Sistema per lesioni focali del sistema nervoso centrale a sistema chiuso

Riepilogo

Questo protocollo descrive un sistema personalizzato di sovrapressione dell'aria progettato per indurre lesioni del sistema nervoso centrale (SNC) a sistema chiuso nei topi, inclusi traumi oculari, cerebrali e del midollo spinale. L'obiettivo di questo protocollo è quello di fornire un quadro di riferimento per i ricercatori per adattare ed espandere facilmente il sistema per i loro studi unici sul trauma del SNC.

Abstract

La prevalenza di lesioni del sistema nervoso centrale (SNC) a sistema chiuso sottolinea la necessità di una maggiore comprensione di questi traumi per migliorare gli interventi protettivi e terapeutici. Cruciali per questa ricerca sono i modelli animali che replicano le lesioni del SNC a sistema chiuso. In questo contesto, è stato progettato un sistema personalizzato di sovrapressione dell'aria per riprodurre una serie di lesioni del SNC a sistema chiuso in modelli murini, tra cui traumi oculari, cerebrali e del midollo spinale. Ad oggi, il sistema è stato utilizzato per somministrare aria di sovrapressione diretta agli occhi, alla testa o alla colonna vertebrale per modellare la lesione del polo anteroposteriore nell'occhio, la neuropatia ottica traumatica indiretta (ITON), la lesione cerebrale traumatica focale e la lesione del midollo spinale. Questo documento fornisce un protocollo dettagliato che delinea la progettazione e il funzionamento del sistema e condivide risultati rappresentativi che ne dimostrano l'efficacia. Il solido quadro qui presentato fornisce una solida base per la ricerca in corso sul trauma del SNC. Sfruttando gli attributi flessibili del sistema, gli investigatori possono modificare e controllare attentamente la posizione, la gravità e la tempistica delle lesioni. Ciò consente confronti completi dei meccanismi molecolari e dell'efficacia terapeutica in più lesioni del SNC a sistema chiuso.

Introduzione

Le lesioni del sistema nervoso centrale (SNC) a sistema chiuso sono lesioni causate da danni al cervello o al midollo spinale senza causare una rottura del cranio o della colonna vertebrale. Queste lesioni includono lesioni cerebrali traumatiche (TBI) e lesioni del midollo spinale (SCI) e possono verificarsi da una varietà di incidenti, tra cui lesioni da corpo contundente (ad esempio, cadute, infortuni sportivi, incidenti automobilistici) ed esplosioni esplosive. Le lesioni del SNC a sistema chiuso sono generalmente considerate meno gravi rispetto alle lesioni penetranti del SNC, ma si verificano più spesso. Tuttavia, analogamente alle lesioni penetranti, le lesioni del SNC a sistema chiuso possono causare problemi di salute progressivi e a lungo termine, soprattutto dopo eventi ripetuti 1,2,3,4,5,6. Preoccupante, le prove emergenti suggeriscono che anche le lesioni subcliniche del SNC a sistema chiuso, che scendono al di sotto dei criteri diagnostici per un trauma cranico o una lesione midollare dopo un singolo evento 7,8,9,10,11,12,13, possono evolvere in malattie neurodegenerative croniche dopo lesioni ripetute ^6,14,15,¹⁶. Ciò sottolinea l'urgente necessità di una migliore comprensione dei meccanismi e delle conseguenze delle lesioni singole e ripetute del SNC in un sistema chiuso.  Tale conoscenza è indispensabile per migliorare gli approcci protettivi e terapeutici. Cruciali per questo sforzo sono i modelli animali che replicano le lesioni del SNC in sistemi chiusi.

Gli attuali modelli animali di lesioni del SNC in sistemi chiusi sono stati determinanti per far progredire la nostra comprensione della fisiopatologia e dei potenziali interventi protettivi e terapeutici per questi traumi. I roditori sono particolarmente popolari per il loro basso costo, disponibilità, manipolabilità genetica, facilità di manipolazione, saggi comportamentali e fisiologici ben consolidati e considerazioni etiche più favorevoli¹⁷. I metodi comuni per indurre il trauma cranico a sistema chiuso nei roditori includono dispositivi di caduta del peso^18,19, dispositivi a impatto corticale controllato (CCI)²⁰ e tubi d'urto azionati ad aria compressa²¹. Per la lesione midollare, i modelli di trauma contusivo richiedono tipicamente la laminectomia^22,23 o altre tecniche chirurgiche²⁴ per accedere direttamente al midollo spinale o allo spazio epidurale. Tuttavia, i modelli di lesioni da esplosione SCI a corpo chiuso sono stati sviluppati utilizzando tubi d'urto azionati ad aria compressa ²⁵. Nonostante forniscano informazioni preziose, ognuno di questi modelli presenta limitazioni uniche. I modelli di caduta di peso possono avere un'elevata variabilità e un controllo limitato della posizione e della gravità della lesione, producendo preoccupazioni sperimentali ed etiche per causare lesioni gravi e incontrollate²⁶. I dispositivi CCI offrono precisione ma richiedono una formazione per funzionare, possono comportare una craniotomia e possono soffrire di variabilità meccanica che influisce sulla riproducibilità²⁷. I tubi d'urto sono generalmente meno invasivi ma possono essere difficili da acquisire, complessi da configurare e utilizzare e possono creare condizioni di lesione irrealistiche e altamente variabili a causa di fattori ambientali, riflessioni d'onda e complesse interazioni di pressione²⁸.

