Sistema para lesão do sistema nervoso central focal e fechado

Resumo

Este protocolo descreve um sistema de ar de sobrepressão personalizado projetado para induzir lesões do sistema nervoso central (SNC) do sistema fechado em camundongos, incluindo traumas oculares, cerebrais e da medula espinhal. O objetivo deste protocolo é fornecer uma estrutura para que os pesquisadores adaptem e expandam facilmente o sistema para seus estudos exclusivos de trauma do SNC.

Resumo

A prevalência de lesões do sistema nervoso central (SNC) do sistema fechado ressalta a necessidade de uma melhor compreensão desses traumas para melhorar as intervenções protetoras e terapêuticas. Cruciais para esta pesquisa são os modelos animais que replicam lesões do SNC em sistema fechado. Nesse contexto, um sistema de ar de sobrepressão personalizado foi projetado para reproduzir uma série de lesões do SNC de sistema fechado em modelos murinos, incluindo trauma ocular, cerebral e da medula espinhal. Até o momento, o sistema tem sido usado para administrar ar de sobrepressão direcionado ao olho, cabeça ou coluna para modelar lesão do pólo anteroposterior no olho, neuropatia óptica traumática indireta (ITON), lesão cerebral traumática focal e lesão da medula espinhal. Este artigo fornece um protocolo detalhado descrevendo o projeto e a operação do sistema e compartilha resultados representativos que demonstram sua eficácia. A estrutura robusta apresentada aqui fornece uma base sólida para pesquisas contínuas em trauma do SNC. Ao aproveitar os atributos flexíveis do sistema, os investigadores podem modificar e controlar cuidadosamente a localização, a gravidade e o momento dos ferimentos. Isso permite comparações abrangentes de mecanismos moleculares e eficácia terapêutica em várias lesões do SNC de sistema fechado.

Introdução

Lesões do sistema nervoso central (SNC) do sistema fechado são lesões causadas por danos ao cérebro ou à medula espinhal sem causar uma ruptura no crânio ou na coluna vertebral. Essas lesões incluem traumatismo cranioencefálico (TCE) e lesão medular (LME) e podem ocorrer a partir de uma variedade de incidentes, incluindo lesões contundentes (por exemplo, quedas, lesões esportivas, acidentes com veículos motorizados) e explosões explosivas. As lesões do SNC do sistema fechado são geralmente consideradas menos graves em comparação com as lesões penetrantes do SNC, mas ocorrem com mais frequência. No entanto, semelhante às lesões penetrantes, as lesões do SNC de sistema fechado podem resultar em problemas de saúde progressivos e de longo prazo, especialmente após ocorrências repetidas 1,2,3,4,5,6. Preocupantemente, evidências emergentes sugerem que mesmo lesões subclínicas do SNC em sistema fechado, que ficam abaixo dos critérios diagnósticos para TCE ou LME após uma única ocorrência 7,8,9,10,11,12,13, podem evoluir para doenças neurodegenerativas crônicas após lesões repetidas ^6,14,15,¹⁶. Isso ressalta a necessidade urgente de uma melhor compreensão dos mecanismos e consequências das lesões únicas e repetidas do SNC em sistema fechado.  Esse conhecimento é imperativo para melhorar as abordagens protetoras e terapêuticas. Cruciais para esse esforço são os modelos animais que replicam lesões do SNC em sistema fechado.

Os modelos animais atuais de lesões do SNC em sistema fechado têm sido fundamentais para o avanço de nossa compreensão da fisiopatologia e possíveis intervenções protetoras e terapêuticas para esses traumas. Os roedores são particularmente populares devido ao seu baixo custo, disponibilidade, manipulabilidade genética, facilidade de manuseio, ensaios comportamentais e fisiológicos bem estabelecidos e considerações éticas mais favoráveis¹⁷. Métodos comuns para induzir TCE de sistema fechado em roedores incluem dispositivos de queda de peso ^18,19, dispositivos de impacto cortical controlado (CCI)²⁰ e tubos de choque acionados por ar de compressão²¹. Para LM, os modelos de trauma contuso geralmente requerem laminectomia^22,23 ou outras técnicas cirúrgicas²⁴ para acessar diretamente a medula espinhal ou o espaço epidural. No entanto, modelos de lesão por explosão de SCI de corpo fechado foram desenvolvidos usando tubos de choque acionados por ar de compressão ²⁵. Apesar de fornecer informações valiosas, cada um desses modelos tem limitações únicas. Os modelos de queda de peso podem ter alta variabilidade e controle limitado da localização e gravidade da lesão, produzindo preocupações experimentais e éticas por causar lesões graves e descontroladas²⁶. Os dispositivos CCI oferecem precisão, mas requerem treinamento para operar, podem envolver uma craniotomia e podem sofrer de variabilidade mecânica que afeta a reprodutibilidade²⁷. Os tubos de choque são geralmente menos invasivos, mas podem ser difíceis de adquirir, complexos de configurar e operar e podem criar condições de lesão irrealistas e altamente variáveis devido a fatores ambientais, reflexões de ondas e interações complexas de pressão²⁸.

