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要約

このプロトコルは、マウスの閉鎖系中枢神経系(CNS)損傷(眼、脳、脊髄の外傷を含む)を誘発するように設計されたカスタム過圧空気システムについて説明しています。このプロトコルの目標は、研究者が独自の中枢神経系外傷研究のためにシステムを簡単に適応および拡張するためのフレームワークを提供することです。

要約

閉鎖系の中枢神経系(CNS)損傷の有病率は、保護的および治療的介入を改善するために、これらの外傷の理解を深める必要性を強調しています。この研究で重要なのは、閉鎖系の中枢神経系損傷を再現する動物モデルです。これに関連して、カスタムの過圧空気システムが設計され、眼、脳、脊髄の外傷など、マウスモデルでさまざまな閉鎖系の中枢神経系損傷を再現しました。これまで、このシステムは、眼の前後極損傷、間接外傷性視神経障害(ITON)、限局性外傷性脳損傷、および脊髄損傷をモデル化するために、目、頭部、または脊椎に向けられた過圧空気を投与するために使用されてきました。このホワイトペーパーでは、システムの設計と運用を概説する詳細なプロトコルを提供し、その有効性を実証する代表的な結果を共有します。ここで紹介する強固なフレームワークは、CNS外傷の継続的な研究のための強力な基盤を提供します。システムの柔軟な属性を活用することで、研究者は怪我の場所、重症度、タイミングを変更し、慎重に制御できます。これにより、複数の閉鎖系CNS損傷における分子メカニズムと治療効果の包括的な比較が可能になります。

概要

閉鎖系の中枢神経系(CNS)損傷は、頭蓋骨や脊柱の損傷を引き起こさずに脳や脊髄の損傷によって引き起こされる損傷です。これらの損傷には、外傷性脳損傷(TBI)や脊髄損傷(SCI)が含まれ、鈍器による損傷(転倒、スポーツ傷害、自動車事故など)や爆発性爆発など、さまざまな事故から発生する可能性があります。閉鎖系の中枢神経系損傷は、一般に貫通性中枢神経系損傷に比べて重症度が低いと考えられていますが、より頻繁に発生します。ただし、貫通性損傷と同様に、閉鎖系の中枢神経系損傷は、特に繰り返し発生した後、長期的かつ進行性の健康問題を引き起こす可能性があります1,2,3,4,5,6。懸念すべきことに、新たな証拠は、単一の発生7,8,9,10,11,12,13の後にTBIまたはSCIの診断基準を下回る無症候性の閉鎖系CNS損傷でさえ、繰り返しの損傷6,14,15の後に慢性神経変性疾患に進化する可能性があることを示唆しています。16.このことは、単一および反復的な閉鎖系CNS損傷のメカニズムと結果についてのより深い理解が緊急に必要であることを強調している。 このような知識は、改善された保護的および治療的アプローチに不可欠です。この取り組みに不可欠なのは、閉鎖系の中枢神経系損傷を再現する動物モデルです。

閉鎖系CNS損傷の現在の動物モデルは、病態生理学の理解と、これらの外傷に対する潜在的な保護的および治療的介入の理解を深めるのに役立ちました。げっ歯類は、その低コスト、入手可能性、遺伝的操作性、取り扱いの容易さ、確立された行動的および生理学的アッセイ、およびより好ましい倫理的考慮事項17のために特に人気があります。げっ歯類における閉鎖系TBIを誘導するための一般的な方法には、体重減少装置18、19、制御皮質衝撃(CCI)装置20、および圧縮空気駆動ショックチューブ21が含まれる。SCIの場合、鈍的外傷モデルは通常、脊髄または硬膜外腔に直接アクセスするために椎弓切除術22,23または他の外科的技術24を必要とする。しかし、閉鎖型SCI爆風傷害モデルは、圧縮空気駆動ショックチューブ25を使用して開発されている。貴重な洞察を提供するにもかかわらず、これらのモデルにはそれぞれ独自の制限があります。ウェイトドロップモデルは、高い変動性を持ち、傷害の位置と重症度の制御が限られているため、重度で制御不能な傷害を引き起こす実験的および倫理的な懸念が生じます26。CCIデバイスは精度を提供しますが、操作にはトレーニングが必要であり、開頭術が必要になる場合があり、再現性に影響を与える機械的なばらつきに悩まされる可能性があります27。ショックチューブは一般に侵襲性が低いが、入手が難しく、セットアップと操作が複雑であり、環境要因、波の反射、および複雑な圧力相互作用により、非現実的で非常に変動しやすい傷害状態を作り出す可能性がある28。

単回および反復閉鎖系の中枢神経系損傷とその治療のメカニズムと影響をよりよく研究するために、この論文では、モジュール式で、ユーザーフレンドリーで、費用対効果が高く、非侵襲的な方法を紹介します。このアプローチの主な目的は、場所、重症度、タイミングなどの損傷パラメータの正確な制御と柔軟な変更を可能にすることです。この目的をサポートするために、この原稿では、過圧空気システムの構築、校正、およびトラブルシューティングのための詳細なプロトコルを提供し、既存のクローズドシステムCNS損傷デバイスのいくつかの制限に対処します。このシステムは、費用対効果が高く、セットアップ時間が最小限に抑えられるだけでなく、非常に汎用性が高く、倫理的な懸念を最小限に抑え、臨床的関連性を最大化しながら、一貫性のある再現性のある結果を提供します。さらに、マウスモデルでさまざまな閉鎖系CNS損傷を引き起こすシステムの能力と、将来の研究での潜在的なアプリケーションについて説明します。特に、この原稿の目標は、研究者が特定のニーズに合わせてこのシステムを簡単に取得、適応、拡張できるフレームワークを提供することであり、それによってCNS外傷の進行中の研究をさらに進めることです。軸索外傷の誘発におけるシステムの有効性を示す代表的な結果も提示されます。

プロトコル

すべての手順は、ヴァンダービルト大学の29,30,31,32 Institutional Animal Care and Use Committee(IACUC)によって承認されたプロトコルと、Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care(AAALAC)およびAssociation for Research in Vision and Ophthalmology(ARVO)のガイドラインに基づいて行われました。すべてのマウスをグループ飼育し、12時間の明暗サイクルで維持し、食物と水を自由自在に提供しました。このプロトコルでは、生後30,31,33匹のC57 Bl/6マウスを使用しました。

