Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Для изучения иммунного ответа на расстройства мозга одним из распространенных подходов является анализ изменений в иммунных клетках. Здесь представлены два простых и эффективных протокола для выделения иммунных клеток из ткани мозга мыши и костного мозга черепа.

Аннотация

Все больше данных указывает на то, что иммунный ответ, вызванный нарушениями работы мозга (например, ишемией мозга и аутоиммунным энцефаломиелитом), происходит не только в мозге, но и в черепе. Ключевым шагом на пути к анализу изменений в популяциях иммунных клеток как в головном мозге, так и в костном мозге черепа после повреждения головного мозга (например, инсульта) является получение достаточного количества высококачественных иммунных клеток для последующего анализа. В данном случае предлагаются два оптимизированных протокола для выделения иммунных клеток из головного мозга и костного мозга черепа. Преимущества обоих протоколов заключаются в их простоте, скорости и эффективности в получении большого количества жизнеспособных иммунных клеток. Эти клетки могут быть пригодны для ряда последующих применений, таких как сортировка клеток, проточная цитометрия и транскриптомный анализ. Чтобы продемонстрировать эффективность протоколов, были проведены эксперименты по иммунофенотипированию на головном мозге, перенесшем инсульт, и нормальном мозге, черепе, костном мозге с использованием анализа проточной цитометрии, и результаты согласуются с результатами опубликованных исследований.

Введение

Мозг, центральный узел нервной системы, защищен черепом. Под черепом находятся три слоя соединительной ткани, известные как мозговые оболочки - твердая мозговая оболочка, паутинная оболочка и мягкая мозговая оболочка. Спинномозговая жидкость (ликвор) циркулирует в субарахноидальном пространстве между паутинной оболочкой и мозговой оболочкой, смягчая работу мозга и выводя отходы через глимфатическую систему 1,2. В совокупности эта уникальная архитектура обеспечивает безопасную и благоприятную среду, которая поддерживает стабильность мозга и защищает его от потенциальных травм.

Мозг д....

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Института Дьюка. В данном исследовании использовались самцы мышей C57Bl/6 (в возрасте 3-4 месяцев; 22-28 г). Подробная информация об используемых реагентах и оборудовании приведена в Таблице материалов.

1. Суспензия одиночных клеток из мозга мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 представлен обзор протокола выделения клеток головного мозга.

  1. Обезболите, интубируйте и закрепите мышь, как было показано ранее11.
  2. Сделайте верхний надрез брюшн....

Результаты

Для получения иммунных клеток из ткани мозга мыши протокол обычно дает клетки с высокой жизнеспособностью (84,1% ± 2,3% [среднее ± SD]). Примерно 70-80% этих клеток являются CD45-положительными. В нормальном мозге мышей почти все клетки CD45+ представляют собой микроглию (CD45LowCD11b+), к?.......

Обсуждение

Здесь представлены два простых, но эффективных протокола для выделения иммунных клеток из мозга и костного мозга черепа. Эти протоколы могут надежно получать большое количество жизнеспособных иммунных клеток, которые могут быть пригодны для различных последующих применений, в частно.......

Раскрытие информации

Никакой.

Благодарности

Мы благодарим Кэти Гейдж за ее замечательный редакторский вклад. Иллюстративные рисунки были созданы с помощью BioRender.com. Это исследование было поддержано средствами отделения анестезиологии (Медицинский центр Университета Дьюка) и грантами NIH NS099590, HL157354 и NS127163.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-066
1.5 mL microcentrifuge tubesVWR76332-068
15 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339651
18 G x 1 in BD PrecisionGlide NeedleBD Biosciences305195
1x HBSSGibco14175-095
50 mL conical tubesThermo Fisher Scientific339653
96-well V-bottom microplate SARSTEDT82.1583
AURORA  flow cytometerCytek bioscience
BSAFisherBP9706-100
CD11b-AF594BioLegend1012541:500 dilution
CD19-BV785BioLegend1155431:500 dilution
CD19-FITCBioLegend1155061:500 dilution
CD3-APCBioLegend1003121:500 dilution
CD3-PEBioLegend1002061:500 dilution
CD45-Alex 700BioLegend1031281:500 dilution
CD45-BV421Biolegend1031331:500 dilution
Cell Strainer 70 umAvantor732-2758
Dressing Forceps V. MuellerNL1410
EDTAInvitrogen15575-038
Fc BlockBiolegend1013201:100 dilution
ForcepsRobozRS-5047
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain KitThermo Fisher ScientificN71671:500 dilution
Ly6G-BV421BioLegend1276281:500 dilution
Ly6G-PerCp-cy5.5BioLegend1276151:500 dilution
NK1.1-APC-cy7BioLegend1087231:500 dilution
Percoll (density gradient medium)Cytiva17089101
Phosphate buffer saline (10x)Gibco70011-044
RBC Lysis Buffer (10x)BioLegend420302
ScissorsSKLAR64-1250
WHEATON Dounce Tissue, 15 mL SizeDWK Life Sciences357544

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены