Sistema para la lesión focal y cerrada del sistema nervioso central

Resumen

Este protocolo describe un sistema de aire de sobrepresión personalizado diseñado para inducir lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado en ratones, incluidos traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. El objetivo de este protocolo es proporcionar un marco para que los investigadores adapten y amplíen fácilmente el sistema para sus estudios únicos de trauma en el SNC.

Resumen

La prevalencia de lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado subraya la necesidad de una mayor comprensión de estos traumas para mejorar las intervenciones protectoras y terapéuticas. Cruciales para esta investigación son los modelos animales que replican lesiones del SNC de sistema cerrado. En este contexto, se diseñó un sistema de aire de sobrepresión personalizado para reproducir una serie de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos, incluidos los traumatismos oculares, cerebrales y de la médula espinal. Hasta la fecha, el sistema se ha utilizado para administrar aire de sobrepresión dirigido a los ojos, la cabeza o la columna vertebral para modelar la lesión del polo anteroposterior en el ojo, la neuropatía óptica traumática indirecta (ITON), la lesión cerebral traumática focal y la lesión de la médula espinal. Este documento proporciona un protocolo detallado que describe el diseño y la operación del sistema y comparte resultados representativos que demuestran su efectividad. El marco sólido que se presenta aquí proporciona una base sólida para la investigación en curso sobre el trauma del SNC. Al aprovechar los atributos flexibles del sistema, los investigadores pueden modificar y controlar cuidadosamente la ubicación, la gravedad y el momento de las lesiones. Esto permite comparaciones exhaustivas de los mecanismos moleculares y la eficacia terapéutica en múltiples lesiones del SNC de sistema cerrado.

Introducción

Las lesiones del sistema nervioso central (SNC) de sistema cerrado son lesiones causadas por daños en el cerebro o la médula espinal sin causar una ruptura en el cráneo o la columna vertebral. Estas lesiones incluyen lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés) y lesiones de la médula espinal (SCI, por sus siglas en inglés) y pueden ocurrir por una variedad de incidentes, incluidas lesiones por fuerza contundente (por ejemplo, caídas, lesiones deportivas, accidentes automovilísticos) y explosiones explosivas. Las lesiones del SNC de sistema cerrado generalmente se consideran menos graves en comparación con las lesiones penetrantes del SNC, sin embargo, ocurren con más frecuencia. Sin embargo, al igual que las lesiones penetrantes, las lesiones del SNC de sistema cerrado pueden provocar problemas de salud progresivos y a largo plazo, especialmente después de repetidas ocurrencias 1,2,3,4,5,6. De manera preocupante, la evidencia emergente sugiere que incluso las lesiones subclínicas del SNC de sistema cerrado, que caen por debajo de los criterios diagnósticos para un TCE o una lesión de la médula espinal después de una sola ocurrencia ^{7,8,9,10,11,12,13}, pueden evolucionar a enfermedades neurodegenerativas crónicas después de lesiones repetidas ^6,14,15,16. Esto pone de relieve la urgente necesidad de comprender mejor los mecanismos y las consecuencias de las lesiones únicas y repetidas del SNC en régimen cerrado y reiterado.  Este conocimiento es imprescindible para mejorar los enfoques protectores y terapéuticos. Cruciales para este esfuerzo son los modelos animales que replican lesiones del SNC de sistema cerrado.

Los modelos animales actuales de lesiones del SNC en sistema cerrado han sido fundamentales para avanzar en nuestra comprensión de la fisiopatología y las posibles intervenciones protectoras y terapéuticas para estos traumatismos. Los roedores son particularmente populares debido a su bajo costo, disponibilidad, manipulabilidad genética, facilidad de manejo, ensayos conductuales y fisiológicos bien establecidos, y consideraciones éticas más favorables¹⁷. Los métodos comunes para inducir un traumatismo craneoencefálico de sistema cerrado en roedores incluyen dispositivos de caída de peso^18,19, dispositivos de impacto cortical controlado (CCI)²⁰ y tubos de choque impulsados por aire de compresión²¹. En el caso de la LME, los modelos de traumatismo cerrado suelen requerir laminectomía^22,23 u otras técnicas quirúrgicas²⁴ para acceder directamente a la médula espinal o al espacio epidural. Sin embargo, se han desarrollado modelos de lesiones por explosiones de SCI de cuerpo cerrado utilizando tubos de choque accionados por aire de compresión ²⁵. A pesar de proporcionar información valiosa, cada uno de estos modelos tiene limitaciones únicas. Los modelos de caída de peso pueden tener una alta variabilidad y un control limitado de la localización y la gravedad de la lesión, lo que genera preocupaciones experimentales y éticas por causar lesiones graves e incontroladas²⁶. Los dispositivos CCI ofrecen precisión, pero requieren entrenamiento para operar, pueden implicar una craneotomía y pueden sufrir una variabilidad mecánica que afecta la reproducibilidad²⁷. Los tubos de choque son generalmente menos invasivos, pero pueden ser difíciles de adquirir, complejos de instalar y operar, y pueden crear condiciones de lesión poco realistas y muy variables debido a factores ambientales, reflejos de ondas e interacciones de presión complejas²⁸.

