Выделение иммунных клеток из мозга и черепа мыши

Резюме

Для изучения иммунного ответа на расстройства мозга одним из распространенных подходов является анализ изменений в иммунных клетках. Здесь представлены два простых и эффективных протокола для выделения иммунных клеток из ткани мозга мыши и костного мозга черепа.

Аннотация

Все больше данных указывает на то, что иммунный ответ, вызванный нарушениями работы мозга (например, ишемией мозга и аутоиммунным энцефаломиелитом), происходит не только в мозге, но и в черепе. Ключевым шагом на пути к анализу изменений в популяциях иммунных клеток как в головном мозге, так и в костном мозге черепа после повреждения головного мозга (например, инсульта) является получение достаточного количества высококачественных иммунных клеток для последующего анализа. В данном случае предлагаются два оптимизированных протокола для выделения иммунных клеток из головного мозга и костного мозга черепа. Преимущества обоих протоколов заключаются в их простоте, скорости и эффективности в получении большого количества жизнеспособных иммунных клеток. Эти клетки могут быть пригодны для ряда последующих применений, таких как сортировка клеток, проточная цитометрия и транскриптомный анализ. Чтобы продемонстрировать эффективность протоколов, были проведены эксперименты по иммунофенотипированию на головном мозге, перенесшем инсульт, и нормальном мозге, черепе, костном мозге с использованием анализа проточной цитометрии, и результаты согласуются с результатами опубликованных исследований.

Введение

Мозг, центральный узел нервной системы, защищен черепом. Под черепом находятся три слоя соединительной ткани, известные как мозговые оболочки - твердая мозговая оболочка, паутинная оболочка и мягкая мозговая оболочка. Спинномозговая жидкость (ликвор) циркулирует в субарахноидальном пространстве между паутинной оболочкой и мозговой оболочкой, смягчая работу мозга и выводя отходы через глимфатическую систему ^1,2. В совокупности эта уникальная архитектура обеспечивает безопасную и благоприятную среду, которая поддерживает стабильность мозга и защищает его от потенциальных травм.

Мозг долгое время считался иммунным привилегией. Тем не менее, эта идея была частично отвергнута, поскольку все больше доказательств указывают на то, что, в дополнение к резидентной микроглии в паренхиме, границы мозга, включая сосудистое сплетение и мозговые оболочки, содержат разнообразный набор иммунных^{клеток.} Эти клетки играют важнейшую роль в поддержании гомеостаза, наблюдении за здоровьем мозга и инициировании иммунного ответа на повреждение мозга. Примечательно, что последние результаты показывают, что череп участвует в иммунитете мозговых оболочек и может способствовать иммунному ответу в мозге после травмы. В 2018 году Herisson et al. сделали плодотворное открытие прямых сосудистых каналов, которые связывают костный мозг черепа с мозговыми оболочками, тем самым установив анатомический ^{маршрут миграции} лейкоцитов^. Позже Cugurra et al. продемонстрировали, что многие миелоидные клетки (например, моноциты и нейтрофилы) и В-клетки в мозговых оболочках происходят не^{из крови.} Используя такие методы, как трансплантация костного лоскута и селективные схемы облучения, авторы предоставили убедительные доказательства того, что костный мозг черепа служит местным источником миелоидных клеток в мозговых оболочках, а также паренхимы ЦНС после повреждения ЦНС^. Кроме того, в другом исследовании было высказано предположение, что менингеальные В-клетки постоянно снабжаются костным мозгом черепа⁷. Совсем недавно была идентифицирована новая структура, получившая название выход из паутинной манжеты (АПФ), как прямые ворота между твердой мозговой оболочкой и мозгом^{для транспортировки} иммунных клеток.