1. システム構築

  1. 空気圧レギュレーターが統合された市販のペイントボールガン( 材料の表を参照)を入手してください。
  2. 必要に応じて、バレル(図1A)を変更します。
    1. 元のバレルにその長さに沿って開口部またはミシン目が入っていると、圧縮空気が漏れて空気中に放散され、最大出力圧力レベルが低下する可能性があります。出力圧力範囲を広げるために、頑丈な穴あきのないバレルを購入して交換します(図1、I)。
    2. 元のバレルが長くて扱いにくい場合は、カスタムの長さの短いバレルを購入するか、パイプカッターまたはのこぎりを使用して短くします。
    3. 元のバレルが目的の出力圧力レベルを生成しない場合は、カスタムボア径のバレルを購入して、バレルの内径(ボアサイズ)を変更します。元のボアサイズの直径を小さくすると、出力圧力の範囲が広がり、 その逆も同様です。
  3. 必要に応じて、レギュレーター(図1B)を変更します。
    1. 元のレギュレーターにガイドキャップが付属している場合は、ガイドキャップを取り外して調整ネジ(図1、II)に直接アクセスできるようにします。
    2. 元の調整ネジにアレンヘッドソケットが付属している場合は、六角穴付きネジをフラットヘッド穴付きネジに交換します。
  4. 標準の重力式フィードローダー(つまり、ペイントボールをガンに保持して供給するためのリザーバー)を取り外し、圧力漏れを防ぐために垂直フィードチューブ(図1、III)を密閉します。
    1. 重力フィードローダーを取り外す前に、ペイントボールガンがアンロードされ、空気源(CO2 または圧縮空気タンク)が切断されていることを確認してください。
    2. 重力式フィードローダが取り付けられているフィードネック(図1C)の位置を確認します。フィードネックclを緩めますamp 適切なツールを使用して。
    3. 標準の重力フィードローダーを上に引っ張って取り外します。
    4. フィードネックカバーまたはプラグを挿入して開口部を密閉します。これらは通常、ペイントボールストアまたはオンラインで入手でき、フィードネックにぴったりと収まり、密閉するように設計されています。
  5. ペイントボールガン用のプラットフォーム(図1D)とx-y動物位置決めテーブルを組み立てます。
    1. 中密度繊維板を2枚カットしてプラットフォームベースを構築します。
      注意: 材料の入手可能性と好みに応じて、代替材料(合板など)も使用できます。
    2. 小さい正方形のピースを 1.5 x 1.5 フィートにカットします。
    3. 大きな長方形のピースを2.5 x 1.5フィートのサイズにカットします。
    4. 2つの平行な2 x 4秒を使用して、小さい方のプラットフォームを大きい方のプラットフォームから3.5インチ上に持ち上げて固定します。
  6. 改造したペイントボールガンをプラットフォームに固定します。
    1. ペイントボールガンを小さい方のプラットフォームに横向きに置き、銃身の端が端から半インチ伸びるようにします。
    2. 取り付けブラケットまたはclを使用してペイントボールガンを固定しますamp ペイントボールガンの銃身とストックに適合する。
    3. 加圧エアタンク(図1E、 資料の表を参照)をペイントボールガンのレギュレーターに取り付けます。あるいは、圧縮窒素タンクから直接圧力ラインを接続して、信頼性の高い出力圧力レベルの範囲を広げることもできます。
    4. 加圧エアタンクを使用する場合は、耐久性のあるファブリックストラップでファイバーボードに固定してください。ストラップをネジまたはボルトで取り付け、簡単に締めたり緩めたりできる調整機構を含めます。
  7. ネジまたはボルトを使用して、ペイントボールガンの銃身の反対側にある大きな長方形のファイバーボードにXYポジショニングテーブルを固定します(図1F)。
    注意: x-yポジショニングテーブル( 材料の表を参照)は、x-yステージとも呼ばれ、オンライン小売業者、産業サプライヤー、科学機器サプライヤーなど、さまざまなサプライヤーから購入できます。XYポジショニングテーブルを購入するときは、移動範囲、負荷容量、精度、および手動調整または電動制御の選択を考慮してください。このXY位置決めテーブルは、x軸(バレルに向かって水平またはバレルから離れる)とy軸(バレルから垂直に上下する)の2つの軸に沿って動物を正確に移動および配置することを可能にします。
  8. 3つのPVCクランプを取り付けて、XY位置決めテーブルを変更します。
    1. 厚さ1cmのPVCクランプを2つ、バレルの前面の両側にネジまたはボルトで固定します。クランプがステップ1.9および1.10の動物ホルダーを収容するのに十分な幅であることを確認してください(例:1.5インチ)。
    2. 厚い(4 cm)PVCクランプを、厚さ1 cmの2つのクランプに対して垂直で反対側に固定しますamp ネジまたはボルトを使用して。クランプがステップ2.4の圧力トランスデューサーを収容するのに十分な幅であることを確認してください(例:1.5インチ)。
    3. 3番目のクランプの上部に2つの穴を開け、ステップ2のシステムキャリブレーション中に圧力トランスデューサをさらに安定させるために2本のプラスチックネジを挿入します。
  9. アニマルホルダーの内側をカスタマイズします(図2A)。
    1. マウスの内部封じ込めチャンバー用のPVCチューブ(外径35 mm、内径26 mm、長さ6.75インチ)を購入して切断します。
    2. チューブの端から1インチに長方形の穴(3 x 5 cm)を作成して、マウスの頭と後肩の上部を露出させ、体の残りの部分はシールドされたままです。
      注:CNS損傷部位がマウスの背中の下部にある場合(胸椎や腰椎など)、長方形の穴を大きくします。
  10. アニマルホルダーの外側をカスタマイズします(図2B)。
    1. マウスの外側の封じ込めチャンバー用のPVCチューブ(外径44 mm、内径35 mm、長さ6インチ)を購入して切断します。
    2. 中枢神経系の損傷部位を正確に制御するために、外側の封じ込めチャンバー内に露光開口部(図2C)を構築します。
    3. ステップ2のシステムキャリブレーション中に圧力トランスデューサーのバレルを挿入するために、反対側に逆方向の開口部を作成します(例:9 mmの穴)。
  11. 動物ホルダーの外側を改造して、ガス麻酔の送達に対応します。代わりに注射可能な麻酔薬を使用する場合は、この手順をスキップしてください。
    1. アニマルホルダーの外側の一端をテープで密封します。ガス漏れを防ぐために、しっかりとフィットしてください。
    2. 麻酔ラインを挿入するためのシールに小さな穴を開けます。
    3. 動物と直接接触することなく、イソフルランをチューブの環境に導入するように麻酔ラインを配置します。

