84.1% ± 2.3%[평균 ± SD]). 이 세포의 약 70%-80%는 CD45 양성입니다. 정상적인 쥐의 뇌에서는 거의 모든 CD45⁺ 세포가 예상대로 미세아교세포(CD45^LowCD11b⁺)입니다. 이 프로토콜은 유세포 분석 분석, 형광 활성화 세포 분류(FACS) 및 scRNA-seq 분석을 포함한 다양한 응용 분야의 실...

토론

여기에서는 뇌와 두개골 골수에서 면역 세포를 분리하기 위한 간단하면서도 효과적인 두 가지 프로토콜을 제시합니다. 이러한 프로토콜은 다양한 다운스트림 응용 분야, 특히 유세포 분석에 적합할 수 있는 대량의 생존 가능한 면역 세포를 안정적으로 생성할 수 있습니다.

다양한 뇌 질환에서 신경 염증을 연구하기 위해 뇌에서 면역 세포 준비를 위한 많은 프로토콜이 수립?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544