Système pour lésion focale du système nerveux central en système fermé

Résumé

Ce protocole décrit un système d’air de surpression personnalisé conçu pour induire des lésions du système nerveux central (SNC) en système fermé chez la souris, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. L’objectif de ce protocole est de fournir un cadre permettant aux chercheurs d’adapter et d’étendre facilement le système pour leurs études uniques sur les traumatismes du SNC.

Résumé

La prévalence des lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) souligne la nécessité d’une meilleure compréhension de ces traumatismes afin d’améliorer les interventions protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette recherche. Dans ce contexte, un système d’air de surpression personnalisé a été conçu pour reproduire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins, y compris des traumatismes oculaires, cérébraux et de la moelle épinière. À ce jour, le système a été utilisé pour administrer de l’air de surpression dirigé vers les yeux, la tête ou la colonne vertébrale afin de modéliser les lésions du pôle antéropostérieur de l’œil, la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON), les lésions cérébrales traumatiques focales et les lésions de la moelle épinière. Cet article fournit un protocole détaillé décrivant la conception et le fonctionnement du système et présente des résultats représentatifs démontrant son efficacité. Le cadre solide présenté ici fournit une base solide pour la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. En tirant parti des attributs flexibles du système, les enquêteurs peuvent modifier et contrôler soigneusement l’emplacement, la gravité et le moment des blessures. Cela permet des comparaisons complètes des mécanismes moléculaires et de l’efficacité thérapeutique de plusieurs lésions du SNC en système fermé.

Introduction

Les lésions du système fermé du système nerveux central (SNC) sont des blessures causées par des lésions au cerveau ou à la moelle épinière sans causer de rupture du crâne ou de la colonne vertébrale. Ces blessures comprennent les traumatismes crâniens (TCC) et les lésions de la moelle épinière (LME) et peuvent survenir à la suite de divers incidents, y compris des blessures contondantes (p. ex., chutes, blessures sportives, accidents de la route) et des explosions explosives. Les lésions du SNC en système fermé sont généralement considérées comme moins graves que les lésions pénétrantes du SNC, mais elles se produisent plus souvent. Cependant, à l’instar des blessures pénétrantes, les lésions du SNC en système fermé peuvent entraîner des problèmes de santé à long terme et progressifs, en particulier après des événements répétés 1,2,3,4,5,6. Il est inquiétant de constater que même les lésions subcliniques du SNC en système fermé, qui ne répondent pas aux critères diagnostiques d’un traumatisme crânien ou d’une lésion médullaire après un seul événement 7,8,9,10,11,12,13, peuvent évoluer vers des maladies neurodégénératives chroniques après des lésions répétées ^6,14,15,¹⁶. Cela souligne la nécessité urgente de mieux comprendre les mécanismes et les conséquences des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé.  Ces connaissances sont impératives pour améliorer les approches protectrices et thérapeutiques. Des modèles animaux qui reproduisent les lésions du SNC en système fermé sont essentiels à cette entreprise.

Les modèles animaux actuels de lésions du SNC en système fermé ont joué un rôle déterminant dans l’avancement de notre compréhension de la physiopathologie et des interventions protectrices et thérapeutiques potentielles pour ces traumatismes. Les rongeurs sont particulièrement populaires en raison de leur faible coût, de leur disponibilité, de leur manipulabilité génétique, de leur facilité de manipulation, de leurs tests comportementaux et physiologiques bien établis et de considérations éthiques plus favorables¹⁷. Les méthodes courantes pour induire un TCC en système fermé chez les rongeurs comprennent les dispositifs de chute de poids^18,19, les dispositifs d’impact cortical contrôlé (CCI)²⁰ et les tubes de choc à air comprimé²¹. Pour les lésions médullaires, les modèles de traumatisme contondant nécessitent généralement une laminectomie^22,23 ou d’autres techniques chirurgicales²⁴ pour accéder directement à la moelle épinière ou à l’espace péridural. Cependant, des modèles de lésions par souffle à fuselage minime à corps fermé ont été mis au point à l’aide de tubes de choc à air comprimé ²⁵. Bien qu’ils fournissent des informations précieuses, chacun de ces modèles présente des limites uniques. Les modèles de perte de poids peuvent présenter une grande variabilité et un contrôle limité de l’emplacement et de la gravité des blessures, ce qui soulève des préoccupations expérimentales et éthiques quant à la cause de blessures graves et incontrôlées²⁶. Les dispositifs CCI offrent une précision mais nécessitent une formation pour fonctionner, peuvent impliquer une craniotomie et peuvent souffrir d’une variabilité mécanique affectant la reproductibilité²⁷. Les tubes à chocs sont généralement moins invasifs, mais peuvent être difficiles à acquérir, complexes à installer et à utiliser, et peuvent créer des conditions de blessure irréalistes et très variables en raison de facteurs environnementaux, de réflexions d’ondes et d’interactions de pression complexes²⁸.

Pour mieux étudier les mécanismes et les effets des lésions uniques et répétées du SNC en système fermé et de leurs traitements, cet article présente une méthode modulaire, conviviale, rentable et non invasive. L’objectif principal de cette approche est de permettre un contrôle précis et une modification souple des paramètres des blessures, y compris l’emplacement, la gravité et le moment. À l’appui de cet objectif, ce manuscrit fournit un protocole détaillé pour la construction, l’étalonnage et le dépannage d’un système d’air de surpression, qui aborde certaines des limites des dispositifs existants de lésions du SNC en système fermé. Ce système offre non seulement une rentabilité et un temps de configuration minimal, mais il est également très polyvalent, fournissant des résultats cohérents et reproductibles tout en minimisant les problèmes éthiques et en maximisant la pertinence clinique. De plus, la capacité du système à produire une gamme de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins est décrite, ainsi que ses applications potentielles dans des études futures. Notamment, l’objectif de ce manuscrit est de fournir un cadre qui permet aux chercheurs d’acquérir, d’adapter et d’étendre facilement ce système pour leurs besoins spécifiques, faisant ainsi avancer la recherche en cours sur les traumatismes du SNC. Des résultats représentatifs démontrant l’efficacité du système à induire des traumatismes axonaux sont également présentés.