Para melhor estudar os mecanismos e efeitos das lesões únicas e repetidas do SNC em sistema fechado e seus tratamentos, este artigo apresenta um método modular, fácil de usar, econômico e não invasivo. O objetivo principal dessa abordagem é permitir o controle preciso e a modificação flexível dos parâmetros da lesão, incluindo localização, gravidade e tempo. Para apoiar esse objetivo, este manuscrito fornece um protocolo detalhado para construir, calibrar e solucionar problemas de um sistema de ar de sobrepressão, que aborda algumas das limitações dos dispositivos de lesão do SNC de sistema fechado existentes. Este sistema não só oferece custo-benefício e tempo mínimo de configuração, mas é altamente versátil, proporcionando resultados consistentes e reprodutíveis, minimizando as preocupações éticas e maximizando a relevância clínica. Além disso, a capacidade do sistema de produzir uma variedade de lesões do SNC em sistema fechado em modelos murinos é descrita, juntamente com suas aplicações potenciais em estudos futuros. Notavelmente, o objetivo deste manuscrito é fornecer uma estrutura que permita aos investigadores adquirir, adaptar e expandir facilmente esse sistema para suas necessidades específicas, promovendo assim a pesquisa em andamento no trauma do SNC. Resultados representativos que demonstram a eficácia do sistema na indução de trauma axonal também são apresentados.

Protocolo

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Vanderbilt University (29,30,31,32) e sob as diretrizes da Associação para Avaliação e Credenciamento de Cuidados com Animais de Laboratório (AAALAC) e da Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO). Todos os camundongos foram alojados em grupo e mantidos em um ciclo claro/escuro de 12 h e forneceram comida e água ad libitum. Camundongos 30,31,33 C57 Bl/6 de três meses de idade foram usados neste protocolo.

1. Construção do sistema

1. Obtenha uma pistola de paintball disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) que tenha um regulador de pressão de ar integrado.
2. Modifique o cano (Figura 1A) se necessário.
   1. Se o cano original for fenestrado com aberturas ou perfurações ao longo de seu comprimento, o ar comprimido pode vazar e se dissipar no ar, reduzindo o nível máximo de pressão de saída. Substitua-o comprando um cano sólido e não fenestrado para aumentar a faixa de pressão de saída (Figura 1, I).
   2. Se o cano original for longo e pesado, encurte-o comprando um cano mais curto de comprimento personalizado ou usando um cortador de tubos ou serra.
   3. Se o cano original não produzir o nível de pressão de saída desejado, modifique o diâmetro interno (tamanho do furo) do cano comprando um cano com um diâmetro de furo personalizado. Diminuir o diâmetro do tamanho do furo original aumentará a faixa de pressão de saída e vice-versa.
3. Modifique o regulador (Figura 1B) se necessário.
   1. Remova a tampa guia para fornecer acesso direto ao parafuso de ajuste (Figura 1, II) se o regulador original vier com uma tampa guia.
   2. Troque o parafuso de soquete Allen por um parafuso de soquete de cabeça chata se o parafuso de ajuste original vier com um soquete de cabeça Allen.
4. Remova o carregador de alimentação por gravidade padrão (ou seja, o reservatório para segurar e alimentar bolas de tinta na pistola) e vede o tubo de alimentação vertical (Figura 1, III) para evitar vazamento de pressão.
   1. Certifique-se de que a pistola de paintball esteja descarregada e a fonte de ar (CO₂ ou tanque de ar comprimido) esteja desconectada antes de remover o carregador de alimentação por gravidade.
   2. Localize o gargalo de alimentação (Figura 1C) onde o carregador de alimentação por gravidade está conectado. Afrouxe o pescoço de alimentação clamp usando a ferramenta apropriada.
   3. Remova o carregador de alimentação por gravidade padrão puxando-o para cima.
   4. Insira uma tampa ou plugue do pescoço de alimentação para vedar a abertura. Estes estão normalmente disponíveis em lojas de paintball ou online e são projetados para se encaixar perfeitamente no gargalo de alimentação, selando-o.
5. Monte uma plataforma (Figura 1D) para a arma de paintball e uma mesa de posicionamento de animais x-y.
   1. Construa a base da plataforma cortando dois pedaços de fibra de média densidade.