Para estudiar mejor los mecanismos y efectos de las lesiones únicas y repetidas del SNC en sistema cerrado y sus tratamientos, este artículo presenta un método modular, fácil de usar, rentable y no invasivo. El objetivo principal de este enfoque es permitir un control preciso y una modificación flexible de los parámetros de la lesión, incluida la ubicación, la gravedad y el momento. Para respaldar este objetivo, este manuscrito proporciona un protocolo detallado para construir, calibrar y solucionar problemas de un sistema de aire a sobrepresión, que aborda algunas de las limitaciones de los dispositivos de lesión del SNC de sistema cerrado existentes. Este sistema no solo ofrece rentabilidad y un tiempo de configuración mínimo, sino que es muy versátil, ya que proporciona resultados consistentes y reproducibles, al tiempo que minimiza las preocupaciones éticas y maximiza la relevancia clínica. Además, se describe la capacidad del sistema para producir una gama de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos, junto con sus posibles aplicaciones en estudios futuros. En particular, el objetivo de este manuscrito es proporcionar un marco que permita a los investigadores adquirir, adaptar y expandir fácilmente este sistema para sus necesidades específicas, promoviendo así la investigación en curso sobre el trauma del SNC. También se presentan resultados representativos que demuestran la eficacia del sistema en la inducción de trauma axonal.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron bajo los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) 29,30,31,32 de la Universidad de Vanderbilt y bajo las pautas de la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) y la Asociación para la Investigación en Visión y Oftalmología (ARVO). Todos los ratones fueron alojados en grupos y mantenidos en un ciclo de luz/oscuridad de 12 h y se les proporcionó alimento y agua ad libitum. En este protocolo se utilizaron ratones 30,31,33 C57 Bl/6 de tres meses de edad.

1. Construcción del sistema

1. Obtenga una pistola de paintball disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales) que tenga un regulador de presión de aire integrado.
2. Modifique el cañón (Figura 1A) si es necesario.
   1. Si el cañón original está fenestrado con aberturas o perforaciones a lo largo de su longitud, el aire comprimido puede fugarse y disiparse en el aire, reduciendo el nivel máximo de presión de salida. Reemplácelo comprando un barril sólido no fenestrado para aumentar el rango de presión de salida (Figura 1, I).
   2. Si el cañón original es largo y engorroso, recórtalo comprando un cañón más corto de longitud personalizada o usando un cortatubos o una sierra.
   3. Si el cañón original no produce el nivel de presión de salida deseado, modifique el diámetro interior (tamaño del ánima) del cañón comprando un cañón con un diámetro de ánima personalizado. La disminución del diámetro del tamaño del orificio original aumentará el rango de presión de salida, y viceversa.
3. Modifique el regulador (Figura 1B) si es necesario.
   1. Retire la tapa guía para proporcionar acceso directo al tornillo de ajuste (Figura 1, II) si el regulador original viene con una tapa guía.
   2. Cambie el tornillo de cabeza hueca Allen por un tornillo de cabeza hueca de cabeza plana si el tornillo de ajuste original viene con una cabeza hueca Allen.
4. Retire el cargador de alimentación por gravedad estándar (es decir, el depósito para sostener y alimentar bolas de pintura en la pistola) y selle el tubo de alimentación vertical (Figura 1, III) para evitar fugas de presión.
   1. Asegúrese de que la pistola de paintball esté descargada y que la fuente de aire (CO₂ o tanque de aire comprimido) esté desconectada antes de retirar el cargador de alimentación por gravedad.
   2. Ubique el cuello de alimentación (Figura 1C) donde está conectado el cargador de alimentación por gravedad. Afloje la abrazadera del cuello de alimentación con la herramienta adecuada.
   3. Retire el cargador de alimentación por gravedad estándar tirando de él hacia arriba.
   4. Inserte una tapa o tapón para sellar la abertura. Por lo general, están disponibles en tiendas de paintball o en línea y están diseñados para encajar perfectamente en el cuello de alimentación, sellándolo.
5. Ensamble una plataforma (Figura 1D) para la pistola de paintball y una mesa de posicionamiento de animales x-y.
   1. Construya la base de la plataforma cortando dos piezas de tablero de fibra de densidad media.
      NOTA: Dependiendo de la disponibilidad y preferencia del material, también se pueden emplear materiales alternativos (por ejemplo, madera contrachapada).