Protocole

Toutes les procédures ont été effectuées selon des protocoles approuvés par le^{29, 30, 31, 32} Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université Vanderbilt et selon les directives de l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC) et de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO). Toutes les souris ont été logées en groupe et maintenues sur un cycle lumière/obscurité de 12 heures et ont reçu de la nourriture et de l’eau à volonté. Des souris 30,31,33 C57 Bl/6 âgées de trois mois ont été utilisées dans ce protocole.

1. Construction du système

1. Procurez-vous un pistolet de paintball disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) doté d’un régulateur de pression d’air intégré.
2. Modifiez le canon (Figure 1A) si nécessaire.
   1. Si le canon d’origine est fenestré avec des ouvertures ou des perforations sur toute sa longueur, l’air comprimé peut s’échapper et se dissiper dans l’air, réduisant ainsi le niveau de pression de sortie maximal. Remplacez-le par l’achat d’un canon solide et non fenêtré pour augmenter la plage de pression de sortie (Figure 1, I).
   2. Si le canon d’origine est long et encombrant, raccourcissez-le en achetant un canon plus court de longueur personnalisée ou en utilisant un coupe-tube ou une scie.
   3. Si le canon d’origine ne produit pas le niveau de pression de sortie souhaité, modifiez le diamètre intérieur (taille de l’alésage) du canon en achetant un canon avec un diamètre d’alésage personnalisé. La diminution du diamètre de la taille de l’alésage d’origine augmentera la plage de pression de sortie, et vice versa.
3. Modifiez le régulateur (Figure 1B) si nécessaire.
   1. Retirez le capuchon de guidage pour permettre un accès direct à la vis de réglage (Figure 1, II) si le régulateur d’origine est livré avec un capuchon de guidage.
   2. Remplacez la vis à six pans plongeante par une vis à tête plate si la vis de réglage d’origine est livrée avec une douille à tête Allen.
4. Retirez le chargeur d’alimentation par gravité standard (c’est-à-dire le réservoir pour tenir et alimenter les balles de peinture dans le pistolet) et scellez le tube d’alimentation vertical (Figure 1, III) pour éviter les fuites de pression.
   1. Assurez-vous que le pistolet de paintball est déchargé et que la source d’air (réservoir de CO₂ ou d’air comprimé) est déconnectée avant de retirer le chargeur à alimentation par gravité.
   2. Localisez le goulot d’alimentation (Figure 1C) où le chargeur d’alimentation par gravité est fixé. Desserrez la pince du col d’entraînement à l’aide de l’outil approprié.
   3. Retirez le chargeur d’alimentation par gravité standard en le tirant vers le haut.
   4. Insérez un couvercle de goulot d’alimentation ou un bouchon pour sceller l’ouverture. Ceux-ci sont généralement disponibles dans les magasins de paintball ou en ligne et sont conçus pour s’adapter parfaitement au goulot d’alimentation, le scellant.
5. Assemblez une plate-forme (Figure 1D) pour le pistolet de paintball et une table de positionnement d’animaux x-y.
   1. Construisez la base de la plate-forme en coupant deux morceaux de panneaux de fibres de densité moyenne.
      REMARQUE : Selon la disponibilité et la préférence des matériaux, des matériaux alternatifs (par exemple, le contreplaqué) peuvent également être utilisés.
   2. Coupez un morceau carré plus petit de 1,5 x 1,5 pi.
   3. Coupez un morceau rectangulaire plus grand de 2,5 x 1,5 pi.
   4. Élevez et fixez la plus petite plate-forme de 3,5 pouces au-dessus de la plus grande plate-forme à l’aide de deux 2 x 4 s parallèles.
6. Fixez le pistolet de paintball modifié à la plate-forme.
   1. Posez le pistolet de paintball sur le côté sur la plus petite plate-forme de sorte que l’extrémité du canon dépasse d’un demi-pouce du bord.
   2. Fixez le pistolet de paintball à l’aide de supports de montage ou de pinces qui s’adaptent au canon et à la crosse du pistolet de paintball.
   3. Fixez un réservoir d’air sous pression (Figure 1E ; voir le tableau des matériaux) au régulateur du pistolet de paintball. Vous pouvez également connecter une conduite à pression directe à partir d’un réservoir d’azote comprimé pour augmenter la plage de niveaux de pression de sortie fiables.
   4. Si vous utilisez un réservoir d’air sous pression, fixez-le au panneau de fibres avec une sangle en tissu durable. Fixez la sangle à l’aide de vis ou de boulons et incluez un mécanisme de réglage pour un serrage et un desserrage faciles.
7. Fixez une table de positionnement x-y sur le plus grand morceau de panneau de fibres rectangulaire opposé au canon du pistolet de paintball à l’aide de vis ou de boulons (Figure 1F).
   REMARQUE : Une table de positionnement x-y (voir Table des matériaux), également connue sous le nom de platine x-y, peut être achetée auprès de divers fournisseurs, notamment des détaillants en ligne, des fournisseurs industriels et des fournisseurs d’équipements scientifiques. Lors de l’achat d’une table de positionnement x-y, tenez compte de la plage de course, de la capacité de charge, de la précision et du choix entre le réglage manuel ou la commande motorisée. Cette table de positionnement x-y permettra un mouvement et un positionnement précis de l’animal le long de deux axes : l’axe x (horizontalement vers ou loin du canon) et l’axe y (verticalement vers le haut ou vers le bas du canon).
8. Modifiez la table de positionnement x-y en installant trois pinces en PVC.
   1. Fixez deux pinces en PVC de 1 cm d’épaisseur de chaque côté de l’avant du canon à l’aide de vis ou de boulons. Assurez-vous que les pinces sont suffisamment larges pour accueillir le porte-animal des étapes 1.9 et 1.10 (par exemple, 1,5 po).
   2. Fixez une pince en PVC plus épaisse (4 cm) perpendiculairement et à l’opposé des deux pinces de 1 cm d’épaisseur à l’aide de vis ou de boulons. Assurez-vous que la pince est suffisamment large pour accueillir le transducteur de pression à partir de l’étape 2.4 (par exemple, 1,5 po).
   3. Percez deux trous en haut de la troisième pince et insérez deux vis en plastique pour une stabilisation supplémentaire du transducteur de pression lors de l’étalonnage du système à l’étape 2.
9. Personnalisez l’intérieur du support pour animaux (Figure 2A).
   1. Achetez et coupez un morceau de tube en PVC (35 mm de diamètre extérieur, 26 mm de diamètre intérieur, 6,75 pouces de long) pour la chambre de confinement intérieure de la souris.
   2. Créez un trou de forme rectangulaire (3 x 5 cm) à 1 pouce de l’extrémité du tube pour exposer la tête et les épaules postérieures supérieures de la souris tandis que le reste du corps reste protégé.
      REMARQUE : Si le site de la lésion du SNC est plus bas sur le dos de la souris (par exemple, la colonne thoracique ou lombaire), agrandissez le trou rectangulaire.
10. Personnalisez l’extérieur du support d’animal (Figure 2B).
    1. Achetez et coupez un morceau de tube en PVC (44 mm de diamètre extérieur, 35 mm de diamètre intérieur, 6 pouces de long) pour la chambre de confinement extérieure de la souris.
    2. Construire une ouverture d’exposition (figure 2C) à l’intérieur de la chambre de confinement extérieure pour un contrôle précis du site de l’accident du SNC.
    3. Créez une ouverture inverse sur le côté opposé pour insérer le cylindre du transducteur de pression lors de l’étalonnage du système à l’étape 2 (par exemple, un trou de 9 mm).
11. Modifier l’extérieur du support de l’animal pour permettre l’administration d’une anesthésie gazeuse. Si un anesthésique injectable est utilisé à la place, sautez cette étape.
    1. Scellez une extrémité de l’extérieur du porte-animal à l’aide de ruban adhésif. Assurez-vous d’un ajustement serré pour éviter les fuites de gaz.
    2. Créez un petit trou dans le joint pour insérer la ligne d’anesthésie.
    3. Positionnez la ligne d’anesthésie de manière à introduire l’isoflurane dans l’environnement du tube sans contact direct avec l’animal.