      NOTA: Dependendo da disponibilidade e preferência do material, materiais alternativos (por exemplo, madeira compensada) também podem ser empregados.
   2. Corte um pedaço quadrado menor para medir 1,5 x 1,5 pés.
   3. Corte uma peça retangular maior para medir 2,5 x 1,5 pés.
   4. Eleve e prenda a plataforma menor 3.5 polegadas acima da plataforma maior usando dois paralelos 2 x 4 s.
6. Fixe a arma de paintball modificada na plataforma.
   1. Coloque a arma de paintball de lado na plataforma menor para que a extremidade do cano se estenda meia polegada sobre a borda.
   2. Prenda a pistola de paintball usando suportes de montagem ou clamps que se encaixam no cano e na coronha da pistola de paintball.
   3. Conecte um tanque de ar pressurizado (Figura 1E; consulte a Tabela de Materiais) ao regulador da pistola de paintball. Como alternativa, conecte uma linha de pressão direta de um tanque de nitrogênio comprimido para aumentar a faixa de níveis de pressão de saída confiáveis.
   4. Se estiver usando um tanque de ar pressurizado, prenda-o ao painel de fibras com uma tira de tecido durável. Prenda a alça com parafusos ou porcas e inclua um mecanismo de ajuste para facilitar o aperto e o afrouxamento.
7. Prenda uma mesa de posicionamento x-y ao pedaço maior de painel de fibra retangular oposto ao cano da pistola de paintball usando parafusos ou porcas (Figura 1F).
   NOTA: Uma tabela de posicionamento x-y (consulte Tabela de Materiais), também conhecida como estágio x-y, pode ser adquirida de vários fornecedores, incluindo varejistas on-line, fornecedores industriais e fornecedores de equipamentos científicos. Ao comprar uma mesa de posicionamento x-y, considere a faixa de deslocamento, a capacidade de carga, a precisão e a escolha entre ajuste manual ou controle motorizado. Esta tabela de posicionamento x-y permitirá o movimento e o posicionamento precisos do animal ao longo de dois eixos: o eixo x (horizontalmente em direção ou longe do cano) e o eixo y (verticalmente para cima ou para baixo do cano).
8. Modifique a mesa de posicionamento x-y instalando três braçadeiras de PVC.
   1. Prenda dois grampos de PVC de 1 cm de espessura em ambos os lados da frente do cano usando parafusos ou porcas. Certifique-se de que os clamps são largos o suficiente para acomodar o suporte de animais das Etapas 1.9 e 1.10 (por exemplo, 1.5 pol).
   2. Prenda um grampo de PVC mais grosso (4 cm) perpendicular e oposto aos dois grampos de 1 cm de espessura usando parafusos ou porcas. Certifique-se de que o clamp é largo o suficiente para acomodar o transdutor de pressão da Etapa 2.4 (por exemplo, 1.5 pol).
   3. Faça dois furos na parte superior do terceiro grampo e insira dois parafusos de plástico para estabilização adicional do transdutor de pressão durante a calibração do sistema na Etapa 2.
9. Personalize o interior do suporte para animais (Figura 2A).
   1. Compre e corte um pedaço de tubo de PVC (35 mm de diâmetro externo, 26 mm de diâmetro interno, 6.75 polegadas de comprimento) para a câmara de contenção interna do mouse.
   2. Crie um orifício retangular (3 x 5 cm) a 1 polegada da extremidade do tubo para expor a cabeça do mouse e os ombros traseiros superiores enquanto o resto do corpo permanece protegido.
      NOTA: Se o local da lesão do SNC estiver mais baixo nas costas do camundongo (por exemplo, a coluna torácica ou lombar), aumente o orifício retangular.
10. Personalize a parte externa do porta-animais (Figura 2B).
    1. Compre e corte um pedaço de tubo de PVC (44 mm de diâmetro externo, 35 mm de diâmetro interno, 6 polegadas de comprimento) para a câmara de contenção externa do mouse.
    2. Construa uma abertura de exposição (Figura 2C) dentro da câmara de contenção externa para controle preciso do local da lesão do SNC.
    3. Crie uma abertura recíproca no lado oposto para inserir o cilindro do transdutor de pressão durante a calibração do sistema na Etapa 2 (por exemplo, um orifício de 9 mm).
11. Modifique a parte externa do porta-animais para acomodar a administração de anestesia com gás. Se um anestésico injetável for usado, pule esta etapa.
    1. Sele uma extremidade da parte externa do porta-animais usando fita adesiva. Garanta um ajuste apertado para evitar vazamento de gás.
    2. Crie um pequeno orifício na vedação para inserir a linha de anestesia.
    3. Posicione a linha de anestesia para introduzir isoflurano no ambiente do tubo sem contato direto com o animal.