   2. Corta una pieza cuadrada más pequeña para que mida 1.5 x 1.5 pies.
   3. Corta una pieza rectangular más grande para que mida 2.5 x 1.5 pies.
   4. Eleve y asegure la plataforma más pequeña 3.5 pulgadas por encima de la plataforma más grande usando dos dos segundos paralelos de 2 x 4.
6. Asegura la pistola de paintball modificada a la plataforma.
   1. Coloque la pistola de paintball de lado en la plataforma más pequeña para que el extremo del cañón se extienda media pulgada sobre el borde.
   2. Asegure la pistola de paintball usando soportes de montaje o abrazaderas que se ajusten al cañón y la culata de la pistola de paintball.
   3. Conecte un tanque de aire presurizado (Figura 1E; consulte la Tabla de materiales) al regulador de la pistola de paintball. Alternativamente, conecte una línea de presión directa desde un tanque de nitrógeno comprimido para aumentar el rango de niveles de presión de salida confiables.
   4. Si usa un tanque de aire presurizado, asegúrelo al tablero de fibra con una correa de tela duradera. Fije la correa con tornillos o pernos e incluya un mecanismo de ajuste para facilitar el apriete y aflojamiento.
7. Asegure una mesa de posicionamiento x-y a la pieza más grande de tablero de fibra rectangular opuesta al cañón de la pistola de paintball con tornillos o pernos (Figura 1F).
   NOTA: Una mesa de posicionamiento x-y (consulte la Tabla de materiales), también conocida como etapa x-y, se puede comprar de varios proveedores, incluidos minoristas en línea, proveedores industriales y proveedores de equipos científicos. A la hora de comprar una mesa de posicionamiento x-y, tenga en cuenta el rango de recorrido, la capacidad de carga, la precisión y la posibilidad de elegir entre el ajuste manual o el control motorizado. Esta mesa de posicionamiento x-y permitirá un movimiento y posicionamiento precisos del animal a lo largo de dos ejes: el eje x (horizontalmente hacia o lejos del cañón) y el eje y (verticalmente hacia arriba o hacia abajo del cañón).
8. Modifique la mesa de posicionamiento x-y instalando tres abrazaderas de PVC.
   1. Asegure dos abrazaderas de PVC de 1 cm de grosor a cada lado de la parte delantera del cañón con tornillos o pernos. Asegúrese de que las abrazaderas sean lo suficientemente anchas para acomodar el soporte del animal de los pasos 1.9 y 1.10 (por ejemplo, 1.5 pulgadas).
   2. Asegure una abrazadera de PVC más gruesa (4 cm) perpendicular y opuesta a las dos abrazaderas de 1 cm de grosor con tornillos o pernos. Asegúrese de que la abrazadera sea lo suficientemente ancha para acomodar el transductor de presión del paso 2.4 (por ejemplo, 1.5 pulgadas).
   3. Taladre dos orificios en la parte superior de la tercera abrazadera e inserte dos tornillos de plástico para una estabilización adicional del transductor de presión durante la calibración del sistema en el Paso 2.
9. Personalice el interior del soporte para animales (Figura 2A).
   1. Compre y corte un trozo de tubo de PVC (35 mm de diámetro exterior, 26 mm de diámetro interior, 6,75 pulgadas de largo) para la cámara de contención interior del ratón.
   2. Crea un agujero de forma rectangular (3 x 5 cm) a 1 pulgada del extremo del tubo para exponer la cabeza y los hombros traseros superiores del ratón mientras el resto del cuerpo permanece protegido.
      NOTA: Si el sitio de la lesión del SNC está más abajo en la espalda del ratón (por ejemplo, la columna torácica o lumbar), haga el orificio rectangular más grande.
10. Personalice el exterior del soporte para animales (Figura 2B).
    1. Compre y corte un trozo de tubo de PVC (44 mm de diámetro exterior, 35 mm de diámetro interior, 6 pulgadas de largo) para la cámara de contención exterior del ratón.
    2. Construya una abertura de exposición (Figura 2C) dentro de la cámara de contención exterior para un control preciso del sitio de la lesión del SNC.
    3. Cree una apertura recíproca en el lado opuesto para insertar el cilindro del transductor de presión durante la calibración del sistema en el Paso 2 (por ejemplo, un orificio de 9 mm).
11. Modifique el exterior del soporte del animal para acomodar la administración de anestesia gaseosa. Si en su lugar se va a utilizar un anestésico inyectable, omita este paso.
    1. Selle un extremo del exterior del soporte para animales con cinta adhesiva. Asegúrese de que esté bien ajustado para evitar fugas de gas.
    2. Cree un pequeño orificio en el sello para insertar la vía de anestesia.
    3. Coloque la línea de anestesia para introducir isoflurano en el entorno del tubo sin contacto directo con el animal.