2. システムキャリブレーション

  1. 圧力トランスデューサ(図2D、オプションについては 材料の表 を参照)をデータ収集(DAQ)システムとコンピュータに接続して、物理的な圧力測定値をデジタルデータに変換します。
    1. 圧力トランスデューサをDAQモジュール( 材料の表を参照)に接続し、適切な極性と確実な接続を確保します。
    2. DAQモジュールをDAQシャーシ( 資料表を参照)に挿入して、電力を受け取り、コンピュータと通信できるようにします。
    3. USBケーブルを使用して、DAQシャーシをコンピュータに接続します。
    4. DAQハードウェアとのインタフェースとデータの集録に必要なソフトウェアとドライバがコンピュータにインストールされていることを確認します(オプションについては 、資料の表 を参照)。
  2. DAQシステム設定を構成します。
    1. インストールしたDAQソフトウェアを開きます。
    2. DAQシステムがコンピュータによって認識されていることを確認します。
    3. 特定のDAQモジュール/シャーシおよび圧力トランスデューサの仕様および校正データシートを参照し、DAQシステム設定を構成します。
      注:この原稿で使用されているDAQハードウェアのDAQ設定は、GitHubで公開されています。興味のある読者は、https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON でリポジトリにアクセスできます。
      1. アナログ入力:圧力トランスデューサが接続されているDAQモジュールの物理入力チャンネルを選択します。
      2. 励起ソース(Vexソース):DAQモジュールの励起ソース(内部または外部など)を指定します。
      3. 励起電圧(Vex値):vex値を圧力トランスデューサーの製造元が指定した値(5Vまたは10Vなど)に設定します。
      4. ブリッジタイプ:DAQモジュールの適切なブリッジタイプ(フルブリッジ、ハーフブリッジ、クォータブリッジなど)を選択します。
      5. ブリッジ抵抗:ブリッジ抵抗を圧力トランスデューサーの製造元が指定した値(350など)に設定します。
      6. キャリブレーション係数/カスタムスケーリング:圧力トランスデューサの製造元が提供するキャリブレーションデータシートに基づいてスケーリングを構成します。メーカーは、既知の物理単位(psi)を適用し、結果として得られる電気単位(mV/V)を測定することにより、圧力トランスデューサを校正します。得られた電気単位に対して既知の物理単位をプロットすることにより、検量線を作成します。
      7. サンプリングレート(Hz):エイリアシングなしで圧力変化のダイナミクスをキャプチャするのに十分な高さのサンプリングレートを設定します(たとえば、実験の圧力変化の速度に応じて1または10 kHz)。
        注:過圧空気波形が狭いほど(つまり、圧力が急速に変化するほど)、励起される周波数範囲が広くなるため、サンプリングレートを高くする必要があります。これは、圧力変化が迅速に発生する可能性のあるCNS損傷モデルを含む実験では特に重要です。
  3. DAQソフトウェアでデータ集録用のデジタルツールを作成します。
    注意: このデジタルツールは、システムの出力圧力を正確に測定、記録、表示、および分析するために使用されます。この原稿で使用したデジタルツールは、GitHubで公開されています。興味のある読者は、https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. 信号処理アルゴリズムを実装して、トランスデューサからの生データをフィルタリング、増幅、またはその他の方法で処理します。
    2. ピーク圧力、平均圧力、圧力イベントの期間などのメトリックを計算するための解析ツールを追加します。
    3. 視覚的な要素(グラフなど)を組み込んでリアルタイムの圧力データを表示し、データ取得を開始、停止、リセットするための制御要素を組み込みます。
    4. デジタルツールを保存します。
  4. システムの出力圧力を測定する
    1. 圧力トランスデューサーを厚いclに挿入しますamp 動物ホルダーの穴(手順1.10.3で作成)を通して、XYテーブルとそのバレル。
    2. 圧力トランスデューサーのバレルを、先端がCNS損傷部位の位置に正確に来るまで調整します。
    3. 圧力トランスデューサーを2本のプラスチックネジ(手順1.8.3で取り付けました)で固定します。
  5. ペイントボールガンのトリガーを離しながら、データ収集ソフトウェアのデジタルツールを実行して、システムの出力圧力をキャプチャ、分析、および視覚化します。
  6. システムの出力圧力が目的のレベルに達するまで、調整ネジを調整します。
    注:ペイントボールガンの銃身を長さ1.5インチ、直径6.5mmの非穴あきに変更した後、システムはバレル34の前面から5mmで15〜50psiの範囲の過圧空気レベルを確実に供給することができます。15 psi未満および50 psiを超える過圧空気レベルは、強度に大きな変動を示します。システムの出力圧力(psi)を入力圧力(psi)、バレルからの距離(cm)、および時間(ms)の関数として包括的に表示するには、Hines-Beardらの 図2 を参照してください34。このシステムを使用して、圧縮空気の代わりに圧縮窒素を使用して、50psiを超える過圧空気レベルを確実に取得します。