2. Calibração do sistema

1. Conecte um transdutor de pressão (Figura 2D; consulte a Tabela de Materiais para opções) a um sistema de aquisição de dados (DAQ) e computador para traduzir as leituras de pressão física em dados digitais.
   1. Conecte o transdutor de pressão ao módulo DAQ (consulte a Tabela de Materiais), garantindo a polaridade adequada e conexões seguras.
   2. Insira o módulo DAQ em um chassi DAQ (consulte a Tabela de Materiais) para permitir que ele receba energia e se comunique com o computador.
   3. Use um cabo USB para conectar o chassi DAQ ao computador.
   4. Certifique-se de que o computador tenha o software e os drivers necessários instalados para fazer interface com o hardware DAQ e adquirir dados (consulte a Tabela de materiais para obter as opções).
2. Defina as configurações do sistema de aquisição de dados.
   1. Abra o software DAQ instalado.
   2. Certifique-se de que o sistema DAQ seja reconhecido pelo computador.
   3. Consulte as fichas técnicas de especificação e calibração para seu módulo/chassi DAQ específico e transdutor de pressão e defina as configurações do sistema DAQ:
      NOTA: As configurações de DAQ para o hardware de aquisição de dados usado neste manuscrito estão disponíveis publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Entrada analógica: Selecione o canal de entrada física no módulo DAQ onde o transdutor de pressão está conectado.
      2. Fonte de excitação (fonte Vex): Especifique a fonte de excitação do módulo DAQ (por exemplo, interna ou externa).
      3. Tensão de excitação (valor Vex): Defina o valor vex para o valor especificado pelo fabricante do transdutor de pressão (por exemplo, 5 ou 10 V).
      4. Tipo de ponte: Escolha o tipo de ponte apropriado do seu módulo DAQ (por exemplo, ponte completa, meia ponte ou quarto de ponte).
      5. Resistência da ponte: Defina a resistência da ponte para o valor especificado pelo fabricante do transdutor de pressão (por exemplo, 350 ).
      6. Fator de calibração/escala personalizada: Configure a escala com base na folha de dados de calibração fornecida pelo fabricante do transdutor de pressão. O fabricante calibra o transdutor de pressão aplicando uma unidade física conhecida (psi) e medindo as unidades elétricas resultantes (mV/V). Crie uma curva de calibração plotando as unidades físicas conhecidas em relação às unidades elétricas obtidas.
      7. Taxa de amostragem (Hz): Defina a taxa de amostragem alta o suficiente para capturar a dinâmica das mudanças de pressão sem aliasing (por exemplo, 1 ou 10 kHz, dependendo da velocidade das mudanças de pressão em seu experimento).
         NOTA: Quanto mais estreita for a forma de onda do ar de sobrepressão (ou seja, quanto mais rapidamente ela muda de pressão), mais ampla será a faixa de frequência que ela excita e, portanto, maior será a taxa de amostragem. Isso é especialmente importante em experimentos envolvendo modelos de lesão do SNC, onde as mudanças de pressão podem ocorrer rapidamente.
3. Crie uma ferramenta digital no software DAQ para aquisição de dados.
   NOTA: Esta ferramenta digital será usada para medir, registrar, exibir e analisar com precisão as pressões de saída do sistema. A ferramenta digital usada neste manuscrito está disponível publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Implemente algoritmos de processamento de sinal para filtrar, amplificar ou processar os dados brutos do transdutor.
   2. Adicione ferramentas de análise para calcular métricas como pressão de pico, pressão média e duração dos eventos de pressão.
   3. Incorpore elementos visuais (por exemplo, gráficos) para mostrar dados de pressão em tempo real e elementos de controle para iniciar, parar e redefinir a aquisição de dados.
   4. Salve a ferramenta digital.
4. Meça a pressão de saída do sistema
   1. Insira o transdutor de pressão no grampo grosso na mesa xy e seu cilindro através do orifício do porta-animais (criado na etapa 1.10.3).
   2. Ajuste o cilindro do transdutor de pressão até que a ponta esteja precisamente no local da lesão do SNC.
   3. Prenda o transdutor de pressão com dois parafusos de plástico (instalados na etapa 1.8.3).
5. Execute a ferramenta digital no software de aquisição de dados enquanto solta o gatilho da pistola de paintball para capturar, analisar e visualizar a pressão de saída do sistema.
6. Ajuste o parafuso de ajuste até que a pressão de saída do sistema atinja o nível desejado.
   NOTA: Depois de modificar o cano da pistola de paintball para ser não fenestrado, 1.5 polegadas de comprimento e 6.5 mm de diâmetro, o sistema é capaz de fornecer níveis de ar de sobrepressão de forma confiável na faixa de 15-50 psi a 5 mm da frente do cano³⁴. Níveis de ar de sobrepressão abaixo de 15 psi e acima de 50 psi exibem grande variabilidade de intensidade. Para uma exibição abrangente da pressão de saída do sistema (psi) em função da pressão de entrada (psi), distância do cano (cm) e tempo (ms), consulte a Figura 2 de Hines-Beard et al.34. Use nitrogênio comprimido em vez de ar comprimido para obter de forma confiável níveis de ar de sobrepressão acima de 50 psi usando este sistema.

3. Preparação animal e exposição ao ar de sobrepressão

1. Anestesiar o camundongo com isoflurano em uma câmara de indução com 1,5-3^{% 30,31,32,33} isoflurano em oxigênio até que esteja totalmente sedado.
   1. Confirme a anestesia avaliando a ausência de resposta a uma pitada do dedo do pé.
   2. Prenda o mouse no suporte interno do animal com a cabeça e os ombros traseiros superiores expostos através da abertura retangular, enquanto o dorso e os membros posteriores inferiores permanecem protegidos.
   3. Apoie a cabeça do rato com uma almofada afixada no segmento inferior intacto do suporte interno do animal.
   4. Prenda o mouse aplicando fita cirúrgica na parte superior dos ombros traseiros.
   5. Insira o suporte interno para animais no suporte externo para animais.
   6. Abra a linha de anestesia secundária para administração de isoflurano dentro do suporte do animal.
   7. Coloque uma almofada adicional na extremidade do suporte do animal para evitar que o anestésico vaze do tubo e para evitar que o camundongo se mova durante a exposição ao ar de sobrepressão.
2. Fornecimento de ar de sobrepressão
   1. Alinhe a abertura circular de 4 mm do suporte externo do animal diretamente sobre o olho esquerdo do mouse.
   2. Posicione o suporte do animal usando os botões de controle na mesa x-y de forma que sua abertura se alinhe com o cano da pistola de paintball e a superfície externa fique a 5 mm da extremidade do cano.
      NOTA: Ajuste a distância do animal da extremidade do cano para alterar o nível de ar de sobrepressão (psi) e a forma. Mova o animal para mais longe do cano para diminuir o nível de ar de sobrepressão e criar uma onda de ar de sobrepressão mais difusa.
   3. Inicie a sequência de ar de sobrepressão para induzir ITON:
      1. Forneça duas rajadas de ar de sobrepressão de 15 psi em um intervalo de 0,5 s repetidas diariamente por 3 dias 29,30,31,32.
         NOTA: ITON semelhante pode ser induzido através da entrega de três rajadas consecutivas de ar de sobrepressão de 15 psi separadas por intervalos de 0,5 s²³. O grau de ITON que resulta após a entrega de seis rajadas consecutivas de ar de sobrepressão de 15 psi separadas por intervalos de 0,5 s é mostrado aqui em Resultados Representativos.
      2. Exponha os ratos falsos ao ruído do ar de sobrepressão, mas não ao próprio ar de sobrepressão, girando o suporte do animal para que a abertura não fique mais voltada para o cano e bloqueie o ar com um escudo de papelão.
3. Recuperação do mouse
   1. Deixe os ratos se recuperarem da anestesia.
      1. Administre colírios lubrificantes (consulte a Tabela de Materiais) para evitar que os olhos sequem devido à anestesia.
      2. Forneça calor usando um suporte de aquecimento controlado (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Monitore visualmente os ratos até que eles mantenham uma postura ereta e andem normalmente. Permita que eles estejam na companhia de seus companheiros de gaiola.
   3. Forneça a todos os camundongos expostos ao ar de sobrepressão alimentos de recuperação de gel (consulte a Tabela de Materiais) nos primeiros 3 dias após a lesão para evitar a perda de peso.

