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요약

이 프로토콜은 안구, 뇌 및 척수 외상을 포함하여 마우스에서 폐쇄 시스템 중추 신경계(CNS) 손상을 유도하도록 설계된 맞춤형 과압 공기 시스템을 설명합니다. 이 프로토콜의 목표는 연구자들이 고유한 CNS 외상 연구를 위해 시스템을 쉽게 조정하고 확장할 수 있는 프레임워크를 제공하는 것입니다.

초록

폐쇄계 중추신경계(CNS) 손상의 유병률은 보호 및 치료 개입을 개선하기 위해 이러한 외상에 대한 이해를 높여야 할 필요성을 강조합니다. 이 연구에서 중요한 것은 폐쇄 시스템 CNS 손상을 복제하는 동물 모델입니다. 이러한 맥락에서 맞춤형 과압 공기 시스템은 안구, 뇌 및 척수 외상을 포함한 쥐 모델에서 다양한 폐쇄 시스템 CNS 손상을 재현하도록 설계되었습니다. 현재까지 이 시스템은 눈, 머리 또는 척추 방향의 과압 공기를 투여하여 눈의 전후 극 손상, 간접 외상성 시신경병증(ITON), 국소 외상성 뇌 손상 및 척수 손상을 모델링하는 데 사용되었습니다. 이 백서는 시스템의 설계 및 운영을 설명하는 자세한 프로토콜을 제공하고 그 효과를 입증하는 대표적인 결과를 공유합니다. 여기에 제시된 강력한 프레임워크는 중추신경계 외상에 대한 지속적인 연구를 위한 강력한 기반을 제공합니다. 시스템의 유연한 속성을 활용하여 조사관은 부상의 위치, 심각성 및 시기를 수정하고 신중하게 제어할 수 있습니다. 이를 통해 여러 폐쇄 시스템 CNS 손상에 대한 분자 메커니즘과 치료 효능을 포괄적으로 비교할 수 있습니다.

서문

폐쇄 시스템 중추 신경계(CNS) 손상은 두개골이나 척추에 파괴를 일으키지 않고 뇌나 척수의 손상으로 인해 발생하는 손상입니다. 이러한 부상에는 외상성 뇌 손상(TBI) 및 척수 손상(SCI)이 포함되며 둔기에 의한 부상(예: 낙상, 스포츠 부상, 자동차 사고) 및 폭발성 폭발을 포함한 다양한 사고로 인해 발생할 수 있습니다. 폐쇄형 중추신경계 손상은 일반적으로 관통성 중추신경계 손상에 비해 덜 심각한 것으로 간주되지만 더 자주 발생합니다. 그러나 관통성 손상과 유사하게, 폐쇄형 중추신경계 손상은 특히 반복적으로 발생한 후에는 장기적이고 점진적인 건강 문제를 초래할 수 있다 1,2,3,4,5,6. 우려스럽게도, 새로운 증거에 의하면 한 번의 발생 후 TBI 또는 SCI의 진단 기준에 미치지 못하는 무증상 폐쇄 시스템 중 추신경계 손상조차도 7,8,9,10,11,12,13 반복적인 손상 후에는 만성 신경퇴행성 질환으로 발전할 수 있다 6,14,1516. 이는 단발성 및 반복적인 폐쇄성 중추신경계 손상의 메커니즘과 결과에 대한 더 나은 이해가 시급히 필요함을 강조합니다.  이러한 지식은 보호 및 치료 접근법을 개선하는 데 필수적입니다. 이러한 노력에 결정적인 역할을 하는 것은 폐쇄 시스템 CNS 손상을 재현하는 동물 모델입니다.

폐쇄 시스템 CNS 손상의 현재 동물 모델은 이러한 외상에 대한 병태 생리학과 잠재적인 보호 및 치료 개입에 대한 이해를 발전시키는 데 중요한 역할을 했습니다. 설치류는 저렴한 비용, 가용성, 유전적 조작 가능성, 취급 용이성, 잘 정립된 행동 및 생리학적 분석, 보다 유리한 윤리적 고려 사항으로 인해 특히 인기가 있습니다17. 설치류에서 폐쇄 시스템 TBI를 유도하는 일반적인 방법에는 체중 감소 장치(18,19), 제어 피질 충격(CCI) 장치(20) 및 압축 공기 구동 충격관(21)이 포함된다. SCI의 경우, 둔기 외상 모델은 전형적으로 척수 또는 경막외 공간에 직접 접근하기 위해 후궁 절제술(laminectomy)22,23 또는 다른 수술 기법(24)을 필요로 한다. 그러나, 폐쇄형 몸체의 SCI 폭발 부상 모델은 압축 공기 구동 충격 튜브(25)를 사용하여 개발되었다. 귀중한 통찰력을 제공함에도 불구하고 이러한 각 모델에는 고유한 제한 사항이 있습니다. 중량 감소 모델은 변동성이 높고 부상 위치 및 심각도에 대한 통제력이 제한적일 수 있으며, 이로 인해 심각하고 통제되지 않는 부상을 유발하는 실험적, 윤리적 문제가 발생할 수 있다26. CCI 장치는 정밀도를 제공하지만 작동하려면 교육이 필요하고, 개두술이 필요할 수 있으며, 재현성에 영향을 미치는 기계적 변동성이 있을 수 있다27. 충격관은 일반적으로 덜 침습적이지만 획득하기 어렵고 설정 및 작동이 복잡할 수 있으며 환경 요인, 파도 반사 및 복잡한 압력 상호 작용으로 인해 비현실적이고 매우 가변적인 부상 상태를 생성할 수 있습니다28.

단일 및 반복적인 폐쇄 시스템 CNS 손상의 메커니즘과 효과 및 그 치료법을 더 잘 연구하기 위해 이 논문은 사용자 친화적이고 비용 효율적인 모듈식 방법을 제시합니다. 이 접근 방식의 주요 목표는 위치, 심각도 및 타이밍을 포함한 부상 매개변수를 정밀하게 제어하고 유연하게 수정할 수 있도록 하는 것입니다. 이 목표를 지원하기 위해 이 원고는 과압 공기 시스템의 구성, 교정 및 문제 해결을 위한 자세한 프로토콜을 제공하며, 이는 기존 폐쇄 시스템 CNS 손상 장치의 일부 제한 사항을 해결합니다. 이 시스템은 비용 효율성과 최소한의 설정 시간을 제공할 뿐만 아니라 매우 다재다능하여 윤리적 문제를 최소화하고 임상적 관련성을 극대화하면서 일관되고 재현 가능한 결과를 제공합니다. 또한 쥐 모델에서 다양한 폐쇄 시스템 CNS 손상을 생성하는 시스템의 능력과 향후 연구에서의 잠재적 응용 프로그램에 대해 설명합니다. 특히, 이 원고의 목표는 연구자가 특정 요구에 맞게 이 시스템을 쉽게 획득, 적응 및 확장할 수 있는 프레임워크를 제공하여 CNS 외상에 대한 지속적인 연구를 발전시키는 것입니다. 축삭 외상을 유발하는 시스템의 효능을 보여주는 대표적인 결과도 제시됩니다.

프로토콜

모든 절차는 밴더빌트 대학의 29,30,31,32 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜과 AAALAC(Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care) 및 ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology)의 지침에 따라 수행되었습니다. 모든 마우스는 12시간 밝음/어두운 주기로 집단 수용되고 유지되었으며 음식과 물을 자유롭게 제공했습니다. 이 프로토콜에는 3개월 된30,31,33 C57 Bl/6 마우스가 사용되었습니다.

1. 시스템 구축

  1. 공기 압력 조절기가 통합된 시중에서 판매되는 페인트볼 총( 재료 표 참조)을 구하십시오.
  2. 필요한 경우 배럴(그림 1A)을 수정합니다.
    1. 원래 배럴에 길이를 따라 개구부나 천공이 있는 경우 압축 공기가 누출되어 공기 중으로 분산되어 최대 출력 압력 수준이 감소할 수 있습니다. 출력 압력 범위를 늘리기 위해 단단하고 구멍이 없는 배럴을 구입하여 교체하십시오(그림 1, I).
    2. 원래 배럴이 길고 번거로운 경우 맞춤형 길이의 더 짧은 배럴을 구입하거나 파이프 절단기 또는 톱을 사용하여 배럴을 줄이십시오.
    3. 원래 배럴이 원하는 출력 압력 수준을 생성하지 않으면 사용자 정의 보어 직경을 가진 배럴을 구입하여 배럴의 내부 지름(보어 크기)을 수정하십시오. 원래 보어 크기의 직경을 줄이면 출력 압력 범위가 증가하고 그 반대의 경우도 마찬가지입니다.
  3. 필요한 경우 레귤레이터(그림 1B)를 수정합니다.
    1. 원래 레귤레이터에 가이드 캡이 있는 경우 조정 나사(그림 1, II)에 직접 접근할 수 있도록 가이드 캡을 제거합니다.
    2. 원래 조정 나사가 육각 소켓과 함께 제공되는 경우 육각 소켓 나사를 납작 머리 소켓 나사로 교체하십시오.
  4. 표준 중력 공급 로더(즉, 페인트볼을 잡고 건에 공급하기 위한 저장소)를 제거하고 압력 누출을 방지하기 위해 수직 공급 튜브(그림 1, III)를 밀봉합니다.
    1. 중력 공급 로더를 제거하기 전에 페인트볼 건이 장전되지 않고 공기 공급원(CO2 또는 압축 공기 탱크)이 분리되어 있는지 확인하십시오.
    2. 중력 피드 로더가 부착된 피드 넥(그림 1C)을 찾습니다. 피드 넥 cl을 풉니다.amp 적절한 도구를 사용합니다.
    3. 표준 중력 피드 로더를 위쪽으로 당겨 제거합니다.
    4. 피드 넥 커버 또는 플러그를 삽입하여 개구부를 밀봉합니다. 이들은 일반적으로 페인트볼 매장이나 온라인에서 구할 수 있으며 피드 넥에 꼭 맞도록 설계되어 밀봉됩니다.
  5. 페인트볼 총을 위한 플랫폼(그림 1D)과 x-y 동물 위치 지정 테이블을 조립합니다.
    1. 중간 밀도의 섬유판 두 조각을 절단하여 플랫폼 베이스를 구성합니다.
      알림: 재료 가용성과 선호도에 따라 대체 재료(예: 합판)도 사용할 수 있습니다.
    2. 1.5 x 1.5피트 크기로 더 작은 정사각형 조각을 자릅니다.
    3. 2.5 x 1.5피트 크기로 더 큰 직사각형 조각을 자릅니다.
    4. 두 개의 평행한 2 x 4 s를 사용하여 더 큰 플랫폼에서 3.5인치 위로 작은 플랫폼을 들어 올리고 고정합니다.
  6. 개조된 페인트볼 총을 플랫폼에 고정합니다.
    1. 페인트볼 총을 더 작은 플랫폼에 옆으로 눕혀 배럴의 끝이 가장자리 위로 반 인치 확장되도록 합니다.
    2. 페인트볼 총의 배럴과 스톡에 맞는 장착 브래킷 또는 클램프를 사용하여 페인트볼 총을 고정합니다.
    3. 압축 공기 탱크(그림 1E, 재료 표 참조)를 페인트볼 건의 조절기에 부착합니다. 또는 압축된 질소 탱크에서 직접 압력 라인을 연결하여 신뢰할 수 있는 출력 압력 수준의 범위를 늘립니다.
    4. 압축 공기 탱크를 사용하는 경우 내구성이 뛰어난 패브릭 스트랩으로 섬유판에 고정하십시오. 나사나 볼트로 스트랩을 부착하고 쉽게 조이고 풀 수 있는 조정 장치가 포함되어 있습니다.
  7. 나사나 볼트를 사용하여 페인트볼 건의 배럴 맞은편에 있는 더 큰 직사각형 섬유판 조각에 xy 포지셔닝 테이블을 고정합니다(그림 1F).
    알림: x-y 스테이지라고도 하는 x-y 포지셔닝 테이블( 재료 표 참조)은 온라인 소매업체, 산업 공급업체 및 과학 장비 공급업체를 포함한 다양한 공급업체에서 구입할 수 있습니다. x-y 포지셔닝 테이블을 구입할 때는 이동 범위, 하중 용량, 정밀도 및 수동 조정 또는 전동 제어 중에서 선택할 수 있는 사항을 고려하십시오. 이 x-y 포지셔닝 테이블을 사용하면 x축(배럴을 향해 수평으로 또는 배럴에서 멀어짐)과 y축(배럴에서 수직으로 위 또는 아래)의 두 축을 따라 동물을 정확하게 이동하고 배치할 수 있습니다.
  8. 3개의 PVC 클램프를 설치하여 x-y 포지셔닝 테이블을 수정합니다.
    1. 나사나 볼트를 사용하여 배럴 전면 양쪽에 1cm 두께의 PVC 클램프 2개를 고정합니다. 클램프는 1.9 및 1.10 단계의 동물 홀더를 수용할 수 있을 만큼 충분히 넓습니다(예: 1.5인치).
    2. 더 두꺼운(4cm) PVC cl을 고정amp 나사나 볼트를 사용하여 두 개의 1cm 두께의 클램프와 수직으로 반대쪽입니다. 클램프가 2.4단계의 압력 변환기를 수용할 수 있을 만큼 충분히 넓습니다(예: 1.5인치).
    3. 세 번째 클램프 상단에 두 개의 구멍을 뚫고 2단계에서 시스템 교정 중에 압력 변환기를 추가로 안정화하기 위해 두 개의 플라스틱 나사를 삽입합니다.
  9. 동물 홀더 내부를 사용자 정의합니다(그림 2A).
    1. 마우스용 내부 격리실용 PVC 튜브 조각(외경 35mm, 내경 26mm, 길이 6.75인치)을 구입하여 자릅니다.
    2. 튜브 끝에서 3인치 떨어진 곳에 직사각형 모양의 구멍(5 x 1cm)을 만들어 몸의 나머지 부분은 차폐된 상태로 마우스의 머리와 뒷어깨 위쪽을 노출시킵니다.
      알림: CNS 손상 부위가 쥐의 등에서 아래쪽(예: 흉추 또는 요추)인 경우 직사각형 구멍을 더 크게 만드십시오.
  10. 동물 홀더의 외부를 사용자 정의합니다(그림 2B).
    1. 마우스의 외부 격리 챔버용 PVC 튜브(외경 44mm, 내경 35mm, 길이 6인치)를 구입하여 자릅니다.
    2. CNS 손상 부위를 정밀하게 제어하기 위해 외부 격납실 내에 노출 구멍(그림 2C)을 구축합니다.
    3. 2단계에서 시스템 교정 중에 압력 변환기의 배럴을 삽입하기 위해 반대쪽에 역수 구멍을 만듭니다(예: 9mm 구멍).
  11. 가스 마취 전달을 수용할 수 있도록 동물 홀더의 외부를 수정합니다. 주사 가능한 마취제를 대신 사용할 경우 이 단계를 건너뜁니다.
    1. 동물 홀더 외부의 한쪽 끝을 테이프로 밀봉합니다. 가스 누출을 방지하기 위해 단단히 끼워지십시오.
    2. 씰에 작은 구멍을 만들어 마취선을 삽입합니다.
    3. 동물과 직접 접촉하지 않고 이소플루란을 튜브 환경에 도입할 수 있도록 마취 라인을 배치합니다.