3.動物の準備と過圧空気への曝露

  1. 完全に鎮静するまで、酸素中の1.5〜3%30,31,32,33イソフルランを含む誘導チャンバーでイソフルランでマウスを麻酔します。
    1. つま先のつま先をつまんでも反応がないかどうかを評価して、麻酔を確認します。
    2. マウスを内側のアニマルホルダーに固定し、頭と後肢の上部を長方形の開口部から露出させ、背肢と後肢下部をシールドしたままにします。
    3. 内側の動物ホルダーの無傷の下部にクッションを貼り付けて、マウスの頭を支えます。
    4. 後肩の上部にサージカルテープを貼ってマウスを固定します。
    5. 内側のアニマルホルダーを外側のアニマルホルダーに挿入します。
    6. 動物ホルダー内のイソフルラン送達への二次麻酔ラインを開きます。
    7. 麻酔薬がチューブから漏れるのを防ぎ、過圧空気にさらされている間にマウスが動くのを防ぐために、アニマルホルダーの端に追加のクッションを置きます。
  2. 過圧空気供給
    1. 外側のアニマルホルダーの4mmの円形開口部をマウスの左目の真上に合わせます。
    2. x-yテーブルのコントロールノブを使用して、アニマルホルダーを位置合わせし、開口部がペイントボールガンの銃身と揃い、外面が銃身の端から5mmになるようにします。
      注意: バレルの端から動物の距離を調整して、過圧の空気レベル(psi)と形状を変更します。動物をバレルから遠ざけて過圧の空気レベルを下げ、より拡散した過圧の空気波を作成します。
    3. 過圧エアシーケンスを開始して、ITONを誘導します。
      1. 15 psiの過圧空気を0.5秒間隔で2回バーストし、3日間29,30,31,32日毎日繰り返します。
        注:同様のITONは、0.5秒間隔23で区切られた15psiの過圧空気の3つの連続したバーストの送達によって誘発することができる。0.5 秒間隔で分離された 15 psi の過圧空気を 6 回連続してバーストした結果として生じる ITON の度合いは、この Representative Results に示されています。
      2. 開口部がバレルに面しなくなるように動物ホルダーを回し、段ボールのシールドで空気を遮断することにより、過圧空気自体ではなく、過圧空気のノイズに偽のマウスをさらします。
  3. マウスの回復
    1. マウスを麻酔から回復させます。
      1. 潤滑剤の点眼薬を投与します( 材料の表を参照)麻酔で目が乾くのを防ぎます。
      2. 制御された加熱サポートを使用して暖かさを提供します( 材料の表を参照)。
    2. マウスが直立姿勢を維持し、正常に歩くまで、マウスを視覚的に監視します。彼らがケージメイトと一緒にいることを許してください。
    3. 体重減少を防ぐために、損傷後最初の3日間、過圧空気にさらされたすべてのマウスにゲル回復食品( 材料の表を参照)を提供します。.