4. Coleta e processamento de tecidos

1. Eutanasiar os camundongos por meio de injeção intraperitoneal de Avertin Working Solution.
   1. Faça Avertin Stock misturando 10 g de 2,2,2,-tribromoetanol (ver Tabela de Materiais) com 10 mL de 1-Pentanol (ver Tabela de Materiais). Conservar à escura a 4 °C.
   2. Faça a solução de trabalho Avertin combinando 1,25 mL de estoque de Avertin, 45 mL de água destilada dupla e 5 mL de PBS 10x (consulte a Tabela de Materiais) em um tubo de 50 mL. Filtrar, esterilizar a mistura e conservar à escura a 4 °C.
2. Perfundir transcardialmente os camundongos com paraformaldeído a 4% (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS (ver Tabela de Materiais).
3. Enuclear o olho exposto ao ar de sobrepressão usando pinças finas (ver Tabela de Materiais) e tesouras (ver Tabela de Materiais), garantindo a preservação do nervo óptico (ON).
4. Colete o ON junto com o tecido ocular enucleado para análise posterior.
5. Osmicate ON tecido.
   1. Pós-fixação ON tecido durante a noite em paraformaldeído a 4% e glutaraldeído a 2% (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS. Se estiver trabalhando com tecido que não foi perfundido (como na etapa 4.2), postfixe por 5 dias em vez de durante a noite.
   2. Transfira o tecido ON para uma placa de 12 ou 24 poços (consulte a Tabela de Materiais) com 1x PBS usando um pincel (consulte a Tabela de Materiais) ou uma vara de madeira afiada.
   3. Em uma capela de exaustão, substitua 1xPBS por tetróxido de ósmio a 2% (consulte a Tabela de Materiais) em tampão de cacodilato 0,2 M (a receita está disponível publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) usando uma pipeta de transferência. Incubar no gelo durante 2 h.
   4. Realize três lavagens com 1x PBS
      1. Descarte os resíduos de ósmio adequadamente.
      2. Deixe a placa na hotte durante duas noites após a terceira lavagem do PBS.
6. Desidratar o tecido ON em uma série graduada de etanol.
   1. Transfira os nervos para uma nova placa com etanol a 50% e incube por 30 min.
   2. Substitua por etanol a 70% por 30 min.
   3. Substitua por etanol a 95% por 30 min.
   4. Substitua por etanol 100% por 30 min.
7. Incorpore o tecido ON em epon.
   NOTA: A receita do Epon está disponível publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; consulte a Tabela de Materiais para obter os materiais listados na receita.
   1. Dia 1: Transfira o tecido para um frasco de 2 mL com óxido de propileno (consulte a Tabela de Materiais)/etanol 100% (1:1) e agite por 30 min em temperatura ambiente. Substitua por óxido de propileno puro e agite por 15 min, repetindo uma vez. Substitua por óxido de propileno/epon (1:1) e agite durante a noite na câmara fria.
   2. Dia 2: Transfira o tecido para uma placa de 12 ou 24 poços com 100% de epon e agite por 4 h em temperatura ambiente. Substitua por 100% de epon fresco e incube durante a noite em temperatura ambiente no vácuo.
   3. Dia 3: Repita a incubação epon como no Dia 2.
   4. Dia 4: Transfira o tecido para um molde plano com 100% de epon, reoriente o tecido e leve ao forno a 60 °C por 48 h.
8. Seção NO tecido.
   1. Apare os moldes sob uma luneta de dissecação em uma pirâmide dupla com o nervo no centro.
   2. Colete seções transversais de 700 nm de espessura usando um ultramicrótomo e uma faca de diamante (consulte a Tabela de Materiais).
   3. Colete seções em lâminas de microscópio de vidro branco carregadas usando água destilada.
   4. Seque as lâminas em um forno a 60 °C até que a água evapore. Resfrie em temperatura ambiente.
9. Mancha no tecido.
   1. Mergulhe as lâminas em 1% de parafenilenodiamina (PPD) (consulte a Tabela de Materiais) em uma mistura 1:1 de metanol e 2-propanol por 28 min.
   2. Enxágue as lâminas em duas misturas consecutivas de metanol 1:1 (consulte a Tabela de Materiais) e 2-propanol (consulte a Tabela de Materiais) por 1 min cada.
   3. Enxágue as lâminas em 100% de etanol por 1 min e deixe secar ao ar.
   4. Coloque as lâminas em uma caixa úmida e cubra as seções com azul de toluidina a 1% (consulte a Tabela de Materiais) usando uma pipeta de transferência.
   5. Incubar em estufa a 60 °C durante 20 min.
   6. Enxágue as lâminas com água bidestilada e deixe secar ao ar.
10. Monte e imagem no tecido.
    1. Deslize a lamínula usando a mídia de montagem (consulte a Tabela de Métodos), removendo o excesso de mídia.
    2. Deixe as lâminas secarem durante a noite.
    3. Seções transversais de imagens usando microscopia de campo claro com uma objetiva de imersão em óleo de 100x.
11. Incorpore, corte e core imuno-histoquimicamente o tecido da retina.