2. 시스템 캘리브레이션

  1. 압력 트랜스듀서(그림 2D, 옵션은 재료 표 참조)를 데이터 수집(DAQ) 시스템 및 컴퓨터에 연결하여 물리적 압력 판독값을 디지털 데이터로 변환합니다.
    1. 압력 트랜스듀서를 DAQ 모듈에 연결하여 ( 재료 표 참조) 적절한 극성과 안전한 연결을 보장합니다.
    2. DAQ 모듈을 DAQ 섀시에 삽입하여 전원을 공급받고 컴퓨터와 통신할 수 있도록 합니다.
    3. USB 케이블을 사용하여 DAQ 섀시를 컴퓨터에 연결합니다.
    4. 컴퓨터에 DAQ 하드웨어와 인터페이스하고 데이터를 수집하는 데 필요한 소프트웨어와 드라이버가 설치되어 있는지 확인하십시오 (옵션은 자료 표 참조).
  2. DAQ 시스템 설정을 구성합니다.
    1. 설치된 DAQ 소프트웨어를 엽니다.
    2. DAQ 시스템이 컴퓨터에서 인식되는지 확인하십시오.
    3. 특정 DAQ 모듈/섀시 및 압력 트랜스듀서에 대한 사양 및 교정 데이터시트를 참조하고 DAQ 시스템 설정을 구성하십시오.
      참고: 이 원고에 사용된 DAQ 하드웨어의 DAQ 설정은 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 관심 있는 독자는 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON 에서 저장소에 액세스할 수 있습니다.
      1. 아날로그 입력: 압력 트랜스듀서가 연결된 DAQ 모듈의 물리적 입력 채널을 선택합니다.
      2. 여기 소스 (Vex 소스): DAQ 모듈의 여기 소스(예: 내부 또는 외부)를 지정합니다.
      3. 여기 전압(Vex 값): vex 값을 압력 변환기 제조업체에서 지정한 값(예: 5 또는 10V)으로 설정합니다.
      4. 브리지 유형: DAQ 모듈의 적절한 브리지 유형(예: 풀 브리지, 하프 브리지 또는 쿼터 브리지)을 선택합니다.
      5. 브리지 저항: 브리지 저항을 압력 변환기 제조업체에서 지정한 값(예: 350)으로 설정합니다.
      6. Calibration factor/Custom scaling(교정 계수/맞춤형 스케일링): 압력 트랜스듀서 제조업체에서 제공한 교정 데이터시트를 기반으로 스케일링을 구성합니다. 제조업체는 알려진 물리적 단위(psi)를 적용하고 결과 생성된 전기 단위(mV/V)를 측정하여 압력 변환기를 보정합니다. 얻어진 전기 단위에 대해 알려진 물리적 단위를 플로팅하여 교정 곡선을 생성합니다.
      7. 샘플링 속도(Hz): 앨리어싱 없이 압력 변화의 역학을 캡처할 수 있을 만큼 충분히 높은 샘플링 속도를 설정합니다(예: 실험의 압력 변화 속도에 따라 1 또는 10kHz).
        알림: 과압 공기 파형이 좁을수록(즉, 압력이 더 빠르게 변할수록) 여기되는 주파수 범위가 넓어지므로 s가 더 높아져야 합니다.amp링 속도가 필요합니다. 이는 압력 변화가 빠르게 발생할 수 있는 CNS 손상 모델과 관련된 실험에서 특히 중요합니다.
  3. DAQ 소프트웨어에서 데이터 수집을 위한 디지털 도구를 생성합니다.
    알림: 이 디지털 도구는 시스템의 출력 압력을 정확하게 측정, 기록, 표시 및 분석하는 데 사용됩니다. 이 원고에 사용된 디지털 도구는 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 관심 있는 독자는 다음 위치에서 저장소에 액세스할 수 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. 신호 처리 알고리즘을 구현하여 트랜스듀서의 원시 데이터를 필터링, 증폭 또는 처리할 수 있습니다.
    2. 분석 도구를 추가하여 최고 압력, 평균 압력 및 압력 이벤트 기간과 같은 메트릭을 계산할 수 있습니다.
    3. 시각적 요소(예: 그래프)를 통합하여 실시간 압력 데이터를 표시하고 제어 요소를 통합하여 데이터 수집을 시작, 중지 및 재설정합니다.
    4. 디지털 도구를 저장합니다.
  4. 시스템의 출력 압력 측정
    1. 압력 변환기를 두꺼운 cl에 삽입합니다.amp x-y 테이블과 동물 홀더의 구멍을 통한 배럴(1.10.3단계에서 생성).
    2. 팁이 CNS 손상 부위의 위치에 정확히 올 때까지 압력 변환기의 배럴을 조정합니다.
    3. 두 개의 플라스틱 나사(1.8.3단계에서 설치됨)로 압력 변환기를 고정합니다.
  5. 페인트볼 건의 방아쇠를 놓으면서 데이터 수집 소프트웨어에서 디지털 도구를 실행하여 시스템의 출력 압력을 캡처, 분석 및 시각화합니다.
  6. 시스템의 출력 압력이 원하는 수준에 도달할 때까지 조정 나사를 조정합니다.
    참고: 페인트볼 총의 배럴을 비페스트레이트, 길이 1.5인치, 직경 6.5mm로 수정한 후, 시스템은 배럴(34)의 전면에서 5mm에서 15-50psi 범위의 과압 공기 수준을 안정적으로 전달할 수 있습니다. 15psi 미만 및 50psi 이상의 과압 공기 수준은 강도에서 큰 변동성을 나타냅니다. 입력 압력(psi), 배럴로부터의 거리(cm) 및 시간(ms)의 함수로 시스템의 출력 압력(psi)을 포괄적으로 표시하려면 Hines-Beard et al.34의 그림 2를 참조하십시오. 이 시스템을 사용하여 50psi 이상의 과압 공기 수준을 안정적으로 얻으려면 압축 공기 대신 압축 질소를 사용하십시오.

