Odak, Kapalı Sistem Merkezi Sinir Sistemi Yaralanması Sistemi

Özet

Bu protokol, farelerde oküler, beyin ve omurilik travmaları dahil olmak üzere kapalı sistem merkezi sinir sistemi (CNS) yaralanmalarını indüklemek için tasarlanmış özel bir aşırı basınçlı hava sistemini açıklar. Bu protokolün amacı, araştırmacıların benzersiz CNS travma çalışmaları için sistemi kolayca uyarlamaları ve genişletmeleri için bir çerçeve sağlamaktır.

Özet

Kapalı sistem merkezi sinir sistemi (MSS) yaralanmalarının yaygınlığı, koruyucu ve terapötik müdahaleleri iyileştirmek için bu travmaların daha iyi anlaşılmasına duyulan ihtiyacın altını çizmektedir. Bu araştırma için çok önemli olan, kapalı sistem CNS yaralanmalarını kopyalayan hayvan modelleridir. Bu bağlamda, murin modellerinde oküler, beyin ve omurilik travması dahil olmak üzere bir dizi kapalı sistem CNS yaralanmasını yeniden üretmek için özel bir aşırı basınçlı hava sistemi tasarlandı. Bugüne kadar sistem, gözdeki ön-arka kutup yaralanması, dolaylı travmatik optik nöropati (ITON), fokal travmatik beyin hasarı ve omurilik yaralanmasını modellemek için göz, baş veya omurgaya yönelik aşırı basınçlı hava uygulamak için kullanılmıştır. Bu makale, sistemin tasarımını ve işleyişini özetleyen ayrıntılı bir protokol sağlar ve etkinliğini gösteren temsili sonuçları paylaşır. Burada sunulan sağlam çerçeve, CNS travmasında devam eden araştırmalar için güçlü bir temel sağlar. Araştırmacılar, sistemin esnek özelliklerinden yararlanarak yaralanmaların yerini, ciddiyetini ve zamanlamasını değiştirebilir ve dikkatli bir şekilde kontrol edebilir. Bu, çoklu kapalı sistem CNS yaralanmalarında moleküler mekanizmaların ve terapötik etkinliğin kapsamlı bir şekilde karşılaştırılmasına izin verir.

Giriş

Kapalı sistem merkezi sinir sistemi (SSS) yaralanmaları, kafatasında veya omurgada bir kırılmaya neden olmadan beyin veya omuriliğin hasar görmesi sonucu oluşan yaralanmalardır. Bu yaralanmalar travmatik beyin hasarı (TBI) ve omurilik yaralanmasını (SCI) içerir ve künt kuvvet yaralanmaları (örneğin düşmeler, spor yaralanmaları, motorlu taşıt kazaları) ve patlayıcı patlamalar dahil olmak üzere çeşitli olaylardan kaynaklanabilir. Kapalı sistem CNS yaralanmaları genellikle penetran CNS yaralanmalarına kıyasla daha az şiddetli olarak kabul edilir, ancak daha sık görülürler. Bununla birlikte, penetran yaralanmalara benzer şekilde, kapalı sistem CNS yaralanmaları, özellikle tekrarlanan olaylardan sonra uzun vadeli ve ilerleyici sağlık sorunlarına neden olabilir 1,2,3,4,5,6. Endişe verici bir şekilde, ortaya çıkan kanıtlar, tek bir olaydan^{sonra TBI} veya SCI için tanı kriterlerinin altına düşen subklinik kapalı sistem CNS yaralanmalarının bile 7,8,9,10,11,12,13, tekrarlanan yaralanmalardan sonra kronik nörodejeneratif hastalıklara dönüşebileceğini düşündürmektedir ^6,14,15,16. Bu, tek ve tekrarlanan kapalı sistem CNS yaralanmalarının mekanizmalarının ve sonuçlarının daha iyi anlaşılmasına yönelik acil ihtiyacın altını çizmektedir.  Bu tür bilgiler, gelişmiş koruyucu ve terapötik yaklaşımlar için zorunludur. Bu çaba için çok önemli olan, kapalı sistem CNS yaralanmalarını taklit eden hayvan modelleridir.