    1. Postfix todo o tecido ocular em paraformaldeído a 4% por 2-4 h.
    2. Crioproteja todo o tecido ocular em sacarose a 30% (consulte a Tabela de Materiais em 1x PBS durante a noite a 4 ° C.
    3. Incorpore o tecido ocular em um meio de congelamento (consulte a Tabela de Materiais).
    4. Colete seções transversais de retina de 10 μm de espessura em um criostato e monte as seções em lâminas de microscópio de vidro branco carregadas (consulte a Tabela de Materiais).
    5. Lave as lâminas em 1x PBS e incube em um tampão de bloqueio (5% Triton X-100 e 2% de albumina de soro bovino (BSA) (ver Tabela de Materiais) em 1x PBS) com 5% de soro de burro normal (NDS) (ver Tabela de Materiais) em temperatura ambiente por 30 min.
    6. Incube as lâminas durante a noite a 4 ° C (ou à temperatura ambiente por 4 h) em anticorpo primário (consulte a Tabela de Materiais) em 0,5% Triton X-100 (consulte a Tabela de Materiais) em 1xPBS (PBT).
    7. Lave as lâminas em PBT e incube em anticorpo secundário (ver Tabela de Materiais) em tampão de bloqueio com 5% de NDS.
    8. Lave as lâminas em PBT, aplique o meio de montagem com DAPI (consulte a Tabela de Materiais), lamínula e sele com esmalte.
    9. A imagem desliza em um microscópio de epifluorescência.
    10. Se quantificar a intensidade da fluorescência, certifique-se de que as imagens sejam tiradas da mesma região da retina com configurações idênticas de ampliação, ganho e exposição.
12. Conte com axônios.
    1. Conte manualmente o número de axônios usando o software de análise de imagem (consulte a Tabela de Materiais) por amostragem de 20% da área total da seção transversal do nervo usando uma sobreposição de grade fixa para estimar a densidade do axônio (axônios / mm²).
    2. Meça a área da seção transversal ON.
       1. Use a função Definir escala para definir pixels/mícrons para a objetiva usada para criar imagens.
       2. Use a ferramenta de seleção de polígono para traçar ao longo da bainha de mielina do nervo óptico, excluindo a vasculatura.
       3. Meça a área do ON usando a função Measure .
       4. Determine 20% da área total multiplicando a área medida por 0,2.
    3. Sobreponha a grelha fixa na secção ON.
       1. Baixe o plug-in Counting Array.
          NOTA: Este plug-in está disponível publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Abra o plug-in Counting Array para sobrepor uma grade fixa sobre a seção transversal, consistindo em 9 quadrados uniformemente espaçados na formação de um sinal de mais.
       3. Edite a área por cada uma das 9 regiões dividindo 20% da área total da seção transversal ON (calculada na etapa 4.6.2.4) por 9.
       4. Centralize a grade fixa de modo que o centro do sinal de mais fique centralizado no meio da seção transversal ON.
    4. Conte os axônios vivos e degenerados separadamente.
       1. Baixe e abra o plug-in do Cell Counter.
          NOTA: Este plug-in está disponível publicamente no GitHub. Os leitores interessados podem acessar o repositório em https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Para cada uma das 9 regiões, conte o número de perfis de axônios vivos e degenerados separadamente, visualizando a condição da bainha de mielina. Certifique-se de que a quantificação do axônio seja realizada sem contato com o grupo experimental do animal para evitar viés.
       3. Para axônios vivos, procure aqueles em que a bainha de mielina parece intacta, uniformemente corada e circundada de maneira suave e uniforme ao redor do axônio.
       4. Para axônios degenerados, procure aqueles com espessamento, cebola ou colapso da bainha de mielina.
       5. Se o axônio for parcialmente cortado pela grade sobreposta, inclua-o apenas na contagem de axônios se o lúmen for visto.
       6. Certifique-se de que os axônios oblongos não sejam contados acidentalmente mais de uma vez e não confunda detritos ou poeira com um perfil de axônio degenerado.
    5. Realize análises estatísticas para testar diferenças significativas nas contagens médias de axônios entre os grupos. Certifique-se de que um mínimo de quatro ONs sejam incluídos em cada grupo para levar em conta a variabilidade normal observada em análises anteriores.
       1. Realize um teste t de amostras independentes (também conhecido como teste t de Student para amostras independentes) para avaliar diferenças significativas entre as médias de dois grupos independentes.
       2. Realizar a alternativa não paramétrica, o teste U de Mann-Whitney, se as condições para um teste t de amostras independentes não puderem ser atendidas (ou seja, se os dados não forem normalmente distribuídos ou se os tamanhos das amostras forem muito pequenos).