2. Calibración del sistema

1. Conecte un transductor de presión (Figura 2D; consulte la Tabla de materiales para conocer las opciones) a un sistema de adquisición de datos (DAQ) y a una computadora para traducir las lecturas de presión física en datos digitales.
   1. Conecte el transductor de presión al módulo DAQ (consulte la tabla de materiales), lo que garantiza la polaridad adecuada y las conexiones seguras.
   2. Inserte el módulo DAQ en un chasis DAQ (consulte la Tabla de materiales) para permitir que reciba energía y se comunique con la computadora.
   3. Utilice un cable USB para conectar el chasis DAQ al ordenador.
   4. Asegúrese de que el equipo tenga instalados el software y los controladores necesarios para interactuar con el hardware DAQ y adquirir datos (consulte la Tabla de materiales para conocer las opciones).
2. Configure los ajustes del sistema DAQ.
   1. Abra el software DAQ instalado.
   2. Asegúrese de que el equipo reconozca el sistema DAQ.
   3. Consulte las hojas de datos de especificaciones y calibración para su módulo/chasis DAQ y transductor de presión específicos y configure los ajustes del sistema DAQ:
      NOTA: La configuración de DAQ para el hardware de DAQ utilizado en este manuscrito está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Entrada analógica: Seleccione el canal de entrada física en el módulo DAQ donde está conectado el transductor de presión.
      2. Fuente de excitación (fuente Vex): Especifique la fuente de excitación del módulo DAQ (por ejemplo, interna o externa).
      3. Voltaje de excitación (valor Vex): Establezca el valor vex en el valor especificado por el fabricante del transductor de presión (por ejemplo, 5 o 10 V).
      4. Tipo de puente: elija el tipo de puente adecuado de su módulo DAQ (por ejemplo, puente completo, medio puente o cuarto de puente).
      5. Resistencia del puente: Ajuste la resistencia del puente al valor especificado por el fabricante del transductor de presión (por ejemplo, 350 ).
      6. Factor de calibración/Escalado personalizado: Configure el escalado en función de la hoja de datos de calibración proporcionada por el fabricante del transductor de presión. El fabricante calibra el transductor de presión aplicando una unidad física conocida (psi) y midiendo las unidades eléctricas resultantes (mV/V). Cree una curva de calibración trazando las unidades físicas conocidas frente a las unidades eléctricas obtenidas.
      7. Frecuencia de muestreo (Hz): Establezca la frecuencia de muestreo lo suficientemente alta como para capturar la dinámica de los cambios de presión sin aliasing (por ejemplo, 1 o 10 kHz dependiendo de la velocidad de los cambios de presión en su experimento).
         NOTA: Cuanto más estrecha sea la forma de onda del aire de sobrepresión (es decir, cuanto más rápidamente cambie la presión), más amplio será el rango de frecuencia que excitará y, por lo tanto, mayor debe ser la frecuencia de muestreo. Esto es especialmente importante en experimentos con modelos de lesiones del SNC, donde los cambios de presión pueden ocurrir rápidamente.
3. Cree una herramienta digital en el software DAQ para la adquisición de datos.
   NOTA: Esta herramienta digital se utilizará para medir, registrar, mostrar y analizar con precisión las presiones de salida del sistema. La herramienta digital utilizada en este manuscrito está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Implemente algoritmos de procesamiento de señales para filtrar, amplificar o procesar los datos sin procesar del transductor.
   2. Agregue herramientas de análisis para calcular métricas como la presión máxima, la presión promedio y la duración de los eventos de presión.
   3. Incorpore elementos visuales (por ejemplo, gráficos) para mostrar datos de presión en tiempo real y elementos de control para iniciar, detener y restablecer la adquisición de datos.
   4. Guarde la herramienta digital.
4. Medir la presión de salida del sistema
   1. Inserte el transductor de presión en la abrazadera gruesa de la mesa x-y y su barril a través del orificio del soporte para animales (creado en el paso 1.10.3).
   2. Ajuste el cilindro del transductor de presión hasta que la punta esté precisamente en la ubicación del sitio de la lesión del SNC.
   3. Asegure el transductor de presión con dos tornillos de plástico (instalados en el paso 1.8.3).
5. Ejecute la herramienta digital en el software de adquisición de datos mientras suelta el gatillo de la pistola de paintball para capturar, analizar y visualizar la presión de salida del sistema.
6. Ajuste el tornillo de ajuste hasta que la presión de salida del sistema alcance el nivel deseado.
   NOTA: Después de modificar el cañón de la pistola de paintball para que no esté fenestrado, de 1,5 pulgadas de largo y 6,5 mm de diámetro, el sistema es capaz de entregar de manera confiable niveles de aire a sobrepresión en el rango de 15-50 psi a 5 mm desde la parte delantera del cañón³⁴. Los niveles de aire a sobrepresión por debajo de 15 psi y por encima de 50 psi exhiben una gran variabilidad en intensidad. Para una visualización completa de la presión de salida del sistema (psi) en función de la presión de entrada (psi), la distancia desde el cañón (cm) y el tiempo (ms), consulte la Figura 2 de Hines-Beard et al.34. Utilice nitrógeno comprimido en lugar de aire comprimido para obtener de forma fiable niveles de aire a sobrepresión superiores a 50 psi utilizando este sistema.

3. Preparación de los animales y exposición al aire a sobrepresión

1. Anestesiar al ratón con isoflurano en una cámara de inducción con 1,5-3%30,31,32,33 de isoflurano en oxígeno hasta que esté completamente sedado.
   1. Confirmar la anestesia evaluando la ausencia de respuesta a un pinzamiento del dedo del pie.
   2. Asegure el ratón en el soporte interior del animal con la cabeza y los hombros traseros superiores expuestos a través de la abertura rectangular, mientras que el dorso y las extremidades traseras inferiores permanecen protegidos.
   3. Apoye la cabeza del ratón con un cojín fijado al segmento inferior intacto del soporte interior del animal.
   4. Asegure el ratón aplicando cinta quirúrgica en la parte superior de los hombros traseros.
   5. Inserte el soporte interior para animales en el soporte exterior para animales.
   6. Abra la línea de anestesia secundaria para la administración de isoflurano dentro del soporte del animal.
   7. Coloque un cojín adicional en el extremo del soporte para animales para evitar que el anestésico se escape del tubo y para evitar que el ratón se mueva durante la exposición al aire a sobrepresión.
2. Suministro de aire a sobrepresión
   1. Alinee la apertura circular de 4 mm del soporte exterior para animales directamente sobre el ojo izquierdo del ratón.
   2. Coloque el soporte para animales usando las perillas de control en la mesa x-y de modo que su apertura se alinee con el cañón de la pistola de paintball y la superficie externa esté a 5 mm del extremo del cañón.
      NOTA: Ajuste la distancia del animal desde el extremo del cañón para cambiar el nivel de aire a sobrepresión (psi) y la forma. Mueva al animal más lejos del cañón para reducir el nivel de aire de sobrepresión y crear una onda de aire de sobrepresión más difusa.
   3. Inicie la secuencia de aire a sobrepresión para inducir ITON:
      1. Administre dos ráfagas de aire de sobrepresión de 15 psi a un intervalo de 0,5 s repetidas diariamente durante 3 días 29,30,31,32.
         NOTA: Se puede inducir un ITON similar mediante la entrega de tres ráfagas consecutivas de aire de sobrepresión de 15 psi separadas por intervalos de 0,5 s²³. El grado de ITON que resulta después de la entrega de seis ráfagas consecutivas de aire de sobrepresión de 15 psi separadas por intervalos de 0,5 s se muestra aquí en Resultados representativos.
      2. Exponga a los ratones falsos al ruido del aire de sobrepresión, pero no al aire de sobrepresión en sí, girando el soporte del animal para que la abertura ya no mire hacia el cañón y bloquee el aire con un escudo de cartón.
3. Recuperación del ratón
   1. Deje que los ratones se recuperen de la anestesia.
      1. Administre gotas lubricantes para los ojos (consulte la Tabla de materiales) para evitar que los ojos se sequen con la anestesia.
      2. Proporcione calor utilizando un soporte de calefacción controlada (ver Tabla de Materiales).
   2. Vigila visualmente a los ratones hasta que mantengan una postura erguida y caminen normalmente. Permíteles estar en compañía de sus compañeros de jaula.
   3. Proporcione a todos los ratones expuestos al aire a sobrepresión alimentos de recuperación en gel (consulte la Tabla de materiales) durante los primeros 3 días después de la lesión para evitar la pérdida de peso.