Kapalı sistem CNS yaralanmalarının mevcut hayvan modelleri, bu travmalar için patofizyoloji ve potansiyel koruyucu ve terapötik müdahaleler hakkındaki anlayışımızı geliştirmede etkili olmuştur. Kemirgenler, düşük maliyetleri, bulunabilirlikleri, genetik manipüle edilebilirlikleri, kullanım kolaylıkları, iyi bilinen davranışsal ve fizyolojik tahlilleri ve daha olumlu etik düşünceleri nedeniyle özellikle popülerdir¹⁷. Kemirgenlerde kapalı sistem TBH'yi indüklemek için yaygın yöntemler arasında ağırlık düşürme cihazları^18,19, kontrollü kortikal etki (CCI) cihazları²⁰ ve basınçlı hava tahrikli şok tüpleri²¹ bulunur. SCI için, künt travma modelleri tipik olarak omuriliğe veya epidural boşluğa doğrudan erişmek için laminektomi^22,23 veya diğer cerrahi teknikler²⁴ gerektirir. Bununla birlikte, basınçlı hava tahrikli şok tüpleri ²⁵ kullanılarak kapalı gövdeli SCI patlama yaralanması modelleri geliştirilmiştir. Değerli bilgiler sağlamasına rağmen, bu modellerin her birinin benzersiz sınırlamaları vardır. Ağırlık düşürme modelleri, yüksek değişkenliğe ve yaralanma yeri ve şiddeti konusunda sınırlı kontrole sahip olabilir, bu da ciddi, kontrolsüz yaralanmaya neden olmak için deneysel ve etik kaygılar üretir²⁶. CCI cihazları hassasiyet sunar, ancak çalışması için eğitim gerektirir, kraniyotomi içerebilir ve tekrarlanabilirliği etkileyen mekanik değişkenlikten muzdarip olabilir²⁷. Şok tüpleri genellikle daha az invazivdir, ancak elde edilmesi zor olabilir, kurulumu ve çalıştırılması karmaşık olabilir ve çevresel faktörler, dalga yansımaları ve karmaşık basınç etkileşimleri nedeniyle gerçekçi olmayan ve oldukça değişken yaralanma koşulları yaratabilir²⁸.

Tek ve tekrarlayan kapalı sistem CNS yaralanmalarının ve tedavilerinin mekanizmalarını ve etkilerini daha iyi incelemek için bu makale modüler, kullanıcı dostu, uygun maliyetli ve non-invaziv bir yöntem sunmaktadır. Bu yaklaşımın birincil amacı, konum, ciddiyet ve zamanlama dahil olmak üzere yaralanma parametrelerinin hassas kontrolünü ve esnek bir şekilde değiştirilmesini sağlamaktır. Bu amacı desteklemek için, bu el yazması, mevcut kapalı sistem CNS yaralanma cihazlarının bazı sınırlamalarını ele alan bir aşırı basınçlı hava sistemi oluşturmak, kalibre etmek ve sorun gidermek için ayrıntılı bir protokol sağlar. Bu sistem yalnızca maliyet etkinliği ve minimum kurulum süresi sunmakla kalmaz, aynı zamanda etik kaygıları en aza indirirken ve klinik alaka düzeyini en üst düzeye çıkarırken tutarlı ve tekrarlanabilir sonuçlar sağlayarak çok yönlüdür. Ek olarak, sistemin fare modellerinde bir dizi kapalı sistem CNS yaralanması üretme kabiliyeti, gelecekteki çalışmalardaki potansiyel uygulamaları ile birlikte açıklanmaktadır. Özellikle, bu el yazmasının amacı, araştırmacıların bu sistemi kendi özel ihtiyaçları için kolayca edinmelerini, uyarlamalarını ve genişletmelerini sağlayan bir çerçeve sağlamak ve böylece CNS travmasında devam eden araştırmaları ilerletmektir. Sistemin aksonal travmayı indüklemedeki etkinliğini gösteren temsili sonuçlar da sunulmaktadır.

Protokol

Tüm prosedürler, Vanderbilt Üniversitesi'nin ^29,30,31,32 Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanan protokoller ve Laboratuvar Hayvanları Bakımını Değerlendirme ve Akreditasyon Derneği (AAALAC) ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği'nin (ARVO) yönergeleri altında gerçekleştirildi. Tüm fareler grup halinde barındırıldı ve 12 saatlik bir aydınlık / karanlık döngüsünde tutuldu ve yiyecek ve su ad libitum sağlandı. Bu protokolde üç aylık^30,31,33 C57 Bl/6 fareler kullanıldı.