Discussão

Este sistema de ar de sobrepressão personalizado é uma ferramenta útil para estudar lesões do SNC em sistema fechado em modelos murinos. Os resultados representativos do experimento de exemplo demonstram que a entrega focal de ar de sobrepressão usando este sistema pode efetivamente induzir ITON, resultando em perda e degeneração significativas de axônios. Isso destaca a capacidade do sistema de produzir lesões precisas e reprodutíveis no SNC.

Um dos principais pontos fortes deste sistema é sua personalização para induzir uma série de lesões no SNC. A gravidade da lesão pode ser ajustada modificando a pressão geral de saída do sistema, a distância do animal da extremidade do cano usando o estágio de posicionamento x-y, o tamanho e a forma da abertura de exposição, o número de exposições ao ar de sobrepressão e o intervalo entre as exposições. Além disso, a localização da lesão no SNC pode ser ajustada modificando a localização da abertura de exposição dentro do suporte do animal. Essa versatilidade permitiu que o sistema produzisse um espectro de lesões do SNC em sistema fechado em modelos murinos. Inicialmente, o sistema foi usado para modelar lesões de globo fechado, com foco em danos nos pólos anterior e posterior e déficits relacionados^34,36, incluindo os impactos da resposta do sistema imunológico³⁷, resultados específicos da cepa³⁸ e a eficácia dos agentes neuroprotetores³⁹. Eventualmente, esta aplicação se expandiu para avaliar as sequelas de exposições repetidas direcionadas ao olho para modelar neuropatia óptica traumática indireta (ITON) ³⁰ e explorar o efeito do número e intervalo entre exposições repetidas³³. Desde então, a aplicação do sistema se expandiu para modelar lesão cerebral traumática leve (mTBI) de cabeça fechada por meio de exposições direcionadas à cabeça^40,41 e lesão medular de corpo fechado (LM) por meio de exposições direcionadas ao dorso⁴², enfatizando a adaptabilidade e versatilidade do dispositivo no estudo de vários domínios de lesão do SNC.

Ao usar este sistema, é fundamental tomar medidas para minimizar a variabilidade nos resultados das lesões para garantir a reprodutibilidade e confiabilidade dos resultados experimentais. As principais medidas incluem calibrar os níveis de pressão de saída do sistema antes e depois de cada série de três exposições para garantir um fornecimento de pressão consistente. Embora a variabilidade seja baixa quando o sistema é operado entre 15 psi e 50 psi ao usar ar comprimido³⁴, a calibração consistente ajuda a detectar erros inesperados, como bateria fraca ou ar baixo. Além disso, posicione cada animal à mesma distância da extremidade do cano para garantir uma magnitude de sobrepressão consistente, pois a intensidade da onda de pressão diminui com a distância. O posicionamento uniforme também garante que cada animal seja impactado pela mesma parte da onda de ar. Além disso, a fixação uniforme dos animais dentro do suporte garante que o tecido de interesse seja direcionado de forma consistente, especialmente em modelos de exposição repetida quando há risco de movimento. Finalmente, a uniformidade na idade, sexo e histórico genético dos animais é crucial, pois esses fatores influenciam a resposta à lesão. Por exemplo, estudos anteriores usando este sistema compararam os efeitos do ar de sobrepressão direcionado ao olho em diferentes cepas de camundongos, destacando diferenças significativas na resposta a lesões entre camundongos C57Bl / 6J³⁶, DBA / 2J³⁷ e Balb / c³⁸ . Os camundongos DBA / 2J e Balb / c exibiram patologias mais graves no polo anterior, maior dano retiniano, maior estresse oxidativo e respostas neuroinflamatórias mais pronunciadas em comparação com os camundongos C57Bl / 6J com camundongos Balb / c mostrando perfis de lesão particularmente robustos e duradouros³⁸.

Solução de problemas do sistema
Se os valores de pressão forem atipicamente baixos para uma determinada configuração do manômetro, puxe o gatilho de 5 a 10x, permitindo que o ar passe pelo sistema e o regulador se ajuste a uma nova configuração. Não deve haver vazamentos no tanque de ar. O O-ring no tanque de ar não deve ser danificado ou desgastado, o tanque de ar deve ter ar suficiente e a bateria da arma não deve estar esgotada. A mesa x-y não deve ter se afastado de sua posição normal a partir da extremidade do cano e a abertura de exposição ao ar de sobrepressão deve estar alinhada com o cano da arma e não ocluindo-a. O regulador deve estar firmemente preso ao punho da arma. Se os valores de pressão forem muito baixos, apesar de usar a configuração mais alta no manômetro, o manômetro não deve ser aumentado além de 200 psi e a configuração de velocidade na pistola deve ser ajustada para a configuração máxima. Se as configurações de pressão forem inconsistentes (por exemplo, alta e baixa), certifique-se de que o tanque de ar tenha ar suficiente, o regulador esteja firmemente preso ao punho da pistola, não haja vazamentos no tanque de ar e que esteja bem aparafusado e o O-ring no tanque de ar não está danificado ou desgastado.