3. 동물 준비 및 과압 공기 노출

  1. 산소가 완전히 진정될 때까지 산소에 1.5-3%30,31,32,33 이소플루란이 있는 유도 챔버에서 이소플루란으로 마우스를 마취합니다.
    1. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없는지 평가하여 마취를 확인합니다.
    2. 생쥐를 직사각형 개구부를 통해 머리와 위쪽 뒷어깨가 노출된 상태로 내부 동물 홀더에 고정하고 등쪽과 아래쪽 뒷다리는 차폐된 상태로 유지합니다.
    3. 내부 동물 홀더의 손상되지 않은 아래쪽 부분에 부착된 쿠션으로 쥐의 머리를 지지합니다.
    4. 위쪽 뒷어깨에 수술용 테이프를 붙여 마우스를 고정합니다.
    5. 내부 동물 홀더를 외부 동물 홀더에 삽입합니다.
    6. 동물 홀더 내부에 이소플루란을 전달하기 위해 2차 마취 라인을 엽니다.
    7. 동물 홀더 끝에 추가 쿠션을 놓아 튜브에서 마취제가 누출되는 것을 방지하고 과도한 압력의 공기에 노출되는 동안 마우스가 움직이지 않도록 합니다.
  2. 과압 공기 공급
    1. 바깥쪽 동물 홀더의 4mm 원형 조리개를 마우스의 왼쪽 눈 바로 위에 맞춥니다.
    2. x-y 테이블의 제어 손잡이를 사용하여 동물 홀더의 조리개가 페인트볼 총의 배럴과 정렬되고 외부 표면이 배럴 끝에서 5mm 떨어지도록 배치합니다.
      알림: 배럴 끝에서 동물의 거리를 조정하여 과압 공기 수준(psi)과 모양을 변경합니다. 동물을 배럴에서 더 멀리 이동하여 과압 공기 수준을 낮추고 더 확산된 과압 기파를 만듭니다.
    3. ITON을 유도하기 위해 과압 공기 시퀀스를 시작합니다.
      1. 15일 동안 매일 0.5초 간격으로 29,30,31,32초 간격으로 29,30,31,32psi 과압 공기를 두 번 전달합니다.
        참고: 유사한 ITON은 0.5초 간격(23)으로 분리된 15psi 과압 공기의 3회 연속 파열을 통해 유도될 수 있습니다. 0.5초 간격으로 분리된 15psi 과압 공기가 6회 연속으로 전달된 후 발생하는 ITON의 정도는 대표 결과에 나와 있습니다.
      2. 구멍이 더 이상 배럴을 향하지 않도록 동물 홀더를 돌려 과압 공기 자체가 아닌 과압 공기 소음에 가짜 쥐를 노출시키고 판지 실드로 공기를 차단하십시오.
  3. 마우스 복구
    1. 쥐가 마취에서 회복되도록하십시오.
      1. 마취로 인해 눈이 건조해지는 것을 방지하기 위해 윤활제 점안액( 재료 표 참조)을 투여합니다.
      2. 제어된 난방 지지대를 사용하여 따뜻함을 제공하십시오( 재료 표 참조).
    2. 쥐가 직립 자세를 유지하고 정상적으로 걸을 때까지 육안으로 모니터링합니다. 그들이 케이지 동료와 함께 있을 수 있도록 허용하십시오.
    3. 체중 감소를 방지하기 위해 부상 후 처음 3일 동안 과압 공기에 노출된 모든 마우스에게 젤 회수 식품( 재료 표 참조)을 제공하십시오.