Эти захватывающие результаты имеют важное значение для происхождения инфильтрирующих иммунных клеток в поврежденный мозг (например, после ишемического инсульта). Большое количество доказательств указывает на то, что после инсульта многие иммунные клетки проникают в мозг, способствуя как острому повреждению мозга, так и его хроническому восстановлению. Общепринятое мнение заключается в том, что эти клетки являются циркулирующими лейкоцитами в крови, которые проникают в мозг, что в значительной степени облегчается повреждением гематоэнцефалического барьера, вызванным инсультом. Однако это представление было оспорено. В одном исследовании иммунные клетки в черепе и большеберцовой кости мышей были помечены по-разному, и через 6 ч после инсульта было обнаружено значительно большее снижение нейтрофилов и моноцитов в черепе по сравнению с . Большеберцовая кость и другие нейтрофилы, полученные из черепа, присутствовали в ишемизированном мозге. Эти данные свидетельствуют о том, что в фазе острого инсульта нейтрофилы в ишемизированном мозге в основном происходят из костного мозга черепа⁴. Интересно, что CSF может направлять эту миграцию. Действительно, два недавних исследования показали, что спинномозговая жидкость может напрямую передавать сигнальные сигналы от мозга в костный мозг черепа через каналы черепа, а также управлять миграцией клеток и кроветворением в костном мозге черепа после повреждения ^ЦНС.

В свете этих последних результатов стало важным анализировать изменения в иммунных клетках как в мозге, так и в костном мозге черепа при изучении иммунного ответа на нарушения в мозге. В таких исследованиях требуется достаточное количество высококачественных иммунных клеток для последующих анализов, таких как сортировка клеток, анализ проточной цитометрии и секвенирование РНК одиночных клеток (scRNA-seq). Общая цель состоит в том, чтобы представить две оптимизированные процедуры для получения суспензий одиночных клеток из ткани мозга и костного мозга черепа. Важно отметить, что кальвария (лобная кость, затылочная кость и теменные кости) черепа обычно используются для извлечения костного мозга, и этот костный мозг конкретно упоминается как костный мозг черепа на протяжении всего этого исследования.

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Дьюка. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 3-4 месяцев; 22-28 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Суспензия одиночных клеток из мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола выделения клеток головного мозга.