4. Recolección y procesamiento de tejidos

1. Eutanasia de los ratones mediante inyección intraperitoneal de la solución de trabajo Avertin.
   1. Prepare Avertin Stock mezclando 10 g de 2,2,2,-tribromoetanol (ver Tabla de Materiales) con 10 mL de 1-Pentanol (ver Tabla de Materiales). Conservar en la oscuridad a 4 °C.
   2. Prepare la solución de trabajo de Avertin combinando 1,25 mL de caldo de Avertina, 45 mL de agua destilada doble y 5 mL de PBS 10x (consulte la Tabla de materiales) en un tubo de 50 mL. Filtre, esterilice la mezcla y almacene en la oscuridad a 4 °C.
2. Perfundir transcárdicamente a los ratones con paraformaldehído al 4% (ver Tabla de Materiales) en 1x PBS (ver Tabla de Materiales).
3. Enuclear el ojo expuesto a aire a sobrepresión utilizando pinzas finas (ver Tabla de Materiales) y tijeras (ver Tabla de Materiales), asegurando la preservación del nervio óptico (ON).
4. Recoja el ON junto con el tejido ocular enucleado para su posterior análisis.
5. Osmicado ON tejido.
   1. Postfix ON tejido durante la noche en 4% de paraformaldehído y 2% de glutaraldehído (ver Tabla de Materiales) en 1x PBS. Si trabaja con tejido que no se perfundió (como en el paso 4.2), coloque el sufijo durante 5 días en lugar de toda la noche.
   2. Transfiera el pañuelo ON a una placa de 12 o 24 pocillos (consulte la Tabla de materiales) con 1x PBS usando un pincel (consulte la Tabla de materiales) o un palo de madera afilado.
   3. En una campana extractora, reemplace 1xPBS con tetróxido de osmio al 2% (consulte la tabla de materiales) en un tampón de cacodilato de 0,2 M (la receta está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) utilizando una pipeta de transferencia. Incubar en hielo durante 2 h.
   4. Realiza tres lavados con 1x PBS
      1. Deseche los desechos de osmio de manera adecuada.
      2. Deje la placa en la campana extractora durante dos noches después del tercer lavado con PBS.
6. Deshidrate el tejido ON en una serie de etanol graduado.
   1. Transfiera los nervios a una nueva placa con etanol al 50% e incube durante 30 min.
   2. Reemplace con etanol al 70% durante 30 min.
   3. Reemplace con etanol al 95% durante 30 min.
   4. Reemplace con etanol 100% durante 30 min.
7. Incrustar tejido ON en epon.
   NOTA: La receta de Epon está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; consulte la Tabla de materiales para los materiales enumerados en la receta.
   1. Día 1: Transfiera el tejido a un vial de 2 mL con óxido de propileno (ver Tabla de Materiales)/Etanol 100% (1:1) y agite durante 30 min a temperatura ambiente. Reemplácelo con óxido de propileno puro y agite durante 15 minutos, repitiendo una vez. Reemplácelo con óxido de propileno/epón (1:1) y agite durante la noche en la cámara frigorífica.
   2. Día 2: Transfiera el tejido a una placa de 12 o 24 pocillos con epón 100% y agite durante 4 h a temperatura ambiente. Reemplácelo con epón fresco 100% e incube durante la noche a temperatura ambiente en el vacío.
   3. Día 3: Repetir la incubación del epón como en el día 2.
   4. Día 4: Transfiera el tejido a un molde plano con 100% epon, reoriente el tejido y colóquelo en un horno a 60 °C durante 48 h.
8. Sección SOBRE tejido.
   1. Recorte los moldes debajo de un telescopio de disección en una pirámide doble con el nervio en el centro.
   2. Recoja secciones transversales de 700 nm de espesor utilizando un ultramicrótomo y un cuchillo de diamante (consulte la tabla de materiales).
   3. Recoja secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio blanco cargados con agua destilada.
   4. Secar los portaobjetos en un horno a 60 °C hasta que el agua se evapore. Enfriar a temperatura ambiente.
9. Tiñe el pañuelo ON.
   1. Sumerja los portaobjetos en parafenilendiamina (PPD) al 1% (consulte la tabla de materiales) en una mezcla 1:1 de metanol y 2-propanol durante 28 minutos.
   2. Enjuague los portaobjetos en dos mezclas consecutivas de metanol 1:1 (ver Tabla de Materiales) y 2-propanol (ver Tabla de Materiales) durante 1 minuto cada una.
   3. Enjuague los portaobjetos en etanol 100% durante 1 minuto y deje secar al aire.
   4. Coloque los portaobjetos en una caja húmeda y cubra las secciones con azul de toluidina al 1% (consulte la Tabla de materiales) con una pipeta de transferencia.
   5. Incubar en horno a 60 °C durante 20 min.
   6. Enjuague los portaobjetos con agua destilada doble y déjelos secar al aire.
10. Montaje y creación de imágenes en el tejido.
    1. Portaobjetos de cubreobjetos utilizando medios de montaje (consulte la Tabla de métodos), eliminando el exceso de medios.
    2. Deje que los portaobjetos se sequen durante la noche.
    3. Imágenes de secciones transversales mediante microscopía de campo claro con un objetivo de inmersión en aceite de 100x.
11. Incrustar, seccionar y teñir inmunohistoquímicamente el tejido de la retina.