4. 조직 수집 및 처리

  1. Avertin Working Solution의 복강 내 주사를 통해 마우스를 안락사시킵니다.
    1. 10g의 2,2,2,-트리브로모에탄올( 재료 표 참조)과 10mL의 1-펜탄올( 재료 표 참조)을 혼합하여 Avertin 스톡을 만듭니다. 4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
    2. 50mL 튜브에 Avertin Stock 1.25mL, 이중 증류수 45mL, 10x PBS 5mL( 재료 표 참조)를 결합하여 Avertin Working Solution을 만듭니다. 여과기를 사용하여 혼합물을 멸균하고 4 °C의 어두운 곳에 보관하십시오.
  2. 1x PBS(재료 표 참조)에서 4% 파라포름알데히드( 재료 표 참조)를 마우스에 심경 관류합니다( 재료 표 참조).
  3. 미세한 겸자( 재료 표 참조)와 가위( 재료 표 참조)를 사용하여 과도한 압력에 노출된 눈을 절삭하여 시신경을 보존합니다(ON).
  4. 추가 분석을 위해 적출된 눈 조직과 함께 ON을 수집합니다.
  5. 조직에 진동시킵니다.
    1. 1x PBS에서 4% 파라포름알데히드 및 2% 글루타르알데히드( 재료 표 참조)에 밤새 조직을 붙입니다. 관류되지 않은 조직으로 작업하는 경우(4.2단계에서와 같이) 하룻밤이 아닌 5일 동안 후미를 붙입니다.
    2. 페인트브러시(재료 표 참조) 또는 날카로운 나무 막대기를 사용하여 1x PBS가 있는 12웰 또는 24웰 플레이트(재료 표 참조)에 ON 조직을 옮깁니다.
    3. 흄 후드에서 0.2M 카코다일레이트 완충액에서 1xPBS를 2% 오스뮴 테트라옥사이드( 재료 표 참조)로 교체합니다(레시피는 GitHub에서 공개적으로 사용 가능). 관심 있는 독자는 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON)에서 이송 피펫을 사용하여 저장소에 액세스할 수 있습니다. 얼음 위에서 2시간 동안 배양합니다.
    4. 1x PBS로 3회 세척 수행
      1. 오스뮴 폐기물을 적절하게 버리십시오.
      2. 세 번째 PBS 세척 후 2박 동안 플레이트를 흄 후드에 그대로 두십시오.
  6. 등급이 매겨진 에탄올 시리즈에서 ON 조직을 탈수합니다.
    1. 신경을 50% 에탄올이 든 새 플레이트로 옮기고 30분 동안 배양합니다.
    2. 70% 에탄올로 30분 동안 교체합니다.
    3. 95% 에탄올로 30분 동안 교체합니다.
    4. 100% 에탄올로 30분 동안 교체합니다.
  7. 에폰에 ON 티슈를 삽입합니다.
    참고: Epon 레시피는 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 관심 있는 독자는 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON 에서 저장소에 액세스할 수 있습니다. 레시피에 나열된 재료에 대해서는 재료 표를 참조하십시오.
    1. 1일차: 프로필렌 옥사이드( 재료 표 참조)/100% 에탄올(1:1)이 든 2mL 바이알에 조직을 옮기고 실온에서 30분 동안 흔듭니다. 순수한 프로필렌 옥사이드로 교체하고 한 번 반복하여 15분 동안 흔듭니다. 프로필렌 옥사이드/에폰(1:1)으로 교체하고 추운 방에서 하룻밤 동안 흔들어 줍니다.
    2. 2일차: 조직을 100% 에폰이 있는 12웰 또는 24웰 플레이트로 옮기고 실온에서 4시간 동안 흔듭니다. 신선한 100% 에폰으로 교체하고 진공 상태에서 실온에서 밤새 배양합니다.
    3. 3일차: 2일차와 같이 에폰 배양을 반복합니다.
    4. 4일차: 100% 에폰이 함유된 평평한 틀에 조직을 옮기고 조직의 방향을 바꾼 다음 60°C 오븐에 48시간 동안 넣습니다.
  8. 단면도 ON 티슈.
    1. 해부 스코프 아래의 금형을 신경이 중앙에 있는 이중 피라미드로 자릅니다.
    2. 초박편절편기와 다이아몬드 나이프를 사용하여 700nm 두께의 단면을 수집합니다( 재료 표 참조).
    3. 증류수를 사용하여 하전된 백색 유리 현미경 슬라이드의 단면을 수집합니다.
    4. 물이 증발할 때까지 60°C 오븐에서 건조시킵니다. 실온에서 식히십시오.
  9. 티슈를 염색합니다.
    1. 메탄올과 2-프로판올의 1:1 혼합물에 1% 파라페닐렌디아민(PPD)( 재료 표 참조)에 슬라이드를 28분 동안 담그십시오.
    2. 1:1 메탄올( 재료 표 참조)과 2-프로판올( 재료 표 참조)의 두 가지 연속 혼합물로 슬라이드를 각각 1분 동안 헹굽니다.
    3. 슬라이드를 100% 에탄올로 1분 동안 헹구고 자연 건조시킵니다.
    4. 슬라이드를 습한 상자에 넣고 전사 피펫을 사용하여 1% 톨루이딘 블루( 재료 표 참조)로 섹션을 덮습니다.
    5. 60°C 오븐에서 20분 동안 배양합니다.
    6. 이중 증류수로 슬라이드를 헹구고 자연 건조시킵니다.
  10. 티슈에 장착하고 이미지화합니다.
    1. 장착 매체를 사용하여 커버슬립을 슬라이드(방법 표 참조)하고 초과 매체를 제거합니다.
    2. 슬라이드를 밤새 말리십시오.
    3. 100x 오일 이멀젼 대물렌즈와 함께 Brightfield microscopy를 사용한 단면 이미지.
  11. 망막 조직을 삽입, 절편 및 면역조직화학적으로 염색합니다.
    1. 눈 전체를 4% 파라포름알데히드에 2-4시간 동안 붙입니다.
    2. 30% 자당으로 전체 눈 조직을 냉동 보호합니다(4°C에서 하룻밤 동안 1x PBS의 재료 표 참조).
    3. 눈 조직을 냉동 매체에 삽입합니다( 재료 표 참조).
    4. 저온 유지 장치에서 10μm 두께의 망막 단면을 수집하고 하전된 백색 유리 현미경 슬라이드에 단면을 장착합니다( 재료 표 참조).
    5. 슬라이드를 1x PBS로 세척하고 차단 완충액(1x PBS에서 5% Triton X-100 및 2% 소 혈청 알부민(BSA)( 재료 표 참조))과 5% 일반 당나귀 혈청(NDS)( 재료 표 참조)에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
    6. 1차 항체(재료 표 참조)를 1xPBS(PBT)의 0.5% Triton X-100(재료 표 참조)에 넣고 4°C(또는 실온에서 4시간 동안)에서 밤새 슬라이드를 배양합니다.
    7. PBT에서 슬라이드를 세척하고 5% NDS가 있는 차단 완충액에서 2차 항체( 재료 표 참조)에 배양합니다.
    8. PBT로 슬라이드를 세척하고, DAPI( 재료 표 참조)로 장착 매체를 적용하고, 커버슬립을 적용하고, 매니큐어로 밀봉합니다.
    9. epifluorescence microscope의 이미지 슬라이드.
    10. 형광 강도를 정량화하는 경우 동일한 배율, 게인 및 노출 설정으로 동일한 망막 영역에서 이미지를 촬영했는지 확인하십시오.
  12. 축삭돌기를 세십시오.
    1. 축삭 밀도(축삭돌기/mm2)를 추정하기 위해 고정 그리드 오버레이를 사용하여 전체 신경 단면적의 20%를 샘플링하여 이미지 분석 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 축삭 수를 수동으로 계산합니다.
    2. ON 단면의 면적을 측정합니다.
      1. Set Scale 기능을 사용하여 이미징에 사용되는 대물렌즈의 픽셀/미크론을 설정합니다.
      2. Polygon selection 도구를 사용하여 혈관 조직을 제외한 시신경의 수초를 따라 추적합니다.
      3. Measure 기능을 사용하여 ON의 면적을 측정합니다.
      4. 측정된 면적에 20을 곱하여 전체 면적의 0.2%를 결정합니다.
    3. 고정 그리드를 ON 횡단면에 오버레이합니다.
      1. Counting Array 플러그인을 다운로드합니다.
        참고: 이 플러그인은 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 관심 있는 독자는 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON 에서 저장소에 액세스할 수 있습니다.
      2. Counting Array 플러그인을 열어 더하기 기호 형태로 균일한 간격의 사각형 모양 9개로 구성된 횡단면 위에 고정 그리드를 오버레이합니다.
      3. ON 횡단면의 전체 면적의 20%(4.6.2.4단계에서 계산)를 9로 나누어 9개 영역 각각에 대한 면적을 편집합니다.
      4. 더하기 기호의 중심이 ON 횡단면의 중앙에 오도록 고정 그리드를 가운데에 맞춥니다.
    4. 살아있는 축삭돌기와 퇴화하는 축삭돌기를 별도로 계산합니다.
      1. Cell Counter 플러그인을 다운로드하여 엽니다.
        참고: 이 플러그인은 GitHub에서 공개적으로 사용할 수 있습니다. 관심 있는 독자는 https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON 에서 저장소에 액세스할 수 있습니다.
      2. 9개 영역 각각에 대해 미엘린 수초의 상태를 시각화하여 살아있는 축삭돌기 프로필과 퇴화하는 축삭 프로필의 수를 개별적으로 계산합니다. 편향을 피하기 위해 동물의 실험 그룹에 대해 맹검된 상태에서 축삭 정량화가 수행되는지 확인합니다.
      3. 살아있는 축삭의 경우, 수초가 손상되지 않고 균일하게 염색되어 있으며 축삭 주위를 부드럽고 균일하게 둘러싸고 있는 것을 찾으십시오.
      4. 축삭돌기가 퇴화하는 경우, 수초가 두꺼워지거나, 양파가 생기거나, 붕괴되는 축삭돌기를 찾으십시오.
      5. 축삭이 오버레이된 그리드에 의해 부분적으로 차단된 경우 루멘이 보이는 경우에만 축삭 수에 포함하십시오.
      6. 직사각형 축삭이 실수로 두 번 이상 계산되지 않도록 하고 파편이나 먼지를 퇴행하는 축삭 프로필로 착각하지 마십시오.
    5. 통계 분석을 수행하여 그룹 간의 평균 축삭 수에서 유의한 차이를 검정합니다. 이전 분석에서 관찰된 정상 변동성을 설명하기 위해 각 그룹에 최소 4개의 ON이 포함되어 있는지 확인합니다.
      1. 독립 표본 t-검정(독립 표본에 대한 스튜던트 t-검정이라고도 함)을 수행하여 두 독립 그룹의 평균 간에 유의한 차이를 평가합니다.
      2. 독립 표본 t-검정의 조건을 충족할 수 없는 경우(즉, 데이터가 정규 분포를 따르지 않거나 표본 크기가 너무 작은 경우) 비모수 대안인 Mann-Whitney U 검정을 수행합니다.

결과

본 명세서에 기술된 과압 공기 생성 시스템을 사용하여, 성인(3개월) 수컷 C57Bl/6 마우스(n=4)의 왼쪽 눈을 0.5초 간격으로 분리된 15psi 과압 공기의 6회 연속 파열에 노출시킴으로써 간접 외상성 시신경병증(ITON)을 유도하였다. 가짜 동물(n = 8; Vest et al.33에서 가져온 데이터)을 마취하고, 동물 홀더에 넣고, 소리에 노출시켰지만 과압 공기에는 노출시키지 않았다.