Per studiare meglio i meccanismi e gli effetti delle lesioni del SNC singole e ripetute in sistemi chiusi e i loro trattamenti, questo articolo presenta un metodo modulare, facile da usare, economico e non invasivo. L'obiettivo principale di questo approccio è consentire un controllo preciso e una modifica flessibile dei parametri delle lesioni, tra cui posizione, gravità e tempistica. A sostegno di questo obiettivo, questo manoscritto fornisce un protocollo dettagliato per la costruzione, la calibrazione e la risoluzione dei problemi di un sistema di sovrapressione dell'aria, che affronta alcune delle limitazioni dei dispositivi di lesione del SNC a sistema chiuso esistenti. Questo sistema non solo offre un rapporto qualità-prezzo e tempi di configurazione minimi, ma è anche estremamente versatile, fornendo risultati coerenti e riproducibili, riducendo al minimo le preoccupazioni etiche e massimizzando la rilevanza clinica. Inoltre, viene descritta la capacità del sistema di produrre una serie di lesioni del SNC a sistema chiuso in modelli murini, insieme alle sue potenziali applicazioni in studi futuri. In particolare, l'obiettivo di questo manoscritto è quello di fornire un quadro che consenta ai ricercatori di acquisire, adattare ed espandere facilmente questo sistema per le loro esigenze specifiche, promuovendo così la ricerca in corso sul trauma del SNC. Vengono inoltre presentati risultati rappresentativi che dimostrano l'efficacia del sistema nell'indurre il trauma assonale.

Protocollo

Tutte le procedure sono state eseguite secondo i protocolli approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) della Vanderbilt University 29,30,31,32 e secondo le linee guida dell'Associazione per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio (AAALAC) e dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO). Tutti i topi sono stati alloggiati in gruppo e mantenuti con un ciclo luce/buio di 12 ore e hanno ricevuto cibo e acqua ad libitum. In questo protocollo sono stati utilizzati topi 30,31,33 C57 Bl/6 di tre mesi.

1. Costruzione del sistema

1. Procurarsi una pistola da paintball disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) dotata di un regolatore di pressione dell'aria integrato.
2. Se necessario, modificare la canna (Figura 1A).
   1. Se la canna originale è fenestrata con aperture o perforazioni lungo la sua lunghezza, l'aria compressa può fuoriuscire e dissiparsi nell'aria, riducendo il livello massimo di pressione in uscita. Sostituirlo acquistando un fusto solido, non fenestrato, per aumentare l'intervallo di pressione di uscita (Figura 1, I).
   2. Se la canna originale è lunga e ingombrante, accorciala acquistando una canna più corta di lunghezza personalizzata o utilizzando un tagliatubi o una sega.
   3. Se la canna originale non produce il livello di pressione di uscita desiderato, modificare il diametro interno (dimensione del foro) della canna acquistando una canna con un diametro del foro personalizzato. Diminuendo il diametro della dimensione del foro originale si aumenterà l'intervallo di pressione di uscita e viceversa.
3. Se necessario, modificare il regolatore (Figura 1B).
   1. Rimuovere il cappuccio di guida per fornire un accesso diretto alla vite di regolazione (Figura 1, II) se il regolatore originale è dotato di un cappuccio di guida.
   2. Sostituire la vite a brugola con una a testa piatta se la vite di regolazione originale viene fornita con una bussola a brugola.
4. Rimuovere il caricatore di alimentazione a gravità standard (cioè il serbatoio per contenere e alimentare i paintball nella pistola) e sigillare il tubo di alimentazione verticale (Figura 1, III) per evitare perdite di pressione.
   1. Assicurarsi che la pistola da paintball sia scarica e che la fonte d'aria (CO₂ o serbatoio dell'aria compressa) sia scollegata prima di rimuovere il caricatore a gravità.
   2. Individuare il collo di alimentazione (Figura 1C) dove è fissato il caricatore a gravità. Allentare il morsetto del collo di alimentazione utilizzando l'utensile appropriato.
   3. Rimuovere il caricatore a gravità standard tirandolo verso l'alto.
   4. Inserire un coperchio o un tappo del collo di alimentazione per sigillare l'apertura. Questi sono in genere disponibili nei negozi di paintball o online e sono progettati per adattarsi perfettamente al collo di alimentazione, sigillandolo.
5. Assemblare una piattaforma (Figura 1D) per la pistola da paintball e un tavolo di posizionamento degli animali x-y.
   1. Costruisci la base della piattaforma tagliando due pezzi di fibra di legno a media densità.