4. ティッシュの収集と処理

  1. Avertin Working Solutionの腹腔内注射によりマウスを安楽死させます。
    1. 10 gmの2,2,2,-トリブロモエタノール( 材料の表を参照)と10 mLの1-ペンタノール( 材料の表を参照)を混合して、Avertin Stockを作成します。4°Cの暗所で保管してください。
    2. 50 mLのチューブに1.25 mLのAvertin Stock、45 mLの二重蒸留水、5 mLの10x PBS( 材料の表を参照)を組み合わせて、Avertinワーキングソリューションを作製します。混合物をフィルター滅菌し、4°Cの暗所で保存します。
  2. マウスに4%パラホルムアルデヒド( 材料の表を参照)を1x PBS( 材料の表を参照)で経心的に灌流します。
  3. 細い鉗子( 材料の表を参照)とハサミ( 材料の表を参照)を使用して過圧の空気にさらされた目を除核し、視神経(ON)を確実に保存します。
  4. ONを除核した眼組織と一緒に採取し、さらなる分析を行います。
  5. ONティッシュを浸透させます。
    1. 1x PBS中の4%パラホルムアルデヒドと2%グルタルアルデヒド( 材料の表を参照)で組織を一晩Postfixします。灌流されていない組織で作業する場合(ステップ4.2のように)、一晩ではなく5日間ポストフィックスします。
    2. ONティッシュを12ウェルまたは24ウェルプレート( 材料の表を参照)に1x PBSで、ペイントブラシ( 材料の表を参照)または鋭利な木製の棒を使用して移します。
    3. ドラフト内で、1xPBSを0.2 Mカコジルバッファー中の2%四酸化オスミウム( 材料の表を参照)に交換します(レシピはGitHubで公開されています。興味のある読者は、トランスファーピペットを使用して https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON)のリポジトリにアクセスできます。氷上で2時間インキュベートします。
    4. 1x PBSで3回の洗浄を行います
      1. オスミウム廃棄物は適切に廃棄してください。
      2. 3回目のPBS洗浄後、プレートをヒュームフードに2晩放置します。
  6. 等級付けされたエタノールシリーズのONティッシュを脱水します。
    1. 神経を50%エタノールを含む新しいプレートに移し、30分間インキュベートします。
    2. 70%エタノールと30分間交換します。
    3. 95%エタノールと30分間交換します。
    4. 100%エタノールと30分間交換します。
  7. ONティッシュをエポンに埋め込みます。
    注: エポンのレシピは GitHub で公開されています。興味のある読者は、https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON でリポジトリにアクセスできます。レシピに記載されている材料については、材料の表 を参照してください。
    1. 1日目:組織をプロピレンオキシド( 材料の表を参照)/ 100%エタノール(1:1)を入れた2mLバイアルに移し、室温で30分間振とうします。純粋なプロピレンオキシドと交換し、15分間振とうし、1回繰り返します。プロピレンオキシド/エポン(1:1)に交換し、冷蔵室で一晩振とうします。
    2. 2日目:組織を100%エポン入りの12ウェルまたは24ウェルプレートに移し、室温で4時間振とうします。新鮮な100%エポンと交換し、真空中で室温で一晩インキュベートします。
    3. 3日目:2日目と同様にエポンインキュベーションを繰り返します。
    4. 4日目:組織を100%エポンの平らな型に移し、組織の向きを変え、60°Cのオーブンに48時間置きます。
  8. ティッシュのセクション。
    1. 解剖スコープの下で型をトリミングして、神経を中央にした二重ピラミッドにします。
    2. ウルトラミクロトームとダイヤモンドナイフを使用して、厚さ700 nmの断面を収集します( 材料の表を参照)。
    3. 帯電した白色ガラス顕微鏡スライドの切片を蒸留水で収集します。
    4. 60°Cのオーブンで水が蒸発するまでドライスライドします。室温で冷やします。
  9. ティッシュを染色します。
    1. スライドを1%パラフェニレンジアミン(PPD)( 材料表を参照)にメタノールと2-プロパノールの1:1混合物に28分間浸します。
    2. スライドを1:1メタノール( 材料表を参照)と2-プロパノール( 材料表を参照)の2つの連続した混合物でそれぞれ1分間すすぎます。
    3. スライドを100%エタノールで1分間すすぎ、自然乾燥させます。
    4. スライドを湿った箱に入れ、トランスファーピペットを使用して1%トルイジンブルー( 材料の表を参照)でセクションを覆います。
    5. 60°Cのオーブンで20分間インキュベートします。
    6. スライドを二重蒸留水ですすぎ、風乾させます。
  10. ティッシュをマウントして画像化します。
    1. 封入剤(方法の表を参照)を使用してスライドを覆い、余分な媒体を取り除きます。
    2. スライドを一晩乾かします。
    3. 100倍油浸対物レンズを使用した明視野顕微鏡による断面の画像化。
  11. 包埋、切片、免疫組織化学的に網膜組織を染色します。
    1. 眼全体の組織を4%パラホルムアルデヒドに2〜4時間後置します。
    2. 眼組織全体を30%ショ糖で凍結保護します(1x PBS中の 材料表 を4°Cで一晩使用。
    3. 眼の組織を凍結培地に埋め込みます( 材料の表を参照)。
    4. 厚さ10 μmの網膜断面をクライオスタットに集め、その切片を帯電した白色ガラス顕微鏡スライドに取り付けます( 材料の表を参照)。
    5. スライドを1x PBSで洗浄し、ブロッキングバッファー(5% Triton X-100および2%ウシ血清アルブミン(BSA)(1x PBS中の2%ウシ血清アルブミン( BSA)(材料表を参照))と5%正常ロバ血清( NDS)(材料表を参照)を室温で30分間インキュベートします。
    6. 1xPBS(PBT)中の0.5% Triton X-100(材料表を参照)中の一次抗体(材料表を参照)でスライドを4°C(または室温で4時間)で一晩インキュベートします。
    7. スライドをPBTで洗浄し、5% NDSを含むブロッキングバッファーで二次抗体( 材料の表を参照)でインキュベートします。
    8. スライドをPBTで洗浄し、DAPIで封入剤を塗布し( 材料表を参照)、カバースリップ、マニキュアで密封します。
    9. 落射蛍光顕微鏡で画像をスライドします。
    10. 蛍光強度を定量化する場合は、画像が同じ網膜領域から同じ倍率、ゲイン、および露出設定で撮影されていることを確認してください。
  12. 軸索を頼りにします。
    1. 固定グリッドオーバーレイを使用して全神経断面積の20%をサンプリングすることにより、画像解析ソフトウェア( 材料の表を参照)を使用して軸索の数を手動でカウントし、軸索密度(軸索/ mm2)を推定します。
    2. ON断面の面積を測定します。
      1. Set Scale機能を使用して、画像化に使用する対物レンズのピクセル/ミクロンを設定します。
      2. ポリゴン選択ツールを使用して、視神経のミエリン鞘に沿って、血管系を除いたトレースを行います。
      3. Measure機能を使用してONの面積を測定します。
      4. 測定された面積に 0.2 を掛けて、総面積の 20% を決定します。
    3. 固定グリッドをON断面に重ね合わせます。
      1. Counting Array プラグインをダウンロードします。
        注: このプラグインは GitHub で公開されています。興味のある読者は、https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON でリポジトリにアクセスできます。
      2. Counting Arrayプラグインを開くと、プラス記号が形成された9つの等間隔の正方形で構成される固定グリッドが断面の上に重ねられます。
      3. ON断面の総面積(手順4.6.2.4で計算)の20%を9で割って、9つの領域ごとに面積を編集します。
      4. 固定グリッドを中央に配置して、プラス記号の中心が ON 断面の中央になるようにします。
    4. 生きている軸索と変性する軸索を別々に数えます。
      1. Cell Counter プラグインをダウンロードして開きます。
        注: このプラグインは GitHub で公開されています。興味のある読者は、https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON でリポジトリにアクセスできます。
      2. 9つの領域のそれぞれについて、ミエリン鞘の状態を視覚化することにより、生きている軸索プロファイルと変性する軸索プロファイルの数を別々にカウントします。軸索の定量化は、バイアスを避けるために、動物の実験グループを知らされていない状態で行われるようにします。
      3. 生きた軸索の場合は、ミエリン鞘が無傷で均一に染色され、軸索の周りを滑らかかつ均一に囲まれているように見える軸索を探します。
      4. 変性した軸索については、ミエリン鞘が肥厚している、タマネギになっている、または崩壊しているものを探します。
      5. 軸索がオーバーレイされたグリッドによって部分的に切断されている場合は、内腔が見られる場合にのみ軸索カウントに含めます。
      6. 長方形の軸索が誤って複数回カウントされないようにし、破片やほこりを変性した軸索プロファイルと間違えないようにしてください。
    5. 統計解析を実行して、グループ間の平均軸索数の有意差をテストします。以前の分析で観察された正常な変動性を考慮するために、各グループに少なくとも 4 つの ON が含まれていることを確認します。
      1. 独立サンプルのt検定(独立サンプルのスチューデント t検定とも呼ばれる)を実行して、2つの独立グループの平均間の有意差を評価します。
      2. ノンパラメトリックな代替案であるマンホイットニーU検定を実行し、独立サンプルのt検定の条件が満たされない場合(つまり、データが正規分布していないか、サンプルサイズが小さすぎる場合)を実行します。

代表的な結果

ここで説明する過圧空気生成システムを使用して、成体(生後3か月)の雄C57Bl/6マウス(n = 4)の左眼を0.5秒間隔で15psiの過圧空気の6連続バーストにさらすことにより、間接外傷性視神経障害(ITON)を誘発しました。偽の動物(n = 8;Vest et al.33から採取したデータ)を麻酔し、動物ホルダーに入れ、音にはさらされましたが、過圧の空気にはさらされませんでした。