가짜 동물의 근위 시신경(그림 3A)은 정상적인 형태와 분포를 가진 신경교세포(glial cell)로 둘러싸인 조밀하고 균일한 크기의 축삭돌기(axons)로 건강해 보였다. 이에 비해, ITON에 노출된 마우스의 근위 시신경(즉, 0.5초 간격으로 분리된 15psi 과압 공기의 6회 연속 파열)(그림 3B)은 남아있는 축삭 사이의 간격 증가, 팽창을 포함한 축삭 퇴행의 징후, 축삭 모양의 불규칙성, 축삭의 미엘린 수초의 파괴와 같은 축삭 손실의 징후와 함께 퇴행하는 것으로 나타났습니다. 신경교세포의 비대와 증식을 포함한 신경교증의 징후. Mann-Whitney U 테스트는 ITON과 가짜 마우스 간에 총 축삭돌기(p =0.0040)(그림 3C)와 퇴행성 프로필(p =0.0028)(그림 3D)에서 유의한 차이를 확인했습니다. 이러한 결과는 ITON이 총 축삭돌기를 현저히 감소시키고 퇴행성 프로파일을 현저하게 증가시킨다는 것을 시사합니다. Mann-Whitney U 검정은 ITON 그룹의 데이터가 독립 표본 t-검정을 수행할 만큼 충분히 큰 표본 크기를 가지고 있지 않기 때문에 수행되었습니다.

미세아교세포(중추신경계의 주요 면역 세포)에 대한 마커인 anti-Iba1( 재료 표 참조)을 사용한 망막 단면의 면역조직화학적 염색을 가짜 마우스(그림 4A) 및 ITON(그림 4B) 마우스 모두에서 수행했습니다. 염색 결과 미세아교세포는 모든 마우스에서 휴지 상태에 있었으며, 길고 얇으며 파급력이 높은 돌기를 가진 작은 세포체가 특징이었습니다. 특히, ITON 마우스에서 미세아교세포의 수가 증가한 것으로 나타났으며(그림 4B), 이는 부상에 대한 반응으로 미세아교세포가 증식하고 있음을 시사합니다. 또한 ITON 마우스에서 미세아교세포가 광수용체 세포체가 있는 외부 핵층(ONL)으로 비정상적으로 확장되는 것이 관찰되었습니다(그림 4B). 이는 미세아교세포층(GCL), 내망상층(IPL), 내핵층(INL) 및 외망상층(OPL)에 국한된 가짜 동물(그림 4A)과 대조됩니다.

항-PKC-α( 재료 표 참조) 및 항-시냅토피신(anti-synaptophysin)( 재료 표 참조)을 사용한 후속 면역조직화학적 염색, 간상 양극성 세포 및 광수용체 리본 시냅스에 대한 마커는 가짜(그림 5A)와 ITON 마우스(그림 5B) 모두에서 온전한 시냅스 연결을 보여주었습니다. 특히, 간상 양극성 세포의 수상돌기가 간상 광수용체의 시냅스 말단과 확장되고 겹치는 것이 관찰되었습니다. 이 발견은 초기 연구35와 대조를 이루는데, 이 연구는 3일 동안 매일 한 번 15psi의 과압 공기(0.5초 간격)를 두 번 연속으로 파열한 후 ITON 4주 후에 막대 양극성 세포 수상돌기가 세포체 쪽으로 수축하는 것을 보여주었습니다. 이러한 차이는 두 연구 간의 조직 채취 시점이 다르기 때문일 수 있습니다. 현재 샘플은 이전 연구에서 ITON 4주 후와 비교하여 ITON 2주 후에 수집되었습니다. 현재 분석에서 시냅토병증은 검출되지 않았지만 광수용체 세포체가 위치한 ONL(그림 4B)로 미세아교세포 과정이 확장되는 것에 주목했습니다. 이 관찰은 양극성 세포와 광수용체 사이의 시냅스 연결 중단이 손상의 2차 효과로 나타날 수 있음을 시사하며, 축삭 손실, 축삭 변성 및 신경교증이 손상의 주요 영향을 구성한다는 것을 시사합니다.

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그림 1: 국소, 폐쇄 시스템 중추 신경계 손상에 대한 시스템. 위쪽 이미지의 파선 사각형은 확대되어 아래 두 이미지에서 B, C 및 A로 표시됩니다(흰색 화살표로 표시). (A) 페인트볼 건 끝에 있는 맞춤형 1.5인치, 비천공 배럴(I). (B) 조정 나사(II)를 노출시키기 위해 가이드 캡이 제거된 압력 조절기. (C) 중력 피드 로더가 제거되고 피드 넥 커버가 설치된 피드 넥 (III). (D) 더 큰 2.5피트 x 1.5피트 섬유판 조각 위로 올라간 1.5피트 x 1.5피트 섬유판 조각으로 구성된 기본 플랫폼. (E) 페인트볼 건의 압력 조절기에 연결되고 내구성 있는 스트랩을 사용하여 섬유판 플랫폼에 고정된 압축 공기 탱크. (F)x-y 동물 포지셔닝 테이블. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 과압 공기의 초점 전달을 위한 맞춤형 동물 홀더. (A) 동물의 머리와 뒷어깨 위쪽이 노출되도록 직사각형 모양의 구멍(3 x 5cm)이 있는 좁은 PVC 튜브로 구성된 동물 홀더 내부. (B) 더 좁은 PVC 튜브가 밀어 들어가는 더 넓은 PVC 튜브로 구성된 동물 홀더 외부는 노출 조리개 내에서 노출된 조직을 제외하고 동물의 몸 전체를 차폐합니다. (C) 관심 CNS 손상 부위에 과압 공기를 국소적으로 전달하기 위한 노출 조리개. (D) 시스템의 출력 압력을 교정하기 위한 압력 변환기. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: 과압 공기의 초점 전달로 인한 ITON. (ᅡ,ᄂ) (A) sham 및 (B) ITON의 근위 시신경 단면에 대한 대표적인 명시야 현미경 사진. (C) 총 축삭 수의 정량화. (D) 퇴행성 축삭 프로파일의 정량화. ITON의 경우 n = 4입니다. n = 9 - 가짜. 가짜 그룹에 대한 축삭 수 데이터는 Vest et al.33에서 가져왔습니다. **p < 0.005. 오차 막대는 표준 편차를 나타냅니다. 스케일 바 = 20 μm. 약어: ITON = indirect traumatic optic neuropathy. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: 시스템 유도 ITON으로 인한 비정상적인 미세아교세포의 증식 및 ONL로의 이동. (A,B) (A) 가짜 및 (B) ITON 동물의 미세아교세포(빨간색)에 대한 anti-Iba1 라벨링이 있는 망막 단면의 대표적인 형광 현미경 사진. 스케일 바 = 100 μm. 약어: ITON = 간접 외상성 시신경병증; GCL = 신경절 세포층, INL = 내부 핵층, ONL = 외부 핵층. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 5: 지연된 시냅토병증의 가능성에도 불구하고 시스템 유도 ITON으로 인한 간상엽 양극성 세포와 광수용체 사이의 시냅스 연결의 조기 유지. (A,B) (A) 가짜 및 (B)의 광수용체 리본 시냅스(빨간색)의 anti-synaptophysin 표지 및 간상 양극성 세포(녹색)의 anti-PKC-α 표지를 사용한 망막 단면의 대표적인 형광 현미경 사진) ITON 동물. 스케일 바 = 100 μm. 약어: ITON = 간접 외상성 시신경병증; PKC = protein kinase C. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 맞춤형 과압 공기 시스템은 쥐 모델에서 폐쇄 시스템 CNS 손상을 연구하는 데 유용한 도구입니다. 예시 실험의 대표적인 결과는 이 시스템을 사용하여 과압 공기의 초점 전달이 ITON을 효과적으로 유도하여 상당한 축삭 손실 및 퇴행을 초래할 수 있음을 보여줍니다. 이는 정확하고 재현 가능한 CNS 손상을 생성하는 시스템의 능력을 강조합니다.