Para entender de forma abrangente todos os recursos desse sistema, é importante reconhecer suas limitações. Imitar cenários do mundo real em um ambiente de laboratório continua sendo um desafio. Embora este sistema gere ar de sobrepressão, ele não replica a dinâmica complexa de um evento explosivo, como os gradientes variáveis de pressão e temperatura, a presença de detritos e ondas refletidas e uma natureza multifásica. Além disso, não imita uma forma de onda de Friedlander ("onda de choque primária"), que é caracterizada por um pico agudo e quase instantâneo de pressão seguido por um rápido decaimento exponencial que cai abaixo da pressão ambiente antes de retornar à linha de base⁴³. Em vez disso, a forma de onda produzida por este sistema representa um perfil mais simples e simétrico no qual há um aumento e queda mais gradual da pressão, sem fase negativa distinta (ver Figura 2C em Hines-Beard et ^al.34). De forma um tanto vantajosa, essa forma de onda combina elementos de explosão e ferimentos contusos. O "pulso de pressão" em forma de sino oferece um impacto de sobrepressão consistente, semelhante a uma "parede de ar" atingindo o assunto. No entanto, o ar de sobrepressão fornecido pela onda também é um aspecto característico fundamental das lesões por explosão. Alguns podem argumentar que, embora essa forma de onda inclua aspectos de ambos os tipos de lesões, ela não captura totalmente a complexidade de nenhum deles. No entanto, esse "pulso de pressão" consistente e reprodutível é ideal para experimentos controlados em um ambiente de laboratório para estudar lesão focal do SNC em sistema fechado. Demonstramos a natureza focal da lesão anteriormente. Por exemplo, a exposição a um olho não causa danos ao epitélio nasal primário ou ao cérebro⁴⁴. Além disso, quando direcionado para o lado da cabeça do camundongo, uma pequena área do cérebro é afetada⁴⁵. Finalmente, a energia do ar de sobrepressão deste sistema no nível de pressão usado para ITON não afetou o mouse, a menos que repetida com um curto intervalo de tempo³³. Assim, a pressão não é prejudicial e, portanto, não replica uma força de extremidade de jato. Além disso, mesmo com a exposição repetida ao ar de sobrepressão no olho, não houve efeito nas estruturas oculares anteriores³³. Degeneração significativa do nervo óptico e perda de visão ocorreram apenas com exposição repetida com intervalo entre exposições inferior a 1 min³³.

Comparado a outros dispositivos de laboratório para criar lesões do SNC em sistema fechado, este sistema oferece benefícios exclusivos. Ele pode fornecer rajadas sequenciais de ar de sobrepressão em rápida sucessão (intervalos de 0,5 s)³³, imitando condições em ambientes ocupacionais de alto risco, onde exposições rápidas a explosões são um perigo comum. Por exemplo, militares, tanto em cenários de treinamento quanto de combate, usam uma série de armas de fogo automáticas capazes de disparos repetidos rápidos, incluindo rifles automáticos (por exemplo, M16, AK-47), metralhadoras (por exemplo, calibre M2 .50), metralhadoras e miniguns. Outros armamentos mais lentos, mas repetitivos, usados por militares incluem artilharia, morteiros, granadas e dispositivos explosivos improvisados (IEDs). Trabalhadores de demolição envolvidos em demolição controlada e mineiros envolvidos em operações de detonação para quebrar rochas e extrair minerais também experimentam explosões sequenciais em rápida sucessão. Finalmente, os trabalhadores da construção civil que usam ferramentas pneumáticas, bate-estacas ou outros equipamentos pesados que geram poderosas forças percussivas podem experimentar impactos repetidos rápidos que imitam a exposição a explosões. Notavelmente, o fornecimento rápido de ar de sobrepressão não é possível com dispositivos como tubos de choque que requerem reconfiguração extensiva ou repressurização entre cada evento. Os tubos de choque usam diafragmas que estouram para gerar ondas de choque e, após cada explosão, o diafragma deve ser substituído. Esse processo leva tempo, pois o tubo de choque deve ser aberto, o diafragma gasto removido, um novo diafragma instalado e o sistema tem tempo para reiniciar e repressurizar. Assim, especialmente para estudos que investigam lesão do SNC após exposição rápida à explosão repetida, um sistema que não exija reconfiguração extensa ou repressurização entre cada evento é o ideal.

As aplicações futuras deste sistema modulatório, fácil de usar e econômico são promissoras. Aproveitando seus atributos adaptáveis e exclusivos, este sistema abre vários caminhos promissores para futuros estudos terapêuticos pré-clínicos. Sua capacidade de fornecer rajadas rápidas e sequenciais de ar de sobrepressão pode ser aproveitada para estudar os efeitos cumulativos de exposições repetidas a explosões, o que é relevante para a compreensão da encefalopatia traumática crônica e outras condições neurodegenerativas de longo prazo. Além disso, este sistema pode ser usado para explorar a eficácia de várias intervenções farmacológicas destinadas a mitigar lesões do SNC do sistema fechado, incluindo o momento e a dosagem de medicamentos neuroprotetores para determinar as janelas de tratamento ideais. Além disso, a precisão do sistema em imitar aspectos dos mecanismos de lesão contundente e explosiva permite o desenvolvimento de modelos abrangentes de lesões que refletem o trauma complexo experimentado por indivíduos em cenários do mundo real. Isso pode facilitar o teste de terapias multimodais que abordam aspectos globais comuns da lesão, como inflamação, estresse oxidativo e morte neuronal. No geral, este dispositivo oferece uma plataforma versátil e poderosa para avançar nossa compreensão das lesões do SNC em sistema fechado e desenvolver intervenções terapêuticas eficazes.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software