偽動物の近位視神経(図3A)は、正常な形態と分布を持つグリア細胞に囲まれた密集した均一なサイズの軸索で健康に見えました。これに対し、ITONにばく露されたマウスの近位視神経(すなわち、0.5秒間隔で隔てられた15psiの過圧空気の6回連続バースト)(図3B)は、残りの軸索間の間隔の増加、腫脹を含む軸索変性の兆候、軸索形状の不規則性、軸索のミエリン鞘の破壊などの軸索喪失の兆候を伴って変性しているように見えました。 グリア細胞の肥大および過形成を含む神経膠症の徴候。Mann-Whitney U 検定では、ITONマウスと偽マウスとの間に、全軸索(p = 0.0040)(図3C)と変性プロファイル(p = 0.0028)(図3D)に有意差があることが確認されました。これらの結果は、ITONが全軸索を有意に減少させ、変性プロファイルを有意に増加させることを示唆しています。Mann-Whitney U 検定は、ITONグループのデータに 独立サンプルt検定に十分なサンプルサイズがなかったために実施されました。

ミクログリア(中枢神経系の一次免疫細胞)のマーカーである抗Iba1( 材料表参照)による網膜断面の免疫組織化学的染色を、偽マウス(図4A)とITON(図4B)マウスの両方で行いました。染色により、ミクログリアはすべてのマウスで休眠状態にあり、長くて薄く、高度に分岐した突起を持つ小さな細胞体を特徴とすることが明らかになりました。特に、ITONマウスではミクログリアの数の増加が認められ(図4B)、損傷に応答したミクログリアの増殖が示唆されています。また、ITONマウスでは、ミクログリアが視細胞体が存在する外核層(ONL)に異常に広がっていることが観察されました(図4B)。これは、ミクログリアが神経節細胞層(GCL)、内側フジツボ層(IPL)、内核層(INL)、および外側フジツボ層(OPL)に局在していた偽動物(図4A)とは対照的です。これらの層は、通常、ミクログリアが健康で損傷のない網膜に存在する層です。

その後、桿体双極細胞のマーカーである抗PKC-α( 材料表参照)および抗シナプトフィジン( 材料表参照)および視細胞リボンシナプスによる免疫組織化学染色により、偽マウス(図5A)およびITONマウス(図5B)の両方で無傷のシナプス結合が明らかになりました。具体的には、桿体双極細胞の樹状突起が桿体視細胞のシナプス終末と延長し、重なり合っていることが観察されました。この発見は、ITONの4週間後に、1日1回1回(0.5秒間隔)の過圧空気の2回連続したバースト(0.5秒間隔)により、桿体双極細胞樹状突起が細胞体に向かって収縮することを示した初期の研究35とは対照的です。この不一致は、2つの研究間の組織採取時点が異なることに起因している可能性があります。現在のサンプルは、以前の研究ではITONの4週間後に収集されたのに対し、ITONの2週間後に収集されました。現在の解析ではシナプス障害は検出されませんでしたが、ミクログリアのプロセスが光受容体細胞体が位置するONL(図4B)に拡張されていることに注目しました。この観察結果は、双極細胞と視細胞との間のシナプス結合の破壊が損傷の二次的影響として現れる可能性があり、軸索の喪失、軸索変性、および神経膠症が損傷の一次的影響を構成することを示唆しています。

figure-representative results-2328
図1:限局性閉鎖系中枢神経系損傷のシステム。 上の画像の破線の四角形は拡大され、下の 2 つの画像では B、C、A として表示されています (白い矢印で示されています)。(A)ペイントボールガンの端にあるカスタム1.5インチ、非穴あきバレル(I)。(B)ガイドキャップを取り外して調整ネジ(II)を露出させた圧力調整器。(C)重力式フィードローダーを取り外し、フィードネックカバーを取り付けたフィードネック(III)。(D)1.5フィート×1.5フィートのファイバーボードを、より大きな2.5フィート×1.5フィートのファイバーボードの上に持ち上げたベースプラットフォーム。(E)圧縮空気タンクをペイントボールガンの圧力調整器に接続し、耐久性のあるストラップを使用してファイバーボードプラットフォームに固定します。(F)x-y動物位置決めテーブル。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図2:過圧空気の焦点供給のためのカスタムアニマルホルダー。 (A)動物の頭部と後頭部の上部を露出させるための長方形の穴(3×5cm)を備えた細いPVCチューブからなるアニマルホルダーの内部。(B)動物ホルダーの外側は、幅の広いPVCチューブで構成され、幅の狭いPVCチューブがスライドして、露出開口部内の露出した組織から動物の体全体をシールドします。(C)対象のCNS損傷部位に過圧空気を焦点として送達するための露出開口部。(D)システムの出力圧力を校正するための圧力トランスデューサ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図3:過圧空気の焦点供給によるITON。 (A,B)(A)偽および(B)ITONからの近位視神経断面の代表的な明視野顕微鏡写真。(C)総軸索数の定量化。(D)変性軸索プロファイルの定量化。 ITON の場合は n = 4 です。 n = 9 は sham です。偽群の軸索数データは、Vest et al.33から取得しました。**p < 0.005.エラーバーは標準偏差を表します。スケールバー = 20 μm。略称:ITON=間接外傷性視神経障害。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図4:システム誘発性ITONによる異常なミクログリアの増殖とONLへの移動 (A,B)(A)偽動物および(B)ITON動物由来のミクログリア(赤)の抗Iba1標識を施した網膜断面の代表的な蛍光顕微鏡写真。スケールバー = 100 μm。略語:ITON =間接外傷性視神経障害;GCL =神経節細胞層、INL =内核層、ONL =外核層。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:遅延性シナプス障害の可能性があるにもかかわらず、システム誘発性ITONによる桿体双極細胞と光受容体との間のシナプス結合の早期定着 (A,B) (A)偽および(B)からの光受容体リボンシナプスの抗シナプトフィジン標識(赤)および桿体双極細胞(緑)の抗PKC-α標識による網膜断面の代表的な蛍光顕微鏡写真)ITONの動物。スケールバー = 100 μm。略語:ITON =間接外傷性視神経障害;PKC = プロテインキナーゼC. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

ディスカッション

このカスタム過圧エアシステムは、マウスモデルにおけるクローズドシステムのCNS損傷を研究するための便利なツールです。この実験例の代表的な結果は、このシステムを使用した過圧空気の焦点供給がITONを効果的に誘導し、重大な軸索の損失と変性をもたらすことを示しています。これは、正確で再現性のある中枢神経系損傷を引き起こすシステムの能力を浮き彫りにしています。