이 시스템의 주요 강점 중 하나는 다양한 CNS 손상을 유발할 수 있는 사용자 정의 가능성입니다. 부상의 심각성은 시스템의 전체 출력 압력, xy 포지셔닝 스테이지를 사용하여 배럴 끝에서 동물까지의 거리, 노출 조리개의 크기 및 모양, 과압 공기에 대한 노출 횟수 및 노출 간격을 수정하여 조정할 수 있습니다. 또한, 중추신경계 손상의 위치는 동물 홀더 내의 노출 조리개 위치를 수정하여 조정할 수 있습니다. 이러한 다양성을 통해 이 시스템은 쥐 모델에서 다양한 폐쇄 시스템 CNS 손상을 생성할 수 있었습니다. 초기에 이 시스템은 면역 체계 반응37, 균주 특이적 결과(38) 및 신경 보호제(39)의 효능을 포함하여 전방 및 후방 극 손상 및 관련 결함(34,36)에 초점을 맞춘 폐쇄구 손상을 모델링하는 데 사용되었습니다. 결국, 이 응용 프로그램은 간접 외상성 시신경병증(ITON)30을 모델링하고 반복 노출 사이의 횟수와 간격의 효과를 탐색하기 위해 반복적인 눈 방향 노출의 후유증을 평가하기 위해 확장되었습니다33. 그 이후로, 이 시스템의 적용은 머리 지향 노출(head-directed exposures)40,41을 통한 폐쇄형 머리 경미한 외상성 뇌 손상(mTBI)과 등방향 노출(dorsum-directed exposures) 42을 통한 폐쇄형 신체 척수 손상(SCI)을 모델링하는 것으로 확장되었으며, 다양한 CNS 손상 영역을 연구하는 데 있어 장치의 적응성과 다양성을 강조합니다.

이 시스템을 사용할 때 실험 결과의 재현성과 신뢰성을 보장하기 위해 부상 결과의 변동성을 최소화 하기 위한 조치를 취하는 것이 중요합니다. 주요 조치에는 일관된 압력 전달을 보장하기 위해 세 번의 노출 전후에 시스템의 출력 압력 수준을 보정하는 것이 포함됩니다. 압축 공기(34)를 사용할 때 시스템이 15psi 및 50psi 사이에서 작동할 때 변동성이 낮지만, 일관된 교정은 배터리 부족 또는 공기 부족과 같은 예기치 않은 오류를 감지하는 데 도움이 됩니다. 또한 압력파의 강도가 거리에 따라 감소하므로 일관된 과압 크기를 보장하기 위해 각 동물을 배럴 끝에서 동일한 거리에 배치하십시오. 균일한 포지셔닝은 또한 각 동물이 전파의 동일한 부분에 의해 영향을 받도록 합니다. 또한, 홀더 내에 동물을 균일하게 고정하면 특히 움직임의 위험이 있는 반복 노출 모델에서 관심 조직이 일관되게 표적화되도록 합니다. 마지막으로, 동물의 나이, 성별 및 유전적 배경의 균일성은 부상에 대한 반응에 영향을 미치기 때문에 매우 중요합니다. 예를 들어, 이 시스템을 사용한 이전 연구에서는 서로 다른 마우스 균주에 대한 눈 방향의 과압 공기의 영향을 비교하여 C57Bl/6J36, DBA/2J37 및 Balb/c38 마우스 간의 부상 반응에서 상당한 차이를 강조했습니다. DBA/2J 및 Balb/c 마우스는 C57Bl/6J 마우스에 비해 더 심각한 전극 병리, 더 큰 망막 손상, 더 높은 산화 스트레스 및 더 뚜렷한 신경염증 반응을 보였으며, Balb/c 마우스는 특히 견고하고 지속적인 손상 프로파일을 보였다38.

시스템 문제 해결
주어진 압력 게이지 설정에 대해 압력 값이 비정상적으로 낮으면 방아쇠를 5-10배 당겨 공기가 시스템과 레귤레이터를 통과하도록 하여 새 설정으로 조정되도록 합니다. 공기 탱크에 누출이 없어야 합니다. 공기 탱크의 O-링이 손상되거나 마모되지 않아야 하며 공기 탱크에 공기가 충분해야 하며 건의 배터리가 고갈되지 않아야 합니다. x-y 테이블은 배럴 끝에서 평소 위치에서 벗어나지 않아야 하며 과압 공기 노출 조리개는 건의 배럴과 정렬되어야 하며 막히지 않아야 합니다. 레귤레이터는 건의 그립에 단단히 고정되어야 합니다. 압력계의 가장 높은 설정을 사용했음에도 불구하고 압력 값이 너무 낮으면 압력계를 200psi 이상으로 증가시켜서는 안 되며 건의 속도 설정을 최대 설정으로 조정해야 합니다. 압력 설정이 일관되지 않은 경우(예: 높음에서 낮음) 공기 탱크에 공기가 충분한지, 조절기가 건의 그립에 단단히 고정되어 있는지, 공기 탱크에 누출이 없는지, 단단히 조여져 있는지, 공기 탱크의 O-링이 손상되거나 마모되지 않았는지 확인하십시오.

이 시스템의 전체 기능을 종합적으로 이해하려면 제한 사항을 인식하는 것이 중요합니다. 실험실 환경에서 실제 시나리오를 모방하는 것은 여전히 어려운 일입니다. 이 시스템은 과압 공기를 생성하지만 다양한 압력 및 온도 구배, 파편 및 반사파의 존재, 다상 특성과 같은 폭발 이벤트의 복잡한 역학을 복제하지 않습니다. 또한, Friedlander 파형("1차 폭발파")을 모방하지 않으며, 이는 날카롭고 거의 순간적인 압력 피크 이후 기준선43으로 돌아가기 전에 주변 압력 이하로 떨어지는 급격한 기하급수적 감소를 특징으로 합니다. 오히려, 이 시스템에 의해 생성된 파형은 뚜렷한 음의 위상 없이 압력의 점진적인 상승 및 하강이 있는 더 간단하고 대칭적인 프로파일을 나타냅니다(Hines-Beard et al.34의 그림 2C 참조). 다소 유리하게도, 이 파형은 폭발 및 둔기 부상의 요소를 결합합니다. 종 모양의 "압력 펄스"는 피사체에 부딪히는 "공기의 벽"과 유사한 일관된 과압 충격을 전달합니다. 그러나 파도가 전달하는 과압 공기는 폭발 부상의 주요 특성이기도 합니다. 어떤 사람들은 이 파형이 두 가지 부상 유형의 측면을 모두 포함하지만 어느 하나의 복잡성을 완전히 포착하지는 못한다고 주장할 수 있습니다. 그러나 이 일관되고 재현 가능한 "압력 펄스"는 국소 폐쇄 시스템 CNS 손상을 연구하기 위한 실험실 환경에서 통제된 실험에 이상적입니다. 우리는 이전에 부상의 초점적 특성을 보여주었습니다. 예를 들어, 한쪽 눈에 노출되어도 원발성 비강 상피 또는 뇌(44)에 손상을 일으키지 않는다. 또한, 쥐 머리의 측면으로 향하게 할 때, 뇌의 작은 영역이 영향을 받는다45. 마지막으로, ITON에 사용된 압력 레벨에서 이 시스템으로부터의 과압 공기로부터의 에너지는 짧은 시간 간격(33)으로 반복되지 않는 한 마우스에 영향을 미치지 않았다. 따라서 압력은 해롭지 않으므로 제트 엔드 힘을 복제하지 않습니다. 또한, 눈에 반복적으로 과압 공기가 노출되었음에도 불구하고 전방 눈 구조에는 영향이 없었다33. 현저한 시신경 퇴행과 시력 상실은 1분33 미만의 상호 노출 간격으로 반복적인 노출에서만 발생했다.