2. Étalonnage du système

1. Connectez un transducteur de pression (Figure 2D ; voir la Table des matériaux pour les options) à un système d’acquisition de données (DAQ) et à un ordinateur pour traduire les relevés de pression physique en données numériques.
   1. Connectez le transducteur de pression au module DAQ (voir le tableau des matériaux), en assurant une polarité correcte et des connexions sécurisées.
   2. Insérez le module DAQ dans un châssis DAQ (voir Tableau des matériaux) pour lui permettre d’être alimenté et de communiquer avec l’ordinateur.
   3. Utilisez un câble USB pour connecter le châssis DAQ à l’ordinateur.
   4. Assurez-vous que l’ordinateur dispose des logiciels et des pilotes nécessaires pour l’interfaçage avec le matériel DAQ et l’acquisition de données (voir la table des matériaux pour les options).
2. Configurez les paramètres du système DAQ.
   1. Ouvrez le logiciel DAQ installé.
   2. Assurez-vous que le système DAQ est reconnu par l’ordinateur.
   3. Consultez les fiches techniques de spécification et d’étalonnage de votre module/châssis d’acquisition de données et de votre capteur de pression et configurez les paramètres du système d’acquisition de données :
      REMARQUE : Les paramètres DAQ du matériel DAQ utilisé dans ce manuscrit sont accessibles au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Entrée analogique : sélectionnez la voie d’entrée physique du module DAQ sur laquelle le capteur de pression est connecté.
      2. Source d’excitation (source Vex) : spécifiez la source d’excitation du module DAQ (par exemple, interne ou externe).
      3. Tension d’excitation (valeur Vex) : Réglez la valeur vex sur la valeur spécifiée par le fabricant du transducteur de pression (par exemple, 5 ou 10 V).
      4. Type de pont : choisissez le type de pont approprié de votre module DAQ (par exemple, pont complet, demi-pont ou quart de pont).
      5. Résistance du pont : Réglez la résistance du pont sur la valeur spécifiée par le fabricant du capteur de pression (par exemple, 350 ).
      6. Facteur d’étalonnage/mise à l’échelle personnalisée : configurez la mise à l’échelle en fonction de la fiche technique d’étalonnage fournie par le fabricant du capteur de pression. Le fabricant étalonne le transducteur de pression en appliquant une unité physique connue (psi) et en mesurant les unités électriques résultantes (mV/V). Créez une courbe d’étalonnage en comparant les unités physiques connues aux unités électriques obtenues.
      7. Taux d’échantillonnage (Hz) : réglez le taux d’échantillonnage suffisamment élevé pour capturer la dynamique des changements de pression sans repliement (par exemple, 1 ou 10 kHz selon la vitesse des changements de pression dans votre expérience).
         REMARQUE : Plus votre forme d’onde d’air de surpression est étroite (c’est-à-dire plus elle change rapidement de pression), plus la gamme de fréquences qu’elle excite est large et donc plus le taux d’échantillonnage doit être élevé. Ceci est particulièrement important dans les expériences impliquant des modèles de lésions du SNC où les changements de pression peuvent se produire rapidement.
3. Créez un outil numérique dans le logiciel DAQ pour l’acquisition de données.
   REMARQUE : Cet outil numérique sera utilisé pour mesurer, enregistrer, afficher et analyser avec précision les pressions de sortie du système. L’outil numérique utilisé dans ce manuscrit est accessible au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Mettez en œuvre des algorithmes de traitement du signal pour filtrer, amplifier ou traiter les données brutes du transducteur.
   2. Ajoutez des outils d’analyse pour calculer des mesures telles que la pression maximale, la pression moyenne et la durée des événements de pression.
   3. Incorporez des éléments visuels (par exemple, des graphiques) pour afficher les données de pression en temps réel et des éléments de contrôle pour démarrer, arrêter et réinitialiser l’acquisition de données.
   4. Enregistrez l’outil numérique.
4. Mesurer la pression de sortie du système
   1. Insérez le transducteur de pression dans l’épaisse pince de la table x-y et son canon à travers le trou du support d’animal (créé à l’étape 1.10.3).
   2. Ajustez le canon du transducteur de pression jusqu’à ce que la pointe se trouve précisément à l’endroit où se trouve le site de la blessure du SNC.
   3. Fixez le transducteur de pression à l’aide de deux vis en plastique (installées à l’étape 1.8.3).
5. Exécutez l’outil numérique dans le logiciel d’acquisition de données tout en relâchant la gâchette du pistolet de paintball pour capturer, analyser et visualiser la pression de sortie du système.
6. Ajustez la vis de réglage jusqu’à ce que la pression de sortie du système atteigne le niveau souhaité.
   REMARQUE : Après avoir modifié le canon du pistolet de paintball pour qu’il soit non fenestré, de 1,5 pouce de longueur et de 6,5 mm de diamètre, le système est capable de fournir de manière fiable des niveaux d’air de surpression dans la plage de 15 à 50 psi à 5 mm de l’avant du canon³⁴. Les niveaux d’air de surpression inférieurs à 15 psi et supérieurs à 50 psi présentent une grande variabilité d’intensité. Pour un affichage complet de la pression de sortie (psi) du système en fonction de la pression d’entrée (psi), de la distance du canon (cm) et du temps (ms), voir la figure 2 de Hines-Beard et al.34. Utilisez de l’azote comprimé au lieu de l’air comprimé pour obtenir de manière fiable des niveaux d’air de surpression supérieurs à 50 psi à l’aide de ce système.

3. Préparation des animaux et exposition à l’air en surpression

1. Anesthésie la souris avec de l’isoflurane dans une chambre d’induction avec 1,5-3%30,31,32,33 d’isoflurane dans l’oxygène jusqu’à ce qu’elle soit complètement sédative.
   1. Confirmez l’anesthésie en évaluant l’absence de réponse à un pincement de l’orteil.
   2. Fixez la souris dans le support intérieur de l’animal avec sa tête et ses épaules postérieures supérieures exposées à travers l’ouverture rectangulaire, tandis que le dos et les membres postérieurs inférieurs restent protégés.
   3. Soutenez la tête de la souris à l’aide d’un coussin fixé à la partie inférieure intacte du support intérieur de l’animal.
   4. Fixez la souris en appliquant du ruban chirurgical sur le haut des épaules arrière.
   5. Insérez le support intérieur pour animaux dans le support extérieur pour animaux.
   6. Ouvrez la ligne d’anesthésie secondaire pour administrer l’isoflurane à l’intérieur du support pour animaux.
   7. Placez un coussin supplémentaire à l’extrémité du support pour animaux afin d’éviter que l’anesthésique ne s’échappe du tube et que la souris ne bouge lors d’une exposition à l’air sous pression.
2. Débit d’air de surpression
   1. Alignez l’ouverture circulaire de 4 mm du support extérieur de l’animal directement sur l’œil gauche de la souris.
   2. Positionnez le porte-animal à l’aide des boutons de commande sur la table x-y de manière à ce que son ouverture s’aligne avec le canon du pistolet de paintball et que la surface externe soit à 5 mm de l’extrémité du canon.
      REMARQUE : Ajustez la distance de l’animal par rapport à l’extrémité du canon pour changer le niveau d’air de surpression (psi) et la forme. Éloignez l’animal du canon pour abaisser le niveau d’air de surpression et créer une onde d’air de surpression plus diffuse.
   3. Initier la séquence d’air de surpression pour induire ITON :
      1. Délivrer deux rafales d’air de surpression de 15 psi à un intervalle de 0,5 s, répétées quotidiennement pendant 3 jours 29,30,31,32.
         REMARQUE : Une ITON similaire peut être induite par la distribution de trois rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s²³. Le degré d’ITON qui résulte de l’administration de six rafales consécutives d’air de surpression de 15 psi séparées par des intervalles de 0,5 s est indiqué ici dans les résultats représentatifs.
      2. Exposez les souris factices au bruit de l’air de surpression, mais pas à l’air de surpression lui-même en tournant le support de l’animal de manière à ce que l’ouverture ne soit plus face au canon et bloquez l’air avec un bouclier en carton.
3. Récupération de la souris
   1. Laissez les souris se remettre de l’anesthésie.
      1. Administrez des gouttes ophtalmiques lubrifiantes (voir le tableau des matériaux) pour éviter que les yeux ne se dessèchent à cause de l’anesthésie.
      2. Fournir de la chaleur à l’aide d’un support de chauffage contrôlé (voir tableau des matériaux).
   2. Surveillez visuellement les souris jusqu’à ce qu’elles maintiennent une posture droite et marchent normalement. Permettez-leur d’être en compagnie de leurs compagnons de cage.
   3. Fournissez à toutes les souris exposées à de l’air en surpression de la nourriture de récupération de gel (voir le tableau des matériaux) pendant les 3 premiers jours suivant la blessure pour prévenir la perte de poids.