このシステムの大きな強みの1つは、さまざまな中枢神経系損傷を誘発するカスタマイズ性です。傷害の重症度は、システムの全体的な出力圧力、x-y位置決めステージを使用したバレルの端からの動物の距離、露光開口部のサイズと形状、過圧空気への曝露回数、および曝露間隔を変更することによって調整することができます。さらに、CNS損傷の位置は、動物ホルダー内の露出開口部の位置を変更することによって調整することができます。この汎用性により、このシステムはマウスモデルでさまざまな閉鎖系CNS損傷を生成することができました。当初、このシステムは、免疫系応答37の影響、株特異的な結果38、および神経保護剤39の有効性を含む、前極および後極の損傷および関連する欠損34,36に焦点を当てて、クローズドグローブ損傷をモデル化するために使用されました。最終的に、このアプリケーションは、間接的な外傷性視神経障害(ITON)30をモデル化し、反復曝露の回数と間隔の影響を調査するために、反復眼指向性曝露の後遺症を評価するために拡張されました33。それ以来、このシステムの適用は、頭部指向被ばく40,41による閉鎖性頭部軽度外傷性脳損傷(mTBI)および背部指向被ばく42による閉鎖性脊髄損傷(SCI)のモデル化に拡大し、さまざまなCNS損傷領域の研究におけるデバイスの適応性と汎用性を強調しています。

このシステムを使用する際には、実験結果の再現性と信頼性を確保するために、傷害結果の ばらつきを最小限に抑える ための対策を講じることが重要です。主な対策には、3回の露光の各シリーズの前後にシステムの出力圧力レベルを校正して、一貫した圧力供給を確保することが含まれます。圧縮空気34を使用する場合、システムが15psiから50psiの間で動作した場合、変動性は低くなりますが、一貫したキャリブレーションは、バッテリー残量の低下や空気不足などの予期しないエラーを検出するのに役立ちます。さらに、圧力波の強度が距離とともに減少するため、各動物をバレルの端から同じ距離に配置して、一定の過圧の大きさを確保します。また、均一なポジショニングにより、各動物が電波の同じ部分から影響を受けることも保証されます。さらに、動物をホルダー内に均一に固定することで、特に移動のリスクがある反復暴露モデルでは、関心のある組織が一貫して標的となるようになります。最後に、動物の年齢、性別、遺伝的背景の均一性は、これらの要因が損傷に対する反応に影響を与えるため、非常に重要です。例えば、このシステムを使用した以前の研究では、目を向ける過圧空気がさまざまなマウス系統に及ぼす影響を比較し、C57Bl/6J36、DBA/2J37、Balb/c38 マウス間の傷害反応の有意差が強調されました。DBA/2JおよびBalb/cマウスは、C57Bl/6Jマウスと比較して、より重篤な前極の病状、より大きな網膜損傷、より高い酸化ストレス、およびより顕著な神経炎症反応を示し、Balb/cマウスは特に堅牢で持続的な損傷プロファイルを示した38。

システムのトラブルシューティング
特定の圧力計の設定で圧力値が特徴的に低い場合は、トリガーを5〜10倍引き、空気がシステムを通過し、レギュレーターが新しい設定に調整されるようにします。エアタンクに漏れがあってはなりません。エアタンクのOリングは損傷したり摩耗したりしてはならず、エアタンクには十分な空気があり、銃のバッテリーが消耗してはなりません。XYテーブルは、銃身の端から通常の位置からずれてはならず、過圧空気露光開口部は銃身と一直線に並び、銃身を閉塞しないようにする必要があります。レギュレーターは、ガンのグリップにしっかりと固定する必要があります。圧力計の最高設定を使用しているにもかかわらず圧力値が低すぎる場合は、圧力計を200 psiを超えて増やしてはならず、ガンの速度設定を最大設定に調整する必要があります。圧力設定が一貫していない場合(たとえば、高から低)、エアタンクに十分な空気があり、レギュレーターがガンのグリップにしっかりと固定されていること、エアタンクに漏れがなく、しっかりとねじ込まれていること、およびエアタンクのOリングが損傷または摩耗していないことを確認してください。

このシステムの全機能を包括的に理解するためには、その限界を認識することが重要です。実験室で現実世界のシナリオを模倣することは、依然として困難です。このシステムは過圧空気を生成しますが、圧力や温度の勾配の変化、破片や反射波の存在、多相性など、爆発事象の複雑なダイナミクスを再現することはできません。さらに、フリードランダー波形(「一次爆風波」)を模倣しておらず、これは、圧力の鋭い、ほぼ瞬間的なピークと、それに続く急速な指数関数的減衰によって特徴付けられ、ベースライン43に戻る前に周囲圧力を下回ります。むしろ、このシステムによって生成される波形は、明確な負の位相を伴わずに圧力がより緩やかに上昇および下降する、より単純で対称的なプロファイルを表しています(Hines-Beard et al.34の図2Cを参照)。やや有利なことに、この波形は爆風と鈍器の両方の要素を組み合わせています。釣鐘型の「圧力パルス」は、被写体に当たる「空気の壁」に似た、一貫した過圧衝撃を提供します。しかし、波によって供給される過圧空気も、爆風傷害の重要な特徴です。この波形には両方の傷害タイプの側面が含まれていますが、どちらかの複雑さを完全には捉えていないと主張する人もいるかもしれません。しかし、この一貫性と再現性のある「圧力パルス」は、局所的な閉鎖系CNS損傷を研究するための実験室環境での制御実験に最適です。私たちは以前に怪我の焦点の性質を示しました。例えば、片方の眼への曝露は、一次鼻上皮または脳44に損傷を引き起こさない。また、マウスの頭部の側面に向けられると、脳の小さな領域が影響を受ける45。最後に、ITONに使用された圧力レベルでのこのシステムからの過圧空気からのエネルギーは、短い時間間隔33で繰り返されない限り、マウスに影響を与えなかった。したがって、圧力は無害であり、したがってジェットエンドの力を複製しません。また、眼への過圧空気曝露を繰り返しても、眼前部構造33への影響はなかった。重大な視神経変性および視力喪失は、曝露間隔が1分未満の反復曝露によってのみ発生した33。