1. Обезболите, интубируйте и закрепите мышь, как было показано ранее¹¹.
2. Сделайте верхний надрез брюшной полости через кожу и нижележащие мышечные слои и осторожно прорежьте диафрагму и ребра, чтобы создать отверстие в грудную полость.
3. Наполните шприц объемом 30 мл холодной PBS и прикрепите его к тупой перфузионной игле с помощью силиконовой трубки. Осторожно введите перфузионную иглу в левый желудочек.
4. Сделайте небольшой надрез в правом предсердии, чтобы обеспечить отток крови, а затем перфузируйте^мышь со скоростью потока ~ 10 мл/мин в течение 3-4 минут.
   Примечание: Для улучшения выведения крови из крови в мозге можно рассмотреть увеличение объема перфузионного раствора и добавление гепарина.
5. Обезглавите мышь и сделайте разрез по средней линии кожи на макушке головы, чтобы обнажить череп.
6. Аккуратно соскребите любую соединительную ткань, лежащую над черепом, с помощью тупых щипцов.
7. С помощью острых ножниц для рассечения аккуратно прорежьте череп швами по средней линии и с обеих сторон, создавая лоскут.
8. Аккуратно поднимите лоскут черепа, чтобы обнажить мозг, и с помощью тупых щипцов осторожно удалите мозг из полости черепа.
9. Погрузите мозг в чашку Петри, содержащую ледяной PBS, и удалите все оставшиеся ткани мозговой оболочки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего сохранения жизнеспособности клеток рекомендуется выполнять все следующие действия на льду или при температуре 4 °C.
10. Поместите мозг в предварительно охлажденный стеклянный гомогенизатор Dounce объемом 15 мл, содержащий 20 мл (весь мозг) или 12 мл (половина мозга) ледяного буфера HBSS.
11. Используйте рассыпчатый пестик Dounce, чтобы мягко и медленно диссоциировать мозговую ткань примерно 100-120 ударами по льду.
    Примечание: Этот шаг имеет решающее значение для получения большого количества здоровых клеток мозга. Этот шаг занимает примерно 10 минут. Прекратите гомогенизацию, когда в суспензии не видно существенных фрагментов мозговой ткани. В этот момент пестик может легко сдвинуться вниз без какого-либо усилия.
12. Полученную суспензию мозговой ткани отфильтровать через клеточный фильтр 70 мкм в центрифужной пробирке объемом 50 мл.
13. Промойте пробирку Dounce 5 мл HBSS и продолжайте фильтрацию, чтобы максимально увеличить сбор клеток.
14. Центрифугируйте отфильтрованную тканевую суспензию при давлении 550 х г в течение 6 мин при 4 °С.
15. Удалите надосадочную жидкость с помощью вакуумного аспиратора и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 1 мл 30% изотонического раствора градиента плотности.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 15 мл 30% раствора изотонического градиента плотности, смешайте 4,5 мл 100% среды с градиентом плотности, 1,5 мл 10× PBS и 9 мл ddH₂O.
16. Перенесите клеточную суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл и добавьте 9 мл (весь мозг) или 6 мл (половина мозга) 30% раствора градиента плотности.
17. Аккуратно переверните трубку, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
18. Немедленно центрифугируйте трубку при давлении 845 x g с ускорением и тормозом, установленным на уровне 3, в течение 20 минут при 4 °C.
19. Аккуратно извлеките пробирку из центрифуги, не встряхивая, и осторожно отсасывайте верхний слой миелина с помощью наконечника объемом 1 мл, подключенного к вакууму.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не потревожить этот слой. Любой оставшийся миелин может негативно повлиять на здоровье клеток и поставить под угрозу последующие анализы.
20. Аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя 1-2 мл после нее, и повторно суспендируйте клеточную гранулу минимум 10 мл холодного HBSS.
21. Центрифугируйте при 550 x g в течение 6 мин при 4 °C.
22. Промойте еще один раз минимум 7 мл холодного HBSS.
23. Удалите как можно больше надосадочной жидкости и повторно суспендируйте клетки для анализа проточной цитометрии, используя 100-200 мкл буфера для проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер FACS для проточной цитометрии, используемый в этом исследовании, содержит 0,5% БСА и 2 мМ ЭДТА в 1× PBS. Для минимизации потерь клеток на этапах промывки рекомендуется использовать 96-луночную пластину с V-образным дном для окрашивания клеток.
24. Выполнение анализа проточной цитометрии с использованием стандартного протокола, установленного в отдельных лабораториях¹³.
    1. Кратко смешайте 80 мкл клеточной суспензии с 20 мкл смеси антител в 96-луночном V-образном планшете и инкубируйте в течение 25 мин при 4 °С.
    2. Промойте 200 мкл буфера FACS, а затем повторно суспендируйте клетки 100 мкл HBSS плюс реагент для окрашивания жизнеспособности клеток.
    3. После 15-минутной инкубации при 4 °C промыть с помощью буфера FACS и повторно суспендировать клетки в 200 мкл буфера FACS для анализа проточной цитометрии.

2. Приготовление одноклеточной суспензии костного мозга из кальварии мышей

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 2 представлен обзор процедуры выделения костного мозга черепа.