    1. Postfix tejido ocular entero en paraformaldehído al 4% durante 2-4 h.
    2. Crioproteger todo el tejido ocular con sacarosa al 30% (ver Tabla de Materiales en 1x PBS durante la noche a 4 °C.
    3. Incruste el tejido ocular en un medio de congelación (consulte la tabla de materiales).
    4. Recoja secciones transversales de retina de 10 μm de espesor en un criostato y monte las secciones en portaobjetos de microscopio de vidrio blanco cargados (consulte la tabla de materiales).
    5. Lave los portaobjetos en 1x PBS e incube en un tampón de bloqueo (5% de Triton X-100 y 2% de albúmina sérica bovina (BSA) (ver Tabla de Materiales) en 1x PBS) con 5% de suero de burro normal (NDS) (ver Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 30 min.
    6. Incubar portaobjetos durante la noche a 4 °C (o a temperatura ambiente durante 4 h) en anticuerpo primario (ver Tabla de Materiales) en Triton X-100 al 0,5% (ver Tabla de Materiales) en 1xPBS (PBT).
    7. Lave los portaobjetos en PBT e incube en anticuerpo secundario (ver tabla de materiales) en tampón de bloqueo con NDS al 5%.
    8. Lave los portaobjetos en PBT, aplique medio de montaje con DAPI (consulte la Tabla de materiales), cubreobjetos y selle con esmalte de uñas.
    9. Portaobjetos de imagen en un microscopio de epifluorescencia.
    10. Si cuantifica la intensidad de la fluorescencia, asegúrese de que las imágenes se tomen de la misma región de la retina con ajustes idénticos de aumento, ganancia y exposición.
12. Cuente con los axones.
    1. Cuente manualmente el número de axones utilizando un software de análisis de imágenes (consulte la Tabla de materiales) muestreando el 20% del área total de la sección transversal del nervio utilizando una superposición de cuadrícula fija para estimar la densidad de axones (axones/mm²).
    2. Mida el área de la sección transversal ON.
       1. Utilice la función Establecer escala para establecer píxeles/micras para el objetivo utilizado para obtener la imagen.
       2. Utilice la herramienta Selección de polígono para trazar a lo largo de la vaina de mielina del nervio óptico, excluyendo la vasculatura.
       3. Mida el área del ON utilizando la función Medir .
       4. Determine el 20% del área total multiplicando el área medida por 0,2.
    3. Superponga la rejilla fija en la sección transversal ON.
       1. Descargue el plug-in Counting Array.
          NOTA: Este complemento está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Abra el plug-in Counting Array para superponer una cuadrícula fija sobre la sección transversal, que consta de 9 cuadrados espaciados uniformemente en forma de signo más.
       3. Edite el área por cada una de las 9 regiones dividiendo el 20% del área total de la sección transversal ON (calculada en el paso 4.6.2.4) por 9.
       4. Centre la rejilla fija de modo que el centro del signo más esté centrado en el centro de la sección transversal ON.
    4. Cuente los axones vivos y en degeneración por separado.
       1. Descargue y abra el plug-in Cell Counter.
          NOTA: Este complemento está disponible públicamente en GitHub. Los lectores interesados pueden acceder al repositorio en https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Para cada una de las 9 regiones, cuente el número de perfiles de axones vivos y en degeneración por separado visualizando la condición de la vaina de mielina. Asegúrese de que la cuantificación de los axones se realice mientras se está ciego al grupo experimental del animal para evitar sesgos.
       3. En el caso de los axones vivos, busque aquellos en los que la vaina de mielina aparezca intacta, teñida uniformemente y rodeada suave y uniformemente alrededor del axón.
       4. En el caso de los axones en degeneración, busque aquellos con un engrosamiento, encebollamiento o colapso de la vaina de mielina.
       5. Si el axón está parcialmente cortado por la rejilla superpuesta, inclúyalo solo en el recuento de axones si se ve el lumen.
       6. Asegúrese de que los axones oblongos no se cuenten accidentalmente más de una vez, y no confunda los residuos o el polvo con un perfil de axones en degeneración.
    5. Realizar análisis estadísticos para comprobar las diferencias significativas en el recuento medio de axones entre los grupos. Asegúrese de incluir un mínimo de cuatro ON en cada grupo para tener en cuenta la variabilidad normal observada en análisis anteriores.
       1. Realizar una prueba t de muestras independientes (también conocida como prueba t de Student para muestras independientes) para evaluar si hay diferencias significativas entre las medias de dos grupos independientes.
       2. Realizar la alternativa no paramétrica, la prueba U de Mann-Whitney, si no se pueden cumplir las condiciones para una prueba t de muestras independientes (es decir, si los datos no se distribuyen normalmente o los tamaños de muestra son demasiado pequeños).