1. Sistem yapımı

1. Entegre bir hava basıncı regülatörüne sahip, piyasada bulunan bir paintball tabancası edinin (Malzeme Tablosuna bakın).
2. Gerekirse namluyu değiştirin (Şekil 1A).
   1. Orijinal namlu, uzunluğu boyunca açıklıklar veya delikler ile fenestre edilirse, basınçlı hava sızabilir ve havaya dağılabilir, bu da maksimum çıkış basıncı seviyesini düşürür. Çıkış basınç aralığını artırmak için katı, fenestre olmayan bir namlu satın alarak değiştirin (Şekil 1, I).
   2. Orijinal namlu uzun ve hantalsa, özel uzunlukta daha kısa bir namlu satın alarak veya bir boru kesici veya testere kullanarak kısaltın.
   3. Orijinal namlu istenen çıkış basıncı seviyesini üretmiyorsa, özel bir delik çapına sahip bir namlu satın alarak namlunun iç çapını (delik boyutu) değiştirin. Orijinal delik boyutunun çapının küçültülmesi, çıkış basıncı aralığını artıracaktır ve bunun tersi de geçerlidir.
3. Gerekirse regülatörü değiştirin (Şekil 1B).
   1. Orijinal regülatör bir kılavuz kapakla birlikte geliyorsa, ayar vidasına (Şekil 1, II) doğrudan erişim sağlamak için kılavuz kapağı çıkarın.
   2. Orijinal ayar vidası bir Alyan başlı soketle birlikte geliyorsa, Alyan başlı soket vidasını düz başlı bir soket vidasıyla değiştirin.
4. Standart yerçekimi beslemeli yükleyiciyi (yani, boya toplarını tabancaya tutmak ve beslemek için kullanılan rezervuarı) çıkarın ve basınç sızıntısını önlemek için dikey besleme borusunu (Şekil 1, III) kapatın.
   1. Yerçekimi beslemeli yükleyiciyi çıkarmadan önce paintball tabancasının boşaltıldığından ve hava kaynağının (CO₂ veya basınçlı hava tankı) bağlantısının kesildiğinden emin olun.
   2. Yerçekimi beslemeli yükleyicinin takılı olduğu besleme boynunu (Şekil 1C) bulun. Uygun aleti kullanarak besleme boynu kelepçesini gevşetin.
   3. Standart yerçekimi beslemeli yükleyiciyi yukarı doğru çekerek çıkarın.
   4. Açıklığı kapatmak için bir besleme boynu kapağı veya tapa takın. Bunlar genellikle paintball mağazalarında veya çevrimiçi olarak bulunur ve besleme boynuna sıkıca oturacak ve onu sızdırmaz hale getirecek şekilde tasarlanmıştır.
5. Paintball silahı için bir platform (Şekil 1D) ve bir x-y hayvan konumlandırma masası monte edin.
   1. İki parça orta yoğunluklu sunta keserek platform tabanını oluşturun.
      NOT: Malzeme mevcudiyetine ve tercihine bağlı olarak, alternatif malzemeler (örn. kontrplak) da kullanılabilir.
   2. 1,5 x 1,5 ft ölçmek için daha küçük, kare bir parça kesin.
   3. 2.5 x 1.5 ft ölçmek için daha büyük bir dikdörtgen parça kesin.
   4. İki paralel 2 x 4 s kullanarak daha küçük platformu daha büyük platformun 3,5 inç üzerine yükseltin ve sabitleyin.
6. Modifiye edilmiş paintball tabancasını platforma sabitleyin.
   1. Paintball silahını, namlunun ucu kenardan yarım inç uzanacak şekilde daha küçük platformun üzerine yan yatırın.
   2. Paintball tabancasını montaj braketleri veya cl kullanarak sabitleyinamp paintball tabancasının namlusuna ve dipçiğine uyan parçalar.
   3. Paintball tabancasının regülatörüne basınçlı bir hava tankı (Şekil 1E; Malzeme Tablosuna bakın) takın. Alternatif olarak, güvenilir çıkış basıncı seviyeleri aralığını artırmak için sıkıştırılmış bir nitrojen tankından doğrudan bir basınç hattı bağlayın.