1. Выполните конфузию мыши, как описано в шаге 1.4.
2. Обезглавите мышь и сделайте разрез кожи по средней линии на волосистой части головы, чтобы обнажить череп.
3. Разрежьте череп насквозь, начиная от большого затылочного отверстия и двигаясь вперед по боковым сторонам кальварии с помощью острых ножниц. Затем поднимите и снимите кальварию.
   Примечание: Мозг может быть собран у той же мыши и обработан с использованием шага 1, что позволяет анализировать иммунные клетки как из мозга, так и из костного мозга черепа.
4. Осторожно отклейте твердую мозговую оболочку от черепа под препарирующим микроскопом с помощью тупых щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Легче начинать с краев затылочной кости, медленно отделяться и неуклонно продвигаться к лобной области, двигаясь внутрь.
5. Поместите кальварию в посуду на лед и с помощью пипетки объемом 1 мл промойте кальварию, обеспечив удаление остатков крови с ее поверхности.
6. Переложите кальварию в новое блюдо со свежей, холодной PBS, достаточной для погружения кальварии.
7. С помощью стерильных ножниц разрежьте кальварию на фрагменты размером примерно 3 мм х 3 мм в холодном PBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Методы обрезки могут повлиять на эффективность экстракции костного мозга из кальварии. Рекомендуется использовать один и тот же метод обрезки, чтобы свести к минимуму изменчивость. Также важно разрезать швы. На рисунке 2B показан один из подходов.
8. Проделайте отверстие в дне микроцентрифужной пробирки объемом 500 мкл с помощью иглы 18 G.
9. Вставьте эту пробирку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл холодной PBS.
10. Перенесите фрагменты кальварии в пробирку объемом 500 μл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Костные фрагменты должны быть неплотно упакованы для повышения эффективности экстракции.
11. Центрифуга при давлении 10 000 x g в течение 30 с при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы максимизировать восстановление клеток, используйте иглу 18 G, чтобы аккуратно перемешать фрагменты кальварии, и повторите этот шаг еще 1-2 раза.
12. Ресуспендируйте собранные клетки костного мозга кальварии в 500 мкл буфера для лизиса эритроцитов и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 с.
13. Перенесите суспензию в центрифужную пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл холодного PBS.
14. Центрифугируйте при 400 x g в течение 6 мин при 4 °C.
15. Умойтесь еще раз 5 мл холодной PBS.
16. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в соответствующем буфере. Для проточной цитометрии мы обычно используем 500 мкл буфера FACS.
17. Для анализа проточной цитометрии выполните подсчет клеток и используйте примерно 1 x 10⁶ клеток для окрашивания антителами.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно включите этап блокировки Fc перед окрашиванием антител¹³.

Результаты

Для получения иммунных клеток из ткани мозга мыши протокол обычно дает клетки с высокой жизнеспособностью (84,1% ± 2,3% [среднее ± SD]). Примерно 70-80% этих клеток являются CD45-положительными. В нормальном мозге мышей почти все клетки CD45⁺ представляют собой микроглию (CD45^LowCD11b⁺), к?...

Обсуждение

Здесь представлены два простых, но эффективных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и костного мозга черепа. Эти протоколы могут надежно получать большое количество жизнеспособных иммунных клеток, которые могут быть пригодны для различных последующих применений, в частно...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubes	VWR	76332-068
15 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle	BD Biosciences	305195
1x HBSS	Gibco	14175-095
50 mL conical tubes	Thermo Fisher Scientific	339653
96-well V-bottom microplate	SARSTEDT	82.1583
AURORA  flow cytometer	Cytek bioscience
BSA	Fisher	BP9706-100
CD11b-AF594	BioLegend	101254	1:500 dilution
CD19-BV785	BioLegend	115543	1:500 dilution
CD19-FITC	BioLegend	115506	1:500 dilution
CD3-APC	BioLegend	100312	1:500 dilution
CD3-PE	BioLegend	100206	1:500 dilution
CD45-Alex 700	BioLegend	103128	1:500 dilution
CD45-BV421	Biolegend	103133	1:500 dilution
Cell Strainer 70 um	Avantor	732-2758
Dressing Forceps	V. Mueller	NL1410
EDTA	Invitrogen	15575-038
Fc Block	Biolegend	101320	1:100 dilution
Forceps	Roboz	RS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher Scientific	N7167	1:500 dilution
Ly6G-BV421	BioLegend	127628	1:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5	BioLegend	127615	1:500 dilution
NK1.1-APC-cy7	BioLegend	108723	1:500 dilution
Percoll (density gradient medium)	Cytiva	17089101
Phosphate buffer saline (10x)	Gibco	70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)	BioLegend	420302
Scissors	SKLAR	64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size	DWK Life Sciences	357544