閉鎖系の中枢神経系損傷を作成するための他の実験装置と比較して、このシステムには独自の 利点があります。これは、急速な爆風曝露が一般的な危険である高リスクの職業環境の条件を模倣して、急速な連続(0.5秒間隔)33で過圧空気の連続的なバーストを供給することができます。例えば、訓練と戦闘の両方のシナリオで、軍人は、自動小銃(M16、AK-47など)、機関銃(M2 .50口径など)、ガトリング銃、ミニガンなど、迅速な連射が可能な多数の自動火器を使用します。軍人が使用するその他の低速ながら反復的な兵器には、大砲、迫撃砲、手榴弾、即席爆発装置(IED)などがあります。制御解体に関与する解体作業員や、岩石を分解して鉱物を抽出する発破作業に関与する鉱山労働者も、連続して連続して発破を経験します。最後に、空気圧工具、杭打ち機、または強力な衝撃力を生成するその他の重機を使用する建設作業員は、爆風の曝露を模倣した急速な繰り返し衝撃を経験する可能性があります。特に、ショックチューブのように、各イベント間で大規模な再構成や再加圧が必要なデバイスでは、過圧空気の迅速な供給は不可能です。ショックチューブは、破裂して衝撃波を発生させるダイヤフラムを使用しており、破裂するたびにダイヤフラムを交換する必要があります。このプロセスは、ショックチューブを開き、使用済みのダイヤフラムを取り外し、新しいダイヤフラムを取り付け、システムがリセットして再加圧する時間を確保する必要があるため、時間がかかります。したがって、特に急速な反復爆風曝露後のCNS損傷を調査する研究では、各イベント間で大規模な再構成や再加圧を必要としないシステムが理想的です。

この変調性、ユーザーフレンドリー、費用対効果の高いシステムの将来のアプリケーションは有望です。このシステムは、その適応性と独自の特性を活用して、将来の前臨床治療研究のためのいくつかの有望な道を開きます。過圧空気を迅速かつ連続的にバーストさせる能力は、反復的な爆風曝露の累積効果を研究するために活用でき、慢性外傷性脳症やその他の長期的な神経変性疾患の理解に関連しています。さらに、このシステムを使用して、最適な治療ウィンドウを決定するための神経保護薬のタイミングと投与など、閉鎖系の中枢神経系損傷の軽減を目的としたさまざまな薬理学的介入の有効性を探ることができます。さらに、鈍器と爆風の両方の損傷メカニズムの側面を模倣するシステムの精度により、現実世界のシナリオで個人が経験する複雑な損傷を反映した包括的な損傷モデルの開発が可能になります。これにより、炎症、酸化ストレス、神経細胞死など、損傷の一般的な全体的な側面に対処するマルチモーダル療法の試験が容易になります。全体として、このデバイスは、閉鎖系CNS損傷の理解を深め、効果的な治療介入を開発するための多用途で強力なプラットフォームを提供します。

開示事項

著者には、開示すべき利益相反はありません。

謝辞

この研究は、NIH NEI P30 EY008126、Potocsnak Discovery Grant in Regenerative Medicine、Ret. Maj. General Stephen L. Jones, MD Fund、Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds(VEI)からの資金提供を受けて行われました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Used to make Avertin solution 
2,2,2-tribomoethanolSigma AldrichT48402Used to make Avertin solution 
24-well plates with lidVWR76520-63424-well plate
2-Propanol Fisher ScientificA451-1 
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module National InstrumentsNI-9237DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA) Research Products International A30075BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal) Abcam ab5076Marker for microglia, Used at 1:500 concentration 
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal) Abcam ab8049Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502 Electron Microscopy Sciences10900
Cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences11652
Charcoal Filter CanisterE-Z SystemsEZ-258Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76AClear H2O 72-07-5022Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ ChassisNational InstrumentsUSB-9162DAQ chassis
Compressed AirA-L GasGSMCA300 Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G Southern BiotechMounting media with DAPI
Diamond knifeMicro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H 
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-11058Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21203Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21206Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration 
Donkey Serum Sigma Aldrich D9662NDS
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11231-30Fine forceps for whole eye enucleation 
Ethanol (200 proof) KOPTEC (Supplier: VWR) 89125-188Ethanol 
Fluoromount-G Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)00-4958-02Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic GelCovetrus72359Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia 
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200
Graduated Cylinder 1000 mLFisher Scientific08-572G
Graduated Cylinder 250 mLFisher Scientific08-572E
Graduated Cylinder 500 mLFisher Scientific08-572F
Heating pad Braintree ScientificAP-R 26EControlled heating support
High Pressure Fill StationNinja PaintballHPFSV2Used to refill pressurized air tank
ImageJNational Institutes of Health Image analysis software
Invert MiniEmpire PaintballPaintball gun
IsofluraneCovetrus29405Inhalation anesthetic
Isoflurane VaporizerVetEquip901806Animal anesthesia
Masterflex PumpCole-ParmerUsed for animal perfusion
Methanol Sigma Aldrich322415-2L 
Microscope SlidesGlobe Scientific1358WWhite glass microscope slides
NI LabVIEW National InstrumentsSoftware to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) National InstrumentsSoftware to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers National InstrumentsDriver for interacing with DAQ system 
Nikon Eclipse Ni-E microscopeNikon Instruments
Osmium tetroxide 2%Electron Microscopy Sciences19152
Paraformaldehyde 32%Electron Microscopy Sciences15714-SPFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine Sigma AldrichP6001
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044PBS diluted down to 1x
Propylene oxide Electron Microscopy Sciences20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated TankNinja PaintballPressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mLFisher Scientific06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mLFisher Scientific06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mLFisher Scientific06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal) Abcam ab32376Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration 
Resin 812Electron Microscopy Sciences14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi Honeywell 060-0708-10TJGConsider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
SucroseSigma AldrichS5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi Honeywell Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
Syringe/Needle ComboCovetrus 60728Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT CompoundFisher Scientific23-730-571 Freezing medium 
Toluidine blueFisher ScientificBP107-10
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UniSlide XY TableVelmex AXY40 SeriesXY positioning table 
University Brush - Series 233- Round, Size 000Winsor and Newton Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-08Scissors for whole eye enucleation
Virtual InstrumentNational Instruments Digital tool for data acquisition software 

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