Discusión

Este sistema de aire de sobrepresión personalizado es una herramienta útil para estudiar las lesiones del SNC del sistema cerrado en modelos murinos. Los resultados representativos del experimento de ejemplo demuestran que el suministro focal de aire a sobrepresión utilizando este sistema puede inducir eficazmente la ITON, lo que resulta en una pérdida y degeneración significativa de los axones. Esto pone de manifiesto la capacidad del sistema para producir lesiones precisas y reproducibles en el SNC.

Una de las principales fortalezas de este sistema es su capacidad de personalización para inducir una variedad de lesiones del SNC. La gravedad de la lesión se puede ajustar modificando la presión de salida general del sistema, la distancia del animal desde el extremo del cañón utilizando la etapa de posicionamiento x-y, el tamaño y la forma de la apertura de exposición, el número de exposiciones al aire a sobrepresión y el intervalo entre exposiciones. Además, la ubicación de la lesión del SNC se puede ajustar modificando la ubicación de la apertura de exposición dentro del soporte del animal. Esta versatilidad ha permitido que el sistema produzca un espectro de lesiones del SNC de sistema cerrado en modelos murinos. Inicialmente, el sistema se utilizó para modelar lesiones de globo cerrado, centrándose en el daño de los polos anterior y posterior y los déficits relacionados^34,36, incluidos los impactos de la respuesta del sistema inmunitario³⁷, los resultados específicos de la tensión³⁸ y la eficacia de los agentes neuroprotectores³⁹. Eventualmente, esta aplicación se amplió para evaluar las secuelas de las exposiciones repetidas dirigidas a los ojos para modelar la neuropatía óptica traumática indirecta (ITON)³⁰ y explorar el efecto del número y el intervalo entre exposiciones repetidas³³. Desde entonces, la aplicación del sistema se ha expandido para modelar la lesión cerebral traumática leve (mTBI) de cabeza cerrada a través de exposiciones dirigidas a la cabeza^40,41 y la lesión de la médula espinal de cuerpo cerrado (SCI) a través de exposiciones dirigidas al dorso⁴², lo que enfatiza la adaptabilidad y versatilidad del dispositivo en el estudio de diversos dominios de lesiones del SNC.

Al utilizar este sistema, es fundamental tomar medidas para minimizar la variabilidad en los resultados de las lesiones para garantizar la reproducibilidad y la fiabilidad de los resultados experimentales. Las medidas clave incluyen la calibración de los niveles de presión de salida del sistema antes y después de cada serie de tres exposiciones para garantizar un suministro de presión constante. Aunque la variabilidad es baja cuando el sistema se opera entre 15 psi y 50 psi cuando se usa aire comprimido³⁴, la calibración constante ayuda a detectar errores inesperados, como batería baja o aire bajo. Además, coloque cada animal a la misma distancia del extremo del cañón para garantizar una magnitud de sobrepresión constante, ya que la intensidad de la onda de presión disminuye con la distancia. La posición uniforme también garantiza que cada animal se vea afectado por la misma parte de la onda de radio. Además, la fijación uniforme de los animales dentro del soporte garantiza que el tejido de interés se dirija de forma coherente, especialmente en modelos de exposición repetida cuando existe riesgo de movimiento. Por último, la uniformidad en la edad, el sexo y los antecedentes genéticos de los animales es crucial, ya que estos factores influyen en la respuesta a las lesiones. Por ejemplo, estudios anteriores que utilizaron este sistema compararon los efectos de la sobrepresión del aire dirigido a los ojos en diferentes cepas de ratones, destacando diferencias significativas en la respuesta a las lesiones entre los ratones C57Bl/6J³⁶, DBA/2J³⁷ y Balb/c³⁸ . Los ratones DBA/2J y Balb/c mostraron patologías del polo anterior más severas, mayor daño retiniano, mayor estrés oxidativo y respuestas neuroinflamatorias más pronunciadas en comparación con los ratones C57Bl/6J con ratones Balb/c que mostraron perfiles de lesiones particularmente robustos y duraderos³⁸.

Solución de problemas del sistema
Si los valores de presión son inusualmente bajos para una configuración de manómetro determinada, apriete el gatillo 5-10 veces, permitiendo que el aire pase a través del sistema y que el regulador se ajuste a una nueva configuración. No debe haber fugas en el tanque de aire. La junta tórica del tanque de aire no debe estar dañada ni desgastada, el tanque de aire debe tener suficiente aire y la batería del arma no debe agotarse. La mesa x-y no debe haberse desplazado de su posición habitual desde el extremo del cañón y la apertura de exposición al aire a sobrepresión debe estar alineada con el cañón del arma y no ocluyéndola. El regulador debe estar firmemente asegurado a la empuñadura de la pistola. Si los valores de presión son demasiado bajos a pesar de usar la configuración más alta en el manómetro, el manómetro no debe aumentarse más allá de 200 psi y la configuración de velocidad de la pistola debe ajustarse a la configuración máxima. Si los ajustes de presión son inconsistentes (por ejemplo, alta y luego baja), asegúrese de que el tanque de aire tenga suficiente aire, que el regulador esté bien asegurado a la empuñadura de la pistola, que no haya fugas en el tanque de aire y que esté bien atornillado, y que la junta tórica del tanque de aire no esté dañada ni desgastada.