      NOTA: A seconda della disponibilità e delle preferenze del materiale, possono essere utilizzati anche materiali alternativi (ad es. compensato).
   2. Taglia un pezzo quadrato più piccolo per misurare 1,5 x 1,5 piedi.
   3. Taglia un pezzo rettangolare più grande per misurare 2,5 x 1,5 piedi.
   4. Sollevare e fissare la piattaforma più piccola a 3,5 pollici sopra la piattaforma più grande utilizzando due paralleli 2 x 4 s.
6. Fissa la pistola da paintball modificata alla piattaforma.
   1. Appoggia la pistola da paintball su un lato sulla piattaforma più piccola in modo che l'estremità della canna si estenda di mezzo pollice oltre il bordo.
   2. Fissare la pistola da paintball utilizzando staffe di montaggio o clamps che si adattano alla canna e al calcio della pistola da paintball.
   3. Collegare un serbatoio d'aria pressurizzato (Figura 1E; vedere la tabella dei materiali) al regolatore della pistola per paintball. In alternativa, collegare una linea di pressione diretta da un serbatoio di azoto compresso per aumentare la gamma di livelli di pressione di uscita affidabili.
   4. Se si utilizza un serbatoio d'aria pressurizzato, fissarlo al pannello di fibra con una cinghia in tessuto resistente. Fissare la cinghia con viti o bulloni e includere un meccanismo di regolazione per un facile serraggio e allentamento.
7. Fissare un tavolo di posizionamento x-y al pezzo più grande di fibra rettangolare opposto alla canna della pistola da paintball utilizzando viti o bulloni (Figura 1F).
   NOTA: Un tavolo di posizionamento x-y (vedi Tabella dei materiali), noto anche come tavolino x-y, può essere acquistato da vari fornitori, inclusi rivenditori online, fornitori industriali e fornitori di apparecchiature scientifiche. Quando si acquista una tavola di posizionamento x-y, considerare l'intervallo di corsa, la capacità di carico, la precisione e la scelta tra regolazione manuale o controllo motorizzato. Questa tavola di posizionamento x-y consentirà un movimento e un posizionamento precisi dell'animale lungo due assi: l'asse x (orizzontalmente verso o lontano dalla canna) e l'asse y (verticalmente verso l'alto o verso il basso dalla canna).
8. Modificare la tavola di posizionamento x-y installando tre morsetti in PVC.
   1. Fissare due morsetti in PVC spessi 1 cm su entrambi i lati della parte anteriore della canna utilizzando viti o bulloni. Assicurati che i morsetti siano abbastanza larghi da ospitare il supporto dell'animale dai passaggi 1.9 e 1.10 (ad esempio, 1.5 pollici).
   2. Fissare un morsetto in PVC più spesso (4 cm) perpendicolare e opposto ai due morsetti spessi 1 cm utilizzando viti o bulloni. Assicurarsi che il morsetto sia sufficientemente largo da ospitare il trasduttore di pressione dal passaggio 2.4 (ad esempio, 1,5 pollici).
   3. Praticare due fori nella parte superiore del terzo morsetto e inserire due viti di plastica per un'ulteriore stabilizzazione del trasduttore di pressione durante la calibrazione del sistema nel passaggio 2.
9. Personalizza l'interno del supporto per animali (Figura 2A).
   1. Acquista e taglia un pezzo di tubo in PVC (diametro esterno 35 mm, diametro interno 26 mm, lunghezza 6,75 pollici) per la camera di contenimento interna del topo.
   2. Crea un foro di forma rettangolare (3 x 5 cm) a 1 pollice dall'estremità del tubo per esporre la testa del topo e la parte superiore delle spalle posteriori mentre il resto del corpo rimane schermato.
      NOTA: Se il sito della lesione del SNC si trova più in basso sulla schiena del topo (ad esempio, la colonna vertebrale toracica o lombare), ingrandire il foro rettangolare.
10. Personalizza l'esterno del supporto per animali (Figura 2B).
    1. Acquista e taglia un pezzo di tubo in PVC (diametro esterno 44 mm, diametro interno 35 mm, lunghezza 6 pollici) per la camera di contenimento esterna del topo.
    2. Costruire un'apertura di esposizione (Figura 2C) all'interno della camera di contenimento esterna per un controllo preciso del sito della lesione del SNC.
    3. Creare un'apertura reciproca sul lato opposto per inserire il cilindro del trasduttore di pressione durante la calibrazione del sistema nel passaggio 2 (ad esempio, un foro da 9 mm).
11. Modificare l'esterno del supporto per animali per accogliere l'erogazione dell'anestesia gassosa. Se invece verrà utilizzato un anestetico iniettabile, saltare questo passaggio.
    1. Sigillare un'estremità dell'esterno del supporto per animali con del nastro adesivo. Garantire una perfetta aderenza per evitare perdite di gas.
    2. Creare un piccolo foro nel sigillo per inserire la linea di anestesia.
    3. Posizionare la linea di anestesia per introdurre l'isoflurano nell'ambiente del tubo senza contatto diretto con l'animale.

2. Calibrazione del sistema

1. Collegare un trasduttore di pressione (Figura 2D; vedere la Tabella dei materiali per le opzioni) a un sistema di acquisizione dati (DAQ) e a un computer per tradurre le letture della pressione fisica in dati digitali.
   1. Collegare il trasduttore di pressione al modulo DAQ (vedere la tabella dei materiali), assicurandosi della corretta polarità e dei collegamenti sicuri.
   2. Inserire il modulo DAQ in uno chassis DAQ (vedere Tabella dei materiali) per consentirgli di ricevere alimentazione e comunicare con il computer.
   3. Utilizzare un cavo USB per collegare lo chassis DAQ al computer.
   4. Assicurarsi che il computer disponga del software e dei driver necessari per l'interfacciamento con l'hardware DAQ e l'acquisizione dei dati (vedere la tabella dei materiali per le opzioni).
2. Configurare le impostazioni del sistema DAQ.
   1. Aprire il software DAQ installato.
   2. Assicurarsi che il sistema DAQ sia riconosciuto dal computer.
   3. Consultare le specifiche e le schede tecniche di calibrazione per il modulo/chassis DAQ e il trasduttore di pressione specifici e configurare le impostazioni del sistema DAQ:
      NOTA: le impostazioni DAQ per l'hardware DAQ utilizzato in questo manoscritto sono disponibili pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere all'archivio all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Ingresso analogico: selezionare il canale di ingresso fisico sul modulo DAQ a cui è collegato il trasduttore di pressione.
      2. Sorgente di eccitazione (sorgente Vex): specificare la sorgente di eccitazione del modulo DAQ (ad esempio, interna o esterna).
      3. Tensione di eccitazione (valore Vex): Impostare il valore vex sul valore specificato dal produttore del trasduttore di pressione (ad es. 5 o 10 V).
      4. Tipo di bridge: scegliere il tipo di bridge appropriato del modulo DAQ (ad esempio, bridge intero, mezzo bridge o quarter bridge).
      5. Resistenza del ponte: Impostare la resistenza del ponte sul valore specificato dal produttore del trasduttore di pressione (ad es. 350 ).
      6. Fattore di calibrazione/Scala personalizzata: Configurare la scala in base alla scheda tecnica di calibrazione fornita dal produttore del trasduttore di pressione. Il produttore calibra il trasduttore di pressione applicando un'unità fisica nota (psi) e misurando le unità elettriche risultanti (mV/V). Creare una curva di calibrazione tracciando le unità fisiche note rispetto alle unità elettriche ottenute.
      7. Frequenza di campionamento (Hz): imposta la frequenza di campionamento su un valore sufficientemente alto da catturare la dinamica delle variazioni di pressione senza aliasing (ad esempio, 1 o 10 kHz a seconda della velocità delle variazioni di pressione nell'esperimento).
         NOTA: Più stretta è la forma d'onda dell'aria di sovrapressione (cioè più rapidamente cambia pressione), più ampia è la gamma di frequenza che eccita e quindi maggiore deve essere la frequenza di campionamento. Ciò è particolarmente importante negli esperimenti che coinvolgono modelli di lesione del SNC in cui le variazioni di pressione possono verificarsi rapidamente.
3. Creare uno strumento digitale nel software DAQ per l'acquisizione dei dati.
   NOTA: Questo strumento digitale verrà utilizzato per misurare, registrare, visualizzare e analizzare con precisione le pressioni di uscita del sistema. Lo strumento digitale utilizzato in questo manoscritto è disponibile pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere all'archivio all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Implementa algoritmi di elaborazione del segnale per filtrare, amplificare o elaborare in altro modo i dati grezzi dal trasduttore.
   2. Aggiungi strumenti di analisi per calcolare metriche come la pressione di picco, la pressione media e la durata degli eventi di pressione.
   3. Incorpora elementi visivi (ad esempio, grafici) per mostrare i dati di pressione in tempo reale ed elementi di controllo per avviare, arrestare e ripristinare l'acquisizione dei dati.
   4. Salva lo strumento digitale.
4. Misurare la pressione di uscita del sistema
   1. Inserire il trasduttore di pressione nello spesso clamp sul tavolo x-y e la sua canna attraverso il foro del supporto per animali (creato al punto 1.10.3).
   2. Regolare la canna del trasduttore di pressione fino a quando la punta non si trova esattamente nella posizione del sito della lesione del SNC.
   3. Fissare il trasduttore di pressione con due viti di plastica (installate al punto 1.8.3).
5. Esegui lo strumento digitale nel software di acquisizione dati mentre rilasci il grilletto della pistola da paintball per acquisire, analizzare e visualizzare la pressione di uscita del sistema.
6. Regolare la vite di regolazione fino a quando la pressione di uscita del sistema non raggiunge il livello desiderato.
   NOTA: Dopo aver modificato la canna della pistola da paintball in modo che non sia fenestrata, 1.5 pollici di lunghezza e 6.5 mm di diametro, il sistema è in grado di fornire in modo affidabile livelli di aria di sovrapressione nell'intervallo 15-50 psi a 5 mm dalla parte anteriore della canna³⁴. I livelli di sovrapressione dell'aria inferiori a 15 psi e superiori a 50 psi mostrano una grande variabilità di intensità. Per una visualizzazione completa della pressione di uscita del sistema (psi) in funzione della pressione di ingresso (psi), della distanza dal barilotto (cm) e del tempo (ms), vedere la Figura 2 di Hines-Beard et al.34. Utilizzando questo sistema, utilizzare l'azoto compresso al posto dell'aria compressa per ottenere in modo affidabile livelli di sovrapressione dell'aria superiori a 50 psi.

3. Preparazione degli animali ed esposizione all'aria da sovrapressione

1. Anestetizzare il topo con isoflurano in una camera di induzione con isoflurano all'1,5-3^%30,31,32,33 in ossigeno fino a completa sedazione.
   1. Confermare l'anestesia valutando l'assenza di risposta a un pizzicamento del dito del piede.
   2. Fissa il topo nel supporto interno dell'animale con la testa e la parte superiore delle spalle posteriori esposte attraverso l'apertura rettangolare, mentre il dorso e gli arti posteriori inferiori rimangono protetti.
   3. Sostieni la testa del topo con un cuscino fissato al segmento inferiore intatto del supporto interno dell'animale.
   4. Fissare il mouse applicando del nastro chirurgico sulla parte superiore delle spalle posteriori.
   5. Inserire il supporto per animali interno nel supporto per animali esterno.
   6. Aprire la linea di anestesia secondaria per l'erogazione di isoflurano all'interno del supporto per animali.
   7. Posizionare un cuscino aggiuntivo all'estremità del supporto per animali per evitare che l'anestetico fuoriesca dal tubo e per evitare che il topo si muova durante l'esposizione all'aria sovrapressiva.
2. Mandata dell'aria di sovrapressione
   1. Allinea l'apertura circolare di 4 mm del supporto esterno dell'animale direttamente sopra l'occhio sinistro del mouse.
   2. Posizionare il supporto dell'animale utilizzando le manopole di controllo sul tavolo x-y in modo che la sua apertura sia allineata con la canna della pistola da paintball e la superficie esterna sia a 5 mm dall'estremità della canna.
      NOTA: Regolare la distanza dell'animale dall'estremità della canna per modificare il livello e la forma dell'aria di sovrapressione (psi). Sposta l'animale più lontano dal barile per abbassare il livello dell'aria di sovrapressione e creare un'onda d'aria di sovrapressione più diffusa.
   3. Avviare la sequenza di sovrapressione dell'aria per indurre ITON:
      1. Erogare due raffiche di aria in sovrapressione da 15 psi a un intervallo di 0,5 s ripetute quotidianamente per 3 giorni 29,30,31,32.
         NOTA: Un ITON simile può essere indotto tramite l'erogazione di tre raffiche consecutive di aria in sovrapressione da 15 psi separate da intervalli di 0,5 s²³. Il grado di ITON che risulta dopo l'erogazione di sei raffiche consecutive di aria in sovrapressione a 15 psi separate da intervalli di 0,5 s è mostrato qui in Risultati rappresentativi.
      2. Esponi i topi finti al rumore dell'aria in sovrapressione, ma non all'aria in sovrapressione stessa ruotando il supporto dell'animale in modo che l'apertura non sia più rivolta verso la canna e blocca l'aria con uno scudo di cartone.
3. Recupero del mouse
   1. Lascia che i topi si riprendano dall'anestesia.
      1. Somministrare colliri lubrificanti (vedere Tabella dei materiali) per evitare che gli occhi si secchino a causa dell'anestesia.
      2. Fornire calore utilizzando un supporto di riscaldamento controllato (vedi Tabella dei materiali).
   2. Monitora visivamente i topi fino a quando non mantengono una postura eretta e camminano normalmente. Permetti loro di stare in compagnia dei loro compagni di gabbia.
   3. Fornire a tutti i topi esposti all'aria di sovrapressione cibo per il recupero in gel (vedi Tabella dei materiali) per i primi 3 giorni dopo l'infortunio per prevenire la perdita di peso.

4. Raccolta e trattamento dei tessuti

1. Eutanasia dei topi tramite iniezione intraperitoneale di Avertin Working Solution.
   1. Preparare il brodo Avertin mescolando 10 g di 2,2,2,-tribromoetanolo (vedi Tabella dei materiali) con 10 mL di 1-Pentanolo (vedi Tabella dei materiali). Conservare al buio a 4 °C.
   2. Preparare la soluzione di lavoro Avertin combinando 1,25 mL di Stock Avertin, 45 mL di acqua distillata doppia e 5 mL di PBS 10x (vedere la Tabella dei materiali) in una provetta da 50 mL. Filtrare, sterilizzare la miscela e conservare al buio a 4 °C.
2. Perfondere transcardicamente i topi con paraformaldeide al 4% (vedi Tabella dei materiali) in 1x PBS (vedi Tabella dei materiali).
3. Enucleare l'occhio esposto all'aria sovrapressurizzata utilizzando una pinza fine (vedi Tabella dei materiali) e delle forbici (vedi Tabella dei materiali), assicurandoti di preservare il nervo ottico (ON).
4. Raccogliere l'ON insieme al tessuto oculare enucleato per ulteriori analisi.
5. Osmicato ON tessuto.
   1. Postfix ON tissue overnight in paraformaldeide al 4% e glutaraldeide al 2% (vedi Tabella dei materiali) in 1x PBS. Se si lavora con tessuto che non è stato perfuso (come nel passaggio 4.2), applicare il postfix per 5 giorni invece che durante la notte.
   2. Trasferire il tessuto ON su una piastra a 12 o 24 pozzetti (vedere Tabella dei materiali) con 1x PBS utilizzando un pennello (vedere Tabella dei materiali) o un bastoncino di legno affilato.
   3. In una cappa aspirante, sostituire 1xPBS con tetrossido di osmio al 2% (vedi Tabella dei materiali) in tampone di cacodilato 0,2 M (la ricetta è disponibile pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere al repository all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) utilizzando una pipetta di trasferimento. Incubare su ghiaccio per 2 ore.
   4. Esegui tre lavaggi con 1x PBS
      1. Smaltire i rifiuti di osmio in modo appropriato.
      2. Lasciare la piastra nella cappa aspirante per due notti dopo il terzo lavaggio PBS.
6. Disidratare il tessuto ON in una serie di etanolo graduato.
   1. Trasferire i nervi in una nuova piastra con etanolo al 50% e incubare per 30 minuti.
   2. Sostituire con etanolo al 70% per 30 minuti.
   3. Sostituire con etanolo al 95% per 30 minuti.
   4. Sostituire con etanolo al 100% per 30 minuti.
7. Incorporare il tessuto in epon.
   NOTA: La ricetta di Epon è disponibile pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere al repository all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; vedere la Tabella dei materiali per i materiali elencati nella ricetta.
   1. Giorno 1: Trasferire il tessuto in un flaconcino da 2 ml con ossido di propilene (vedere Tabella dei materiali)/etanolo al 100% (1:1) e agitare per 30 minuti a temperatura ambiente. Sostituire con ossido di propilene puro e agitare per 15 minuti, ripetendo una volta. Sostituire con ossido di propilene/epon (1:1) e agitare per una notte nella cella frigorifera.
   2. Giorno 2: Trasferire il tessuto in una piastra a 12 o 24 pozzetti con epon al 100% e agitare per 4 ore a temperatura ambiente. Sostituire con epon fresco al 100% e incubare per una notte a temperatura ambiente sottovuoto.
   3. Giorno 3: Ripetere l'incubazione degli eponi come il giorno 2.
   4. Giorno 4: Trasferire il tessuto in uno stampo piatto con epon al 100%, riorientare il tessuto e metterlo in forno a 60 °C per 48 ore.
8. Sezione ON tessuto.
   1. Taglia gli stampi sotto un cannocchiale da dissezione in una doppia piramide con il nervo al centro.
   2. Raccogli sezioni trasversali spesse 700 nm utilizzando un ultramicrotomo e un coltello diamantato (vedi Tabella dei materiali).
   3. Raccogliere le sezioni sui vetrini da microscopio in vetro bianco carichi utilizzando acqua distillata.
   4. Asciugare i vetrini in forno a 60 °C fino a quando l'acqua evapora. Raffreddare a temperatura ambiente.
9. Macchia sul tessuto.
   1. Immergere i vetrini in parafenilendiammina (PPD) all'1% (vedere la Tabella dei materiali) in una miscela 1:1 di metanolo e 2-propanolo per 28 minuti.
   2. Sciacquare i vetrini in due miscele consecutive di metanolo 1:1 (vedi Tabella dei materiali) e 2-propanolo (vedi Tabella dei materiali) per 1 minuto ciascuna.
   3. Sciacquare i vetrini in etanolo al 100% per 1 minuto e lasciare asciugare all'aria.
   4. Posizionare i vetrini in una scatola umida e coprire le sezioni con l'1% di blu di toluidina (vedere la Tabella dei materiali) utilizzando una pipetta di trasferimento.
   5. Incubare in forno a 60 °C per 20 min.
   6. Sciacquare i vetrini con acqua distillata doppia e lasciarli asciugare all'aria.
10. Monta e crea immagini su tessuto.
    1. Vetrini coprioggetti utilizzando supporti di montaggio (vedi Tabella dei metodi), rimuovendo i supporti in eccesso.
    2. Lasciare asciugare i vetrini per una notte.
    3. Immagini di sezioni trasversali utilizzando la microscopia a campo chiaro con un obiettivo a immersione in olio 100x.
11. Incorporare, sezionare e colorare immunoistochimicamente il tessuto retinico.
    1. Postfix intero tessuto oculare in paraformaldeide al 4% per 2-4 ore.
    2. Crioproteggere l'intero tessuto oculare con il 30% di saccarosio (vedi Tabella dei materiali in 1x PBS durante la notte a 4 °C.
    3. Incorporare il tessuto oculare in un mezzo di congelamento (vedi Tabella dei materiali).
    4. Raccogliere sezioni trasversali di retina spesse 10 μm su un criostato e montare le sezioni su vetrini da microscopio in vetro bianco carichi (vedi Tabella dei materiali).
    5. Lavare i vetrini in 1x PBS e incubare in un tampone bloccante (5% Triton X-100 e 2% albumina sierica bovina (BSA) (vedere Tabella dei materiali) in 1x PBS) con il 5% di siero d'asino normale (NDS) (vedere Tabella dei materiali) a temperatura ambiente per 30 minuti.
    6. Incubare i vetrini per una notte a 4 °C (o a temperatura ambiente per 4 ore) in anticorpo primario (vedere la Tabella dei materiali) in Triton X-100 allo 0,5% (vedere la Tabella dei materiali) in 1xPBS (PBT).
    7. Lavare i vetrini in PBT e incubare in anticorpi secondari (vedi tabella dei materiali) in tampone bloccante con NDS al 5%.
    8. Lavare i vetrini in PBT, applicare il mezzo di montaggio con DAPI (vedere la tabella dei materiali), il vetrino coprioggetti e sigillare con lo smalto per unghie.
    9. Vetrini di immagini su un microscopio a epifluorescenza.
    10. Se si quantifica l'intensità della fluorescenza, assicurarsi che le immagini vengano acquisite dalla stessa regione retinica con impostazioni di ingrandimento, guadagno ed esposizione identiche.
12. Conta sugli assoni.
    1. Contare manualmente il numero di assoni utilizzando un software di analisi delle immagini (vedere la Tabella dei materiali) campionando il 20% dell'area totale della sezione trasversale del nervo utilizzando una griglia fissa sovrapposta per stimare la densità degli assoni (assoni/mm²).
    2. Misurare l'area della sezione trasversale ON.
       1. Utilizzare la funzione Imposta scala per impostare i pixel/micron per l'obiettivo utilizzato per l'immagine.
       2. Utilizzare lo strumento di selezione Poligono per tracciare lungo la guaina mielinica del nervo ottico, escludendo il sistema vascolare.
       3. Misurare l'area dell'ON utilizzando la funzione Misura .
       4. Determinare il 20% dell'area totale moltiplicando l'area misurata per 0,2.
    3. Sovrapporre la griglia fissa alla sezione trasversale ON.
       1. Scarica il plug-in Counting Array.
          NOTA: questo plug-in è disponibile pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere all'archivio all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Aprire il plug-in Counting Array per sovrapporre una griglia fissa in cima alla sezione trasversale, composta da 9 quadrati equidistanti a forma di segno più.
       3. Modificare l'area per ciascuna delle 9 regioni dividendo per 9 il 20% dell'area totale della sezione trasversale ON (calcolata al punto 4.6.2.4).
       4. Centrare la griglia fissa in modo che il centro del segno più sia centrato al centro della sezione trasversale ON.
    4. Conta separatamente gli assoni viventi e degenerati.
       1. Scaricare e aprire il plug-in Cell Counter.
          NOTA: questo plug-in è disponibile pubblicamente su GitHub. I lettori interessati possono accedere all'archivio all'indirizzo https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Per ciascuna delle 9 regioni, contare separatamente il numero di profili assonici viventi e degeneranti visualizzando le condizioni della guaina mielinica. Assicurarsi che la quantificazione degli assoni venga eseguita mentre si è all'oscuro del gruppo sperimentale dell'animale per evitare distorsioni.
       3. Per gli assoni vivi, cerca quelli in cui la guaina mielinica appare intatta, uniformemente colorata e circondata in modo uniforme e uniforme attorno all'assone.
       4. Per gli assoni degenerati, cerca quelli con un ispessimento, una cipolla o un collasso della guaina mielinica.
       5. Se l'assone è parzialmente tagliato dalla griglia sovrapposta, includerlo nel conteggio degli assoni solo se si vede il lume.
       6. Assicurarsi che gli assoni oblunghi non vengano contati accidentalmente più di una volta e non confondere detriti o polvere con un profilo assonale degenerato.
    5. Eseguire analisi statistiche per verificare la presenza di differenze significative nella conta media degli assoni tra i gruppi. Assicurarsi che in ciascun gruppo siano inclusi almeno quattro ON per tenere conto della normale variabilità osservata nelle analisi precedenti.
       1. Eseguire un t-test di campioni indipendenti (noto anche come t-test di Student per campioni indipendenti) per valutare le differenze significative tra le medie di due gruppi indipendenti.
       2. Eseguire l'alternativa non parametrica, il test U di Mann-Whitney, se le condizioni per un test t di campioni indipendenti non possono essere soddisfatte (ad esempio, se i dati non sono distribuiti normalmente o le dimensioni del campione sono troppo piccole).

Discussione

Questo sistema personalizzato di sovrapressione dell'aria è uno strumento utile per lo studio delle lesioni del SNC in sistemi chiusi nei modelli murini. I risultati rappresentativi dell'esperimento di esempio dimostrano che l'erogazione focale di aria in sovrapressione utilizzando questo sistema può indurre efficacemente l'ITON, con conseguente significativa perdita e degenerazione degli assoni. Ciò evidenzia la capacità del sistema di produrre lesioni precise e riproducibili al SNC.

Uno dei principali punti di forza di questo sistema è la sua personalizzazione per indurre una serie di lesioni del SNC. La gravità della lesione può essere regolata modificando la pressione di uscita complessiva del sistema, la distanza dell'animale dall'estremità della canna utilizzando la fase di posizionamento x-y, le dimensioni e la forma dell'apertura di esposizione, il numero di esposizioni all'aria sovrapressurizzata e l'intervallo tra le esposizioni. Inoltre, la posizione della lesione del SNC può essere regolata modificando la posizione dell'apertura di esposizione all'interno del supporto dell'animale. Questa versatilità ha permesso al sistema di produrre uno spettro di lesioni del SNC a sistema chiuso in modelli murini. Inizialmente, il sistema è stato utilizzato per modellare le lesioni a globo chiuso, concentrandosi sul danno ai poli anteriore e posteriore e sui relativi deficit^34,36, inclusi gli impatti della risposta del sistema immunitario³⁷, gli esiti specifici del ceppo³⁸ e l'efficacia degli agenti neuroprotettivi³⁹. Alla fine, questa applicazione si è espansa per valutare le sequele di esposizioni ripetute dirette agli occhi per modellare la neuropatia ottica traumatica indiretta (ITON)³⁰ ed esplorare l'effetto del numero e dell'intervallo tra le esposizioni ripetute³³. Da allora, l'applicazione del sistema si è ampliata per modellare la lesione cerebrale traumatica lieve a testa chiusa (mTBI) attraverso esposizioni dirette alla testa^40,41 e la lesione del midollo spinale a corpo chiuso (SCI) attraverso esposizioni dirette al dorso⁴², sottolineando l'adattabilità e la versatilità del dispositivo nello studio di vari domini di lesione del SNC.

Quando si utilizza questo sistema, è fondamentale adottare misure per ridurre al minimo la variabilità degli esiti delle lesioni per garantire la riproducibilità e l'affidabilità dei risultati sperimentali. Le misure chiave includono la calibrazione dei livelli di pressione di uscita del sistema prima e dopo ogni serie di tre esposizioni per garantire un'erogazione di pressione costante. Sebbene la variabilità sia bassa quando il sistema viene utilizzato tra 15 psi e 50 psi quando si utilizza aria compressa³⁴, una calibrazione coerente aiuta a rilevare errori imprevisti, come batteria scarica o aria scarica. Inoltre, posizionare ogni animale alla stessa distanza dall'estremità del barile per garantire un'entità di sovrapressione costante, poiché l'intensità dell'onda di pressione diminuisce con la distanza. Il posizionamento uniforme garantisce inoltre che ogni animale sia influenzato dalla stessa parte dell'onda radio. Inoltre, il fissaggio uniforme degli animali all'interno del supporto garantisce che il tessuto di interesse sia mirato in modo coerente, specialmente nei modelli a esposizione ripetuta quando c'è il rischio di movimento. Infine, l'uniformità dell'età, del sesso e del background genetico degli animali è fondamentale in quanto questi fattori influenzano la risposta alle lesioni. Ad esempio, studi precedenti che utilizzavano questo sistema hanno confrontato gli effetti dell'aria di sovrapressione diretta verso l'occhio su diversi ceppi di topi, evidenziando differenze significative nella risposta alla lesione tra i topi C57Bl/6J³⁶, DBA/2J³⁷ e Balb/c³⁸ . I topi DBA/2J e Balb/c hanno mostrato patologie del polo anteriore più gravi, maggiore danno retinico, stress ossidativo più elevato e risposte neuroinfiammatorie più pronunciate rispetto ai topi C57Bl/6J con topi Balb/c che hanno mostrato profili di lesione particolarmente robusti e duraturi³⁸.

Risoluzione dei problemi di sistema
Se i valori di pressione sono insolitamente bassi per una determinata impostazione del manometro, premere il grilletto 5-10 volte, consentendo all'aria di passare attraverso il sistema e al regolatore di regolare una nuova impostazione. Non devono esserci perdite nel serbatoio dell'aria. L'O-ring sul serbatoio dell'aria non deve essere danneggiato o usurato, il serbatoio dell'aria deve avere abbastanza aria e la batteria della pistola non deve essere scarica. La tavola x-y non deve essersi allontanata dalla sua posizione abituale dall'estremità della canna e l'apertura di esposizione all'aria da sovrapressione deve essere allineata con la canna dell'arma e non occlusa. Il regolatore deve essere fissato saldamente all'impugnatura della pistola. Se i valori di pressione sono troppo bassi nonostante si utilizzi l'impostazione più alta sul manometro, il manometro non deve essere aumentato oltre i 200 psi e l'impostazione della velocità sulla pistola deve essere regolata sull'impostazione massima. Se le impostazioni di pressione sono incoerenti (ad esempio, alta e bassa), assicurarsi che il serbatoio dell'aria abbia abbastanza aria, che il regolatore sia saldamente fissato all'impugnatura della pistola, che non ci siano perdite nel serbatoio dell'aria e che sia avvitato saldamente e che l'O-ring sul serbatoio dell'aria non sia danneggiato o usurato.

Per comprendere in modo completo tutte le capacità di questo sistema, è importante riconoscerne i limiti. Imitare gli scenari del mondo reale in un ambiente di laboratorio rimane una sfida. Sebbene questo sistema generi aria in sovrapressione, non replica le complesse dinamiche di un evento esplosivo, come i gradienti di pressione e temperatura variabili, la presenza di detriti e onde riflesse e una natura multifasica. Inoltre, non imita una forma d'onda di Friedlander ("onda d'urto primaria"), che è caratterizzata da un picco di pressione brusco e quasi istantaneo seguito da un rapido decadimento esponenziale che scende al di sotto della pressione ambiente prima di tornare alla linea di base⁴³. Piuttosto, la forma d'onda prodotta da questo sistema rappresenta un profilo più semplice e simmetrico in cui c'è un aumento e una diminuzione più graduali della pressione senza una fase negativa distinta (vedi Figura 2C in Hines-Beard et ^al.34). In modo un po' vantaggioso, questa forma d'onda combina elementi di lesioni da esplosione e da contundente. L'"impulso di pressione" a forma di campana fornisce un impatto di sovrapressione costante, simile a un "muro d'aria" che colpisce il soggetto. Tuttavia, l'aria di sovrapressione erogata dall'onda è anche un aspetto caratteristico chiave delle lesioni da esplosione. Alcuni potrebbero obiettare che, sebbene questa forma d'onda includa aspetti di entrambi i tipi di lesioni, non cattura completamente la complessità di nessuno dei due. Tuttavia, questo "impulso di pressione" costante e riproducibile è ideale per esperimenti controllati in un ambiente di laboratorio per studiare la lesione focale del SNC in sistema chiuso. Abbiamo già dimostrato la natura focale della lesione. Ad esempio, l'esposizione a un occhio non provoca danni all'epitelio nasale primario o al cervello⁴⁴. Inoltre, quando è diretto al lato della testa del topo, viene colpita una piccola area del cervello⁴⁵. Infine, l'energia dell'aria di sovrapressione proveniente da questo sistema al livello di pressione utilizzato per ITON non ha influenzato il topo a meno che non sia stata ripetuta con un breve intervallo di tempo³³. Pertanto, la pressione non è dannosa e quindi non replica una forza di fine getto. Inoltre, anche con l'esposizione ripetuta dell'aria da sovrapressione all'occhio, non vi è stato alcun effetto sulle strutture oculari anteriori³³. La degenerazione significativa del nervo ottico e la perdita della vista si sono verificate solo con esposizione ripetuta con un intervallo tra esposizioni inferiore a 1 minuto^{e 33}.

Rispetto ad altri dispositivi di laboratorio per la creazione di lesioni del SNC a sistema chiuso, questo sistema offre vantaggi unici. È in grado di erogare raffiche sequenziali di aria in sovrapressione in rapida successione (intervalli di 0,5 s)³³, imitando le condizioni in ambienti professionali ad alto rischio in cui le esposizioni rapide alle esplosioni sono un pericolo comune. Ad esempio, il personale militare, sia in scenari di addestramento che di combattimento, utilizza una serie di armi da fuoco automatiche in grado di sparare rapidamente e ripetutamente, tra cui fucili automatici (ad esempio, M16, AK-47), mitragliatrici (ad esempio, M2 calibro .50), mitragliatrici Gatling e minigun. Altre armi più lente ma ripetitive utilizzate dal personale militare includono artiglieria, mortai, granate e ordigni esplosivi improvvisati (IED). Anche i demolitori coinvolti nella demolizione controllata e i minatori coinvolti nelle operazioni di brillamento per frantumare la roccia ed estrarre minerali subiscono esplosioni sequenziali in rapida successione. Infine, i lavoratori edili che utilizzano strumenti pneumatici, battipalo o altre attrezzature pesanti che generano potenti forze percussive possono subire impatti ripetuti rapidi che imitano l'esposizione alle esplosioni. In particolare, l'erogazione rapida di aria in sovrapressione non è possibile con dispositivi come i tubi d'urto che richiedono un'ampia riconfigurazione o ripressurizzazione tra ogni evento. I tubi d'urto utilizzano diaframmi che scoppiano per generare onde d'urto e, dopo ogni scoppio, il diaframma deve essere sostituito. Questo processo richiede tempo, poiché il tubo d'urto deve essere aperto, il diaframma esaurito rimosso, un nuovo diaframma installato e il sistema ha avuto il tempo di resettare e ripressurizzare. Pertanto, soprattutto per gli studi che indagano il danno al SNC dopo una rapida esposizione ripetuta all'esplosione, un sistema che non richieda un'ampia riconfigurazione o ripressurizzazione tra ogni evento è l'ideale.

Le applicazioni future di questo sistema modulare, facile da usare ed economico sono promettenti. Sfruttando le sue caratteristiche adattabili e uniche, questo sistema apre diverse strade promettenti per futuri studi terapeutici preclinici. La sua capacità di erogare raffiche rapide e sequenziali di aria sovrapressurizzata può essere sfruttata per studiare gli effetti cumulativi di esposizioni ripetute alle esplosioni, il che è rilevante per comprendere l'encefalopatia traumatica cronica e altre condizioni neurodegenerative a lungo termine. Inoltre, questo sistema può essere utilizzato per esplorare l'efficacia di vari interventi farmacologici volti a mitigare le lesioni del SNC a sistema chiuso, compresi i tempi e il dosaggio dei farmaci neuroprotettivi per determinare le finestre di trattamento ottimali. Inoltre, la precisione del sistema nell'imitare gli aspetti dei meccanismi di lesione contundente e da esplosione consente lo sviluppo di modelli di lesione completi che riflettono il complesso trauma vissuto dagli individui in scenari del mondo reale. Ciò può facilitare la sperimentazione di terapie multimodali che affrontano aspetti globali comuni della lesione, come l'infiammazione, lo stress ossidativo e la morte neuronale. Nel complesso, questo dispositivo offre una piattaforma versatile e potente per far progredire la nostra comprensione delle lesioni del SNC a sistema chiuso e sviluppare interventi terapeutici efficaci.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software