   4. Basınçlı hava tankı kullanıyorsanız, dayanıklı bir kumaş kayışla sunta üzerine sabitleyin. Kayışı vida veya cıvatalarla takın ve kolay sıkma ve gevşetme için bir ayar mekanizması ekleyin.
7. Vida veya cıvata kullanarak paintball silahının namlusunun karşısındaki daha büyük dikdörtgen sunta parçasına bir xy konumlandırma tablası sabitleyin (Şekil 1F).
   NOT: xy aşaması olarak da bilinen bir xy konumlandırma tablosu ( Malzeme Tablosuna bakın), çevrimiçi perakendeciler, endüstriyel tedarikçiler ve bilimsel ekipman tedarikçileri dahil olmak üzere çeşitli tedarikçilerden satın alınabilir. Bir xy konumlandırma tablası satın alırken, hareket aralığını, yük kapasitesini, hassasiyeti ve manuel ayar veya motorlu kontrol arasındaki seçimi göz önünde bulundurun. Bu xy konumlandırma tablosu, hayvanın iki eksen boyunca hassas bir şekilde hareket etmesine ve konumlandırılmasına izin verecektir: x ekseni (namluya yatay olarak doğru veya uzağa) ve y ekseni (namludan dikey olarak yukarı veya aşağı).
8. Üç PVC kelepçe takarak xy konumlandırma tablosunu değiştirin.
   1. İki adet 1 cm kalınlığında PVC cl'yi sabitleyinamps vida veya cıvata kullanarak namlunun ön tarafının her iki tarafına. cl'den emin olunamps Adım 1.9 ve 1.10'daki hayvan tutucuyu barındıracak kadar geniş (örn. 1.5 inç).
   2. Vida veya cıvata kullanarak daha kalın (4 cm) bir PVC kelepçeyi 1 cm kalınlığındaki iki kelepçeye dik ve zıt olarak sabitleyin. cl'den emin olunamp Adım 2.4'ten itibaren basınç dönüştürücüsünü barındıracak kadar geniş (örn. 1.5 inç).
   3. Üçüncü kelepçenin üst kısmına iki delik açın ve Adım 2'deki sistem kalibrasyonu sırasında basınç dönüştürücünün ek stabilizasyonu için iki plastik vida takın.
9. Hayvan tutucunun içini özelleştirin (Şekil 2A).
   1. Farenin iç muhafaza odası için bir parça PVC boru (35 mm dış çap, 26 mm iç çap, 6,75 inç uzunluğunda) satın alın ve kesin.
   2. Vücudun geri kalanı korumalı kalırken farenin başını ve üst arka omuzlarını ortaya çıkarmak için tüpün ucundan 3 inçte dikdörtgen şeklinde bir delik (5 x 1 cm) oluşturun.
      NOT: CNS yaralanma bölgesi farenin sırtında daha düşükse (örneğin, torasik veya lomber omurga), dikdörtgen deliği büyütün.
10. Hayvan tutucunun dışını özelleştirin (Şekil 2B).
    1. Farenin dış muhafaza odası için bir parça PVC boru (44 mm dış çap, 35 mm iç çap, 6 inç uzunluğunda) satın alın ve kesin.
    2. CNS yaralanma bölgesinin hassas kontrolü için dış muhafaza odası içinde bir pozlama açıklığı (Şekil 2C) oluşturun.
    3. Adım 2'deki sistem kalibrasyonu sırasında basınç dönüştürücüsünün namlusunu yerleştirmek için karşı tarafta karşılıklı bir açıklık oluşturun (örn. 9 mm'lik bir delik).
11. Gaz anestezisi dağıtımına uyum sağlamak için hayvan tutucunun dışını değiştirin. Bunun yerine enjekte edilebilir bir anestezik kullanılacaksa, bu adımı atlayın.
    1. Hayvan tutucunun dışının bir ucunu bant kullanarak kapatın. Gaz sızıntısını önlemek için sıkıca oturduğundan emin olun.
    2. Anestezi hattını yerleştirmek için contada küçük bir delik açın.
    3. Anestezi hattını, hayvanla doğrudan temas etmeden tüpün ortamına izofluran sokacak şekilde konumlandırın.

2. Sistem kalibrasyonu

1. Fiziksel basınç okumalarını dijital verilere çevirmek için bir basınç dönüştürücüsünü (Şekil 2D; seçenekler için Malzeme Tablosuna bakın) bir veri toplama (DAQ) sistemine