Para comprender de manera integral todas las capacidades de este sistema, es importante reconocer sus limitaciones. Imitar escenarios del mundo real en un entorno de laboratorio sigue siendo un desafío. Aunque este sistema genera aire a sobrepresión, no replica la compleja dinámica de un evento explosivo, como los gradientes variables de presión y temperatura, la presencia de escombros y ondas reflejadas, y una naturaleza multifásica. Además, no imita una forma de onda de Friedlander ("onda expansiva primaria"), que se caracteriza por un pico agudo y casi instantáneo de presión seguido de un rápido decaimiento exponencial que cae por debajo de la presión ambiental antes de volver a la línea de base⁴³. Más bien, la forma de onda producida por este sistema representa un perfil más simple y simétrico en el que hay un aumento y una disminución más graduales de la presión sin una fase negativa distinta (ver Figura 2C en Hines-Beard et ^al.34). De manera algo ventajosa, esta forma de onda combina elementos de lesiones por explosión y contundentes. El "pulso de presión" en forma de campana proporciona un impacto de sobrepresión constante, similar a una "pared de aire" que golpea al sujeto. Sin embargo, la sobrepresión de aire suministrada por la onda también es un aspecto característico clave de las lesiones por explosión. Algunos pueden argumentar que, si bien esta forma de onda incluye aspectos de ambos tipos de lesiones, no capta completamente la complejidad de ninguno de ellos. Sin embargo, este "pulso de presión" consistente y reproducible es ideal para experimentos controlados en un entorno de laboratorio para estudiar la lesión focal del SNC en sistema cerrado. Hemos demostrado la naturaleza focal de la lesión anteriormente. Por ejemplo, la exposición a un ojo no causa daño al epitelio nasal primario ni al cerebro⁴⁴. Además, cuando se dirige hacia el lado de la cabeza del ratón, una pequeña área del cerebro se ve afectada⁴⁵. Finalmente, la energía del aire a sobrepresión de este sistema al nivel de presión utilizado para ITON no afectó al ratón a menos que se repitiera con un corto intervalo de tiempo³³. Por lo tanto, la presión no es perjudicial y, por lo tanto, no replica la fuerza del extremo del chorro. Además, incluso con la exposición repetida del aire a la sobrepresión del ojo, no hubo ningún efecto sobre las estructuras anteriores del ojo³³. La degeneración significativa del nervio óptico y la pérdida de visión solo ocurrieron con la exposición repetida con un intervalo entre exposiciones de menos de 1 min³³.

En comparación con otros dispositivos de laboratorio para crear lesiones del SNC en sistemas cerrados, este sistema ofrece beneficios únicos. Puede emitir ráfagas secuenciales de aire a sobrepresión en rápida sucesión (intervalos de 0,5 s)³³, imitando las condiciones en entornos laborales de alto riesgo donde las exposiciones rápidas a explosiones son un peligro común. Por ejemplo, el personal militar, tanto en escenarios de entrenamiento como de combate, utiliza una gran cantidad de armas de fuego automáticas capaces de disparar rápidamente y repetidas, incluidos rifles automáticos (por ejemplo, M16, AK-47), ametralladoras (por ejemplo, M2 calibre .50), ametralladoras Gatling y ametralladoras. Otras armas más lentas pero repetitivas utilizadas por el personal militar incluyen artillería, morteros, granadas y dispositivos explosivos improvisados (IED). Los trabajadores de demolición que participan en la demolición controlada y los mineros que participan en operaciones de voladura para romper la roca y extraer minerales también experimentan voladuras secuenciales en rápida sucesión. Por último, los trabajadores de la construcción que utilizan herramientas neumáticas, martinetes u otros equipos pesados que generan poderosas fuerzas de percusión pueden experimentar impactos rápidos y repetidos que imitan la exposición a las explosiones. En particular, el suministro rápido de aire a sobrepresión no es posible con dispositivos como los tubos de choque que requieren una reconfiguración extensa o una represurización entre cada evento. Los tubos de choque usan diafragmas que estallan para generar ondas de choque, y después de cada ráfaga, el diafragma debe ser reemplazado. Este proceso lleva tiempo, ya que se debe abrir el tubo de choque, quitar el diafragma gastado, instalar un nuevo diafragma y darle tiempo al sistema para reiniciar y represurizar. Por lo tanto, especialmente para los estudios que investigan la lesión del SNC después de una exposición rápida y repetida a explosiones, es ideal un sistema que no requiera una reconfiguración extensa o una nueva presurización entre cada evento.

Las aplicaciones futuras de este sistema modulador, fácil de usar y rentable son prometedoras. Aprovechando sus atributos adaptables y únicos, este sistema abre varias vías prometedoras para futuros estudios terapéuticos preclínicos. Su capacidad para emitir ráfagas rápidas y secuenciales de aire a sobrepresión puede aprovecharse para estudiar los efectos acumulativos de las exposiciones repetidas a explosiones, lo que es relevante para comprender la encefalopatía traumática crónica y otras afecciones neurodegenerativas a largo plazo. Además, este sistema se puede utilizar para explorar la eficacia de diversas intervenciones farmacológicas destinadas a mitigar las lesiones del SNC de sistema cerrado, incluido el momento y la dosificación de los fármacos neuroprotectores para determinar las ventanas de tratamiento óptimas. Además, la precisión del sistema en la imitación de aspectos de los mecanismos de lesiones tanto contundentes como por explosión permite el desarrollo de modelos de lesiones integrales que reflejan el trauma complejo experimentado por las personas en escenarios del mundo real. Esto puede facilitar la prueba de terapias multimodales que aborden aspectos globales comunes de las lesiones, como la inflamación, el estrés oxidativo y la muerte neuronal. En general, este dispositivo ofrece una plataforma versátil y potente para avanzar en nuestra comprensión de las lesiones del SNC de sistema cerrado y desarrollar intervenciones terapéuticas efectivas.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software