4. Collecte et traitement des tissus

1. Euthanasier les souris par injection intrapéritonéale de la solution de travail Avertin.
   1. Préparez le stock Avertin en mélangeant 10 g de 2,2,2,-tribromoéthanol (voir le tableau des matériaux) avec 10 ml de 1-pentanol (voir le tableau des matériaux). Conserver dans l’obscurité à 4 °C.
   2. Préparez la solution de travail Avertin en combinant 1,25 ml de bouillon Avertin, 45 ml d’eau distillée double et 5 ml de 10x PBS (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 50 ml. Filtrez, stérilisez le mélange et conservez-le dans l’obscurité à 4 °C.
2. Perfuser les souris par voie transcardique avec 4% de paraformaldéhyde (voir le tableau des matériaux) dans 1x PBS (voir le tableau des matériaux).
3. Énucléer l’œil exposé à l’air en surpression à l’aide de pinces fines (voir Tableau des matériaux) et de ciseaux (voir Tableau des matériaux), en veillant à préserver le nerf optique (ON).
4. Prélever l’ON ainsi que le tissu oculaire énucléé pour une analyse plus approfondie.
5. Osmicate ON tissu.
   1. Postfix ON tissu pendant la nuit dans 4 % de paraformaldéhyde et 2 % de glutaraldéhyde (voir tableau des matériaux) dans 1x PBS. Si vous travaillez avec un tissu qui n’a pas été perfusé (comme à l’étape 4.2), postfixez pendant 5 jours au lieu de toute la nuit.
   2. Transférez le tissu ON sur une plaque de 12 ou 24 puits (voir le tableau des matériaux) avec 1x PBS à l’aide d’un pinceau (voir le tableau des matériaux) ou d’un bâton en bois pointu.
   3. Dans une hotte, remplacez le 1xPBS par du tétroxyde d’osmium à 2 % (voir la table des matériaux) dans un tampon cacodylate de 0,2 M (la recette est accessible au public sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) à l’aide d’une pipette de transfert. Incuber sur glace pendant 2 h.
   4. Effectuez trois lavages avec 1x PBS
      1. Éliminer les déchets d’osmium de manière appropriée.
      2. Laissez la plaque dans la hotte pendant deux nuits après le troisième lavage PBS.
6. Déshydrater les tissus ON dans une série d’éthanol gradué.
   1. Transférez les nerfs dans une nouvelle plaque avec 50% d’éthanol et incubez pendant 30 min.
   2. Remplacer par de l’éthanol à 70 % pendant 30 min.
   3. Remplacer par de l’éthanol à 95 % pendant 30 min.
   4. Remplacer par de l’éthanol à 100 % pendant 30 min.
7. Intégrez le tissu ON dans epon.
   REMARQUE : La recette Epon est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON ; voir la table des matériaux pour les matériaux énumérés dans la recette.
   1. Jour 1 : Transférer le tissu dans un flacon de 2 ml avec de l’oxyde de propylène (voir le tableau des matériaux)/de l’éthanol à 100 % (1:1) et agiter pendant 30 minutes à température ambiante. Remplacez par de l’oxyde de propylène pur et agitez pendant 15 min, en répétant une fois. Remplacer par de l’oxyde de propylène/épon (1:1) et agiter toute la nuit dans la chambre froide.
   2. Jour 2 : Transférer le mouchoir dans une plaque à 12 ou 24 puits avec 100 % d’épon et agiter pendant 4 h à température ambiante. Remplacer par de l’épon frais à 100 % et incuber toute la nuit à température ambiante sous vide.
   3. Jour 3 : Répétez l’incubation de l’épon comme au jour 2.
   4. Jour 4 : Transférez le tissu dans un moule plat avec 100% d’epon, réorientez le tissu et placez-le dans un four à 60 °C pendant 48 h.
8. Section ON tissu.
   1. Trim se moule sous une lunette de dissection en une double pyramide avec le nerf au centre.
   2. Prélever des sections transversales de 700 nm d’épaisseur à l’aide d’un ultramicrotome et d’un couteau diamanté (voir le tableau des matériaux).
   3. Prélever des sections sur des lames de microscope en verre blanc chargé à l’aide d’eau distillée.
   4. Sécher les lames dans un four à 60 °C jusqu’à ce que l’eau s’évapore. Refroidir à température ambiante.
9. Tache sur le tissu.
   1. Immerger les lames dans de la paraphénylènediamine à 1 % (PPD) (voir le tableau des matériaux) dans un mélange 1:1 de méthanol et de 2-propanol pendant 28 min.
   2. Rincer les lames en deux mélanges consécutifs de méthanol 1:1 (voir le tableau des matériaux) et de 2-propanol (voir le tableau des matériaux) pendant 1 min chacun.
   3. Rincez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant 1 min et laissez sécher à l’air.
   4. Placez les lames dans une boîte humide et recouvrez les sections de bleu de toluidine à 1 % (voir le tableau des matériaux) à l’aide d’une pipette de transfert.
   5. Incuber dans un four à 60 °C pendant 20 min.
   6. Rincez les lames avec de l’eau distillée deux fois et laissez sécher à l’air.
10. Montez et imagez sur du tissu.
    1. La lamelle couvre-objet glisse à l’aide d’un support de montage (voir le tableau des méthodes), en enlevant l’excédent de support.
    2. Laissez les lames sécher pendant la nuit.
    3. Imagez des coupes transversales à l’aide de la microscopie à champ clair avec un objectif à immersion dans l’huile 100x.
11. Intégrer, sectionner et colorer immunohistochimiquement le tissu rétinien.