폐쇄 시스템 CNS 손상을 일으키기 위한 다른 실험실 장치와 비교할 때 이 시스템은 고유한 이점을 제공합니다. 과압 공기를 빠르게 연속적으로(0.5초 간격으로)33 순차적으로 전달할 수 있으며, 이는 급격한 폭발 노출이 일반적인 위험인 고위험 직업 환경의 조건을 모방합니다. 예를 들어, 훈련 및 전투 시나리오에서 군인은 자동 소총(예: M16, AK-47), 기관총(예: M2 .50 구경), 개틀링 건 및 미니건을 포함하여 빠르게 반복 발사할 수 있는 다양한 자동 화기를 사용합니다. 군대가 사용하는 느리지만 반복적인 다른 무기로는 포병, 박격포, 수류탄 및 사제 폭발물(IED)이 있습니다. 통제된 철거에 참여한 철거 작업자와 암석을 부수고 광물을 추출하기 위한 발파 작업에 참여한 광부들도 연속적으로 순차적인 폭발을 경험합니다. 마지막으로, 공압 공구, 말뚝 박는 장치 또는 강력한 충격력을 생성하는 기타 중장비를 사용하는 건설 작업자는 폭발 노출을 모방한 빠르고 반복적인 충격을 경험할 수 있습니다. 특히, 각 이벤트 사이에 광범위한 재구성 또는 재가압이 필요한 쇼크 튜브와 같은 장치에서는 과압 공기의 신속한 전달이 불가능합니다. 충격관은 파열되는 다이어프램을 사용하여 충격파를 생성하며, 파열될 때마다 다이어프램을 교체해야 합니다. 이 과정은 쇼크 튜브를 열고, 사용한 다이어프램을 제거하고, 새 다이어프램을 설치하고, 시스템이 재설정 및 재가압할 시간을 허용해야 하기 때문에 시간이 걸립니다. 따라서, 특히 급격한 폭발 반복 노출 후 중추신경계 손상을 조사하는 연구의 경우, 각 사건 사이에 광범위한 재구성 또는 재가압이 필요하지 않은 시스템이 이상적입니다.

이 변조되고 사용자 친화적이며 비용 효율적인 시스템의 향후 응용 분야는 유망합니다. 적응력이 뛰어나고 고유한 특성을 활용하는 이 시스템은 미래의 전임상 치료 연구를 위한 몇 가지 유망한 길을 열어줍니다. 빠르고 순차적인 과압 공기를 전달하는 능력은 반복적인 폭발 노출의 누적 효과를 연구하는 데 활용될 수 있으며, 이는 만성 외상성 뇌병증 및 기타 장기적인 신경 퇴행성 상태를 이해하는 데 관련이 있습니다. 또한 이 시스템은 최적의 치료 창을 결정하기 위한 신경 보호 약물의 시기 및 투여를 포함하여 폐쇄 시스템 CNS 손상을 완화하기 위한 다양한 약리학적 중재의 효과를 탐색하는 데 사용할 수 있습니다. 또한, 둔기 및 폭발 부상 메커니즘의 측면을 모방하는 시스템의 정밀도는 실제 시나리오에서 개인이 경험하는 복잡한 외상을 반영하는 포괄적인 부상 모델을 개발할 수 있도록 합니다. 이는 염증, 산화 스트레스 및 신경 세포 사멸과 같은 손상의 일반적인 전반적 측면을 다루는 다중 모드 요법의 테스트를 용이하게 할 수 있습니다. 전반적으로 이 장치는 폐쇄 시스템 CNS 손상에 대한 이해를 높이고 효과적인 치료 중재를 개발하기 위한 다재다능하고 강력한 플랫폼을 제공합니다.

공개

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 NIH NEI P30 EY008126, 재생 의학의 Potocsnak Discovery Grant, Ret. Maj. General Stephen L. Jones, MD Fund 및 Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds(VEI)의 자금 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Used to make Avertin solution 
2,2,2-tribomoethanolSigma AldrichT48402Used to make Avertin solution 
24-well plates with lidVWR76520-63424-well plate
2-Propanol Fisher ScientificA451-1 
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module National InstrumentsNI-9237DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA) Research Products International A30075BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal) Abcam ab5076Marker for microglia, Used at 1:500 concentration 
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal) Abcam ab8049Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502 Electron Microscopy Sciences10900
Cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences11652
Charcoal Filter CanisterE-Z SystemsEZ-258Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76AClear H2O 72-07-5022Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ ChassisNational InstrumentsUSB-9162DAQ chassis
Compressed AirA-L GasGSMCA300 Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G Southern BiotechMounting media with DAPI
Diamond knifeMicro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H 
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-11058Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21203Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21206Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration 
Donkey Serum Sigma Aldrich D9662NDS
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11231-30Fine forceps for whole eye enucleation 
Ethanol (200 proof) KOPTEC (Supplier: VWR) 89125-188Ethanol 
Fluoromount-G Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)00-4958-02Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic GelCovetrus72359Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia 
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200
Graduated Cylinder 1000 mLFisher Scientific08-572G
Graduated Cylinder 250 mLFisher Scientific08-572E
Graduated Cylinder 500 mLFisher Scientific08-572F
Heating pad Braintree ScientificAP-R 26EControlled heating support
High Pressure Fill StationNinja PaintballHPFSV2Used to refill pressurized air tank
ImageJNational Institutes of Health Image analysis software
Invert MiniEmpire PaintballPaintball gun
IsofluraneCovetrus29405Inhalation anesthetic
Isoflurane VaporizerVetEquip901806Animal anesthesia
Masterflex PumpCole-ParmerUsed for animal perfusion
Methanol Sigma Aldrich322415-2L 
Microscope SlidesGlobe Scientific1358WWhite glass microscope slides
NI LabVIEW National InstrumentsSoftware to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) National InstrumentsSoftware to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers National InstrumentsDriver for interacing with DAQ system 
Nikon Eclipse Ni-E microscopeNikon Instruments
Osmium tetroxide 2%Electron Microscopy Sciences19152
Paraformaldehyde 32%Electron Microscopy Sciences15714-SPFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine Sigma AldrichP6001
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044PBS diluted down to 1x
Propylene oxide Electron Microscopy Sciences20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated TankNinja PaintballPressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mLFisher Scientific06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mLFisher Scientific06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mLFisher Scientific06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal) Abcam ab32376Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration 
Resin 812Electron Microscopy Sciences14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi Honeywell 060-0708-10TJGConsider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
SucroseSigma AldrichS5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi Honeywell Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
Syringe/Needle ComboCovetrus 60728Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT CompoundFisher Scientific23-730-571 Freezing medium 
Toluidine blueFisher ScientificBP107-10
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UniSlide XY TableVelmex AXY40 SeriesXY positioning table 
University Brush - Series 233- Round, Size 000Winsor and Newton Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-08Scissors for whole eye enucleation
Virtual InstrumentNational Instruments Digital tool for data acquisition software 

참고문헌

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