    1. Postfixer le tissu oculaire entier dans 4% de paraformaldéhyde pendant 2 à 4 h.
    2. Cryoprotégez l’ensemble du tissu oculaire avec 30% de saccharose (voir tableau des matériaux en 1x PBS pendant la nuit à 4 °C.
    3. Incorporez le tissu oculaire dans un produit de congélation (voir le tableau des matériaux).
    4. Prélever des coupes efficaces de rétine de 10 μm d’épaisseur sur un cryostat et monter les coupes sur des lames de microscope en verre blanc chargé (voir Tableau des matériaux).
    5. Laver les lames dans 1x PBS et incuber dans un tampon bloquant (5% de Triton X-100 et 2% d’albumine sérique bovine (BSA) (voir la table des matériaux) dans 1x PBS) avec 5% de sérum d’âne normal (NDS) (voir la table des matériaux) à température ambiante pendant 30 min.
    6. Incuber les lames pendant la nuit à 4 °C (ou à température ambiante pendant 4 h) dans l’anticorps primaire (voir le tableau des matériaux) dans du Triton X-100 à 0,5 % (voir le tableau des matériaux) dans du 1xPBS (PBT).
    7. Laver les lames dans du PBT et les incuber dans des anticorps secondaires (voir le tableau des matériaux) dans un tampon de blocage avec 5% de NDS.
    8. Lavez les lames en PBT, appliquez le support de montage avec du DAPI (voir le tableau des matériaux), une lamelle et scellez-le avec du vernis à ongles.
    9. Diapositives d’images sur un microscope à épifluorescence.
    10. Si vous quantifiez l’intensité de la fluorescence, assurez-vous que les images sont prises à partir de la même région rétinienne avec des paramètres de grossissement, de gain et d’exposition identiques.
12. Comptez SUR les axones.
    1. Comptez manuellement le nombre d’axones à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images (voir la Table des matériaux) en prélevant 20 % de la section transversale totale du nerf à l’aide d’une superposition de grille fixe pour estimer la densité axonale (axones/mm²).
    2. Mesurez l’aire de la section ON.
       1. Utilisez la fonction Définir l’échelle pour définir les pixels/microns de l’objectif utilisé pour l’image.
       2. Utilisez l’outil de sélection de polygone pour tracer le long de la gaine de myéline du nerf optique, à l’exclusion du système vasculaire.
       3. Mesurez la surface de l’ON à l’aide de la fonction Mesurer .
       4. Déterminez 20 % de l’aire totale en multipliant l’aire mesurée par 0,2.
    3. Superposez la grille fixe sur la section ON.
       1. Téléchargez le plug-in Counting Array.
          REMARQUE : Ce plug-in est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Ouvrez le plug-in Tableau de comptage pour superposer une grille fixe au sommet de la section transversale, composée de 9 carrés régulièrement espacés en forme de signe plus.
       3. Modifiez l’aire de chacune des 9 régions en divisant 20 % de l’aire totale de la section efficace de l’Ontario (calculée à l’étape 4.6.2.4) par 9.
       4. Centrez la grille fixe de sorte que le centre du signe plus soit centré au milieu de la section ON.
    4. Comptez séparément les axones vivants et les axones en dégénérescence.
       1. Téléchargez et ouvrez le plug-in Cell Counter.
          REMARQUE : Ce plug-in est disponible publiquement sur GitHub. Les lecteurs intéressés peuvent accéder au dépôt à l’adresse https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Pour chacune des 9 régions, comptez le nombre de profils axonaux vivants et en dégénérescence séparément en visualisant l’état de la gaine de myéline. Assurez-vous que la quantification axonale est effectuée en aveugle au groupe expérimental de l’animal pour éviter les biais.
       3. Pour les axones vivants, recherchez ceux dans lesquels la gaine de myéline apparaît intacte, uniformément colorée et doucement et uniformément encerclée autour de l’axone.
       4. Pour les axones en dégénérescence, recherchez ceux avec un épaississement, un oignon ou un effondrement de la gaine de myéline.
       5. Si l’axone est partiellement coupé par la grille superposée, ne l’incluez dans le décompte des axones que si la lumière est visible.
       6. Assurez-vous que les axones oblongs ne sont pas comptés accidentellement plus d’une fois et ne confondez pas les débris ou la poussière avec un profil axonal en dégénérescence.
    5. Effectuer des analyses statistiques pour vérifier les différences significatives dans le nombre moyen d’axones entre les groupes. S’assurer qu’au moins quatre ON sont inclus dans chaque groupe pour tenir compte de la variabilité normale observée dans les analyses précédentes.
       1. Effectuez un test t sur échantillons indépendants (également connu sous le nom de test t de Student pour les échantillons indépendants) pour évaluer les différences significatives entre les moyennes de deux groupes indépendants.
       2. Effectuer l’alternative non paramétrique, le test U de Mann-Whitney, si les conditions d’un test t d’échantillons indépendants ne peuvent pas être remplies (c’est-à-dire si les données ne sont pas normalement distribuées ou si la taille des échantillons est trop petite).

Discussion

Ce système d’air de surpression personnalisé est un outil utile pour étudier les lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Les résultats représentatifs de l’expérience d’exemple démontrent que l’administration focale d’air de surpression à l’aide de ce système peut induire efficacement ITON, entraînant une perte et une dégénérescence axonales importantes. Cela met en évidence la capacité du système à produire des lésions précises et reproductibles du SNC.

L’une des principales forces de ce système est sa personnalisation pour induire une gamme de lésions du SNC. La gravité de la blessure peut être ajustée en modifiant la pression de sortie globale du système, la distance entre l’animal et l’extrémité du canon à l’aide de la platine de positionnement x-y, la taille et la forme de l’ouverture d’exposition, le nombre d’expositions à l’air en surpression et l’intervalle entre les expositions. De plus, l’emplacement de la lésion du SNC peut être ajusté en modifiant l’emplacement de l’ouverture d’exposition à l’intérieur du support d’animal. Cette polyvalence a permis au système de produire un éventail de lésions du SNC en système fermé dans des modèles murins. Initialement, le système a été utilisé pour modéliser les lésions à globe fermé, en se concentrant sur les lésions aux pôles antérieur et postérieur et les déficits associés^34,36, y compris les impacts de la réponse du système immunitaire³⁷, les résultats spécifiques à la souche³⁸ et l’efficacité des agents neuroprotecteurs³⁹. Finalement, cette application s’est étendue pour évaluer les séquelles des expositions oculaires répétées afin de modéliser la neuropathie optique traumatique indirecte (ITON)³⁰ et d’explorer l’effet du nombre et de l’intervalle entre les expositions répétées³³. Depuis lors, l’application du système s’est étendue au modèle des lésions cérébrales traumatiques légères (TCL) fermées par le biais d’expositions dirigées vers la tête^40,41 et des lésions de la moelle épinière à corps fermé (LME) par des expositions dirigées vers le dos⁴², mettant l’accent sur l’adaptabilité et la polyvalence de l’appareil dans l’étude de divers domaines de lésions du SNC.

Lors de l’utilisation de ce système, il est essentiel de prendre des mesures pour minimiser la variabilité des résultats des blessures afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité des résultats expérimentaux. Les mesures clés comprennent l’étalonnage des niveaux de pression de sortie du système avant et après chaque série de trois expositions afin d’assurer une distribution constante de la pression. Bien que la variabilité soit faible lorsque le système fonctionne entre 15 psi et 50 psi lorsqu’il utilise de l’air comprimé³⁴, un étalonnage cohérent permet de détecter les erreurs inattendues, telles que la batterie faible ou l’air faible. De plus, positionnez chaque animal à la même distance de l’extrémité du canon pour assurer une amplitude de surpression constante, car l’intensité de l’onde de pression diminue avec la distance. Un positionnement uniforme garantit également que chaque animal est touché par la même partie de l’onde. De plus, le fait de fixer uniformément les animaux à l’intérieur du support garantit que les tissus d’intérêt sont ciblés de manière cohérente, en particulier dans les modèles à exposition répétée lorsqu’il y a un risque de mouvement. Enfin, l’uniformité de l’âge, du sexe et du patrimoine génétique des animaux est cruciale, car ces facteurs influencent la réponse aux blessures. Par exemple, des études antérieures utilisant ce système ont comparé les effets de l’air de surpression oculaire sur différentes souches de souris, mettant en évidence des différences significatives dans la réponse aux lésions entre les souris C57Bl/6J³⁶, DBA/2J³⁷ et Balb/c³⁸ . Les souris DBA/2J et Balb/c ont présenté des pathologies du pôle antérieur plus graves, des lésions rétiniennes plus importantes, un stress oxydatif plus élevé et des réponses neuro-inflammatoires plus prononcées par rapport aux souris C57Bl/6J, les souris Balb/c présentant des profils de lésions particulièrement robustes et durables³⁸.

Dépannage du système
Si les valeurs de pression sont inhabituellement basses pour un réglage donné du manomètre, appuyez sur la gâchette 5 à 10 fois, permettant à l’air de passer à travers le système et au régulateur de s’ajuster à un nouveau réglage. Il ne doit pas y avoir de fuites dans le réservoir d’air. Le joint torique du réservoir d’air ne doit pas être endommagé ou usé, le réservoir d’air doit avoir suffisamment d’air et la batterie du pistolet ne doit pas être épuisée. La table x-y ne doit pas s’être déplacée de sa position habituelle à partir de l’extrémité du canon et l’ouverture d’exposition à l’air de surpression doit être alignée avec le canon du pistolet et ne pas l’obstruer. Le régulateur doit être solidement fixé à la poignée du pistolet. Si les valeurs de pression sont trop basses malgré l’utilisation du réglage le plus élevé sur le manomètre, le manomètre ne doit pas être augmenté au-delà de 200 psi et le réglage de vitesse sur le pistolet doit être ajusté au réglage maximum. Si les réglages de pression sont incohérents (par exemple, élevée puis basse), assurez-vous que le réservoir d’air a suffisamment d’air, que le détendeur est bien fixé à la poignée du pistolet, qu’il n’y a pas de fuites dans le réservoir d’air et qu’il est bien vissé, et que le joint torique du réservoir d’air n’est pas endommagé ou usé.

Pour comprendre de manière exhaustive toutes les capacités de ce système, il est important de reconnaître ses limites. Imiter des scénarios du monde réel dans un laboratoire reste un défi. Bien que ce système génère de l’air de surpression, il ne reproduit pas la dynamique complexe d’un événement explosif, comme les variations de gradients de pression et de température, la présence de débris et d’ondes réfléchies, et une nature multiphasique. De plus, il n’imite pas une forme d’onde de Friedlander (« onde de choc primaire »), qui se caractérise par un pic de pression brutal et quasi instantané suivi d’une décroissance exponentielle rapide qui descend en dessous de la pression ambiante avant de revenir à la ligne de base⁴³. Au contraire, la forme d’onde produite par ce système représente un profil plus simple et plus symétrique dans lequel il y a une montée et une descente plus progressives de la pression sans phase négative distincte (voir la figure 2C dans Hines-Beard et ^al.34). De manière quelque peu avantageuse, cette forme d’onde combine des éléments de blessures dues à l’explosion et aux blessures contondantes. L'« impulsion de pression » en forme de cloche produit un impact de surpression constant, semblable à un « mur d’air » frappant le sujet. Pourtant, la surpression d’air fournie par l’onde est également un aspect clé des blessures causées par les explosions. Certains diront que si cette forme d’onde comprend des aspects des deux types de blessures, elle ne rend pas pleinement compte de la complexité de l’un ou l’autre. Cependant, cette « impulsion de pression » cohérente et reproductible est idéale pour les expériences contrôlées en laboratoire afin d’étudier les lésions focales du SNC en système fermé. Nous avons déjà démontré la nature focale de la blessure. Par exemple, l’exposition à un œil ne cause pas de dommages à l’épithélium nasal primaire ou au cerveau⁴⁴. De plus, lorsqu’il est dirigé sur le côté de la tête de la souris, une petite zone du cerveau est affectée⁴⁵. Enfin, l’énergie de l’air de surpression de ce système au niveau de pression utilisé pour ITON n’a pas affecté la souris à moins d’être répétée avec un court intervalle de temps³³. Ainsi, la pression n’est pas nuisible et ne reproduit donc pas une force d’extrémité de jet. De plus, même avec une exposition répétée de l’air sous surpression à l’œil, il n’y avait aucun effet sur les structures antérieures de l’œil³³. Une dégénérescence significative du nerf optique et une perte de vision ne se sont produites qu’en cas d’exposition répétée avec un intervalle d’exposition inférieur à 1 min^33.

Comparé à d’autres appareils de laboratoire pour la création de lésions du SNC en système fermé, ce système offre des avantages uniques. Il peut fournir des rafales séquentielles d’air de surpression en succession rapide (intervalles de 0,5 s)³³, imitant les conditions dans les environnements professionnels à haut risque où les expositions rapides aux explosions sont un danger courant. Par exemple, le personnel militaire, tant dans les scénarios d’entraînement que de combat, utilise une foule d’armes à feu automatiques capables de tirer rapidement et à plusieurs reprises, y compris des fusils automatiques (par exemple, M16, AK-47), des mitrailleuses (par exemple, M2 de calibre .50), des mitrailleuses Gatling et des miniguns. D’autres armes plus lentes, mais répétitives, utilisées par le personnel militaire comprennent l’artillerie, les mortiers, les grenades et les engins explosifs improvisés (EEI). Les démolisseurs impliqués dans la démolition contrôlée et les mineurs impliqués dans les opérations de dynamitage pour briser la roche et extraire des minéraux subissent également des explosions séquentielles en succession rapide. Enfin, les travailleurs de la construction utilisant des outils pneumatiques, des batteurs de pieux ou d’autres équipements lourds générant de puissantes forces de percussion peuvent subir des impacts rapides et répétés qui imitent les expositions aux explosions. Notamment, l’administration rapide d’air de surpression n’est pas possible avec des dispositifs tels que les tubes de choc qui nécessitent une reconfiguration ou une repressurisation importante entre chaque événement. Les tubes de choc utilisent des diaphragmes qui éclatent pour générer des ondes de choc, et après chaque rafale, le diaphragme doit être remplacé. Ce processus prend du temps, car le tube de choc doit être ouvert, le diaphragme usé retiré, un nouveau diaphragme installé et le système doit laisser le temps de se réinitialiser et de repressuriser. Ainsi, en particulier pour les études portant sur les lésions du SNC après une exposition rapide et répétée à l’explosion, un système qui ne nécessite pas de reconfiguration ou de repressurisation importante entre chaque événement est idéal.

Les applications futures de ce système modulatoire, convivial et rentable sont prometteuses. Tirant parti de ses attributs adaptables et uniques, ce système ouvre plusieurs pistes prometteuses pour de futures études thérapeutiques précliniques. Sa capacité à fournir des rafales rapides et séquentielles d’air en surpression peut être exploitée pour étudier les effets cumulatifs d’expositions répétées à des explosions, ce qui est pertinent pour comprendre l’encéphalopathie traumatique chronique et d’autres maladies neurodégénératives à long terme. De plus, ce système peut être utilisé pour explorer l’efficacité de diverses interventions pharmacologiques visant à atténuer les lésions du SNC en système fermé, y compris le moment et le dosage des médicaments neuroprotecteurs pour déterminer les fenêtres de traitement optimales. De plus, la précision du système dans l’imitation des aspects des mécanismes de blessures contondantes et explosives permet de développer des modèles de blessures complets qui reflètent les traumatismes complexes vécus par les individus dans des scénarios réels. Cela peut faciliter la mise à l’essai de thérapies multimodales qui s’attaquent aux aspects mondiaux courants des blessures, tels que l’inflammation, le stress oxydatif et la mort neuronale. Dans l’ensemble, ce dispositif offre une plate-forme polyvalente et puissante pour faire progresser notre compréhension des lésions du SNC en système fermé et développer des interventions thérapeutiques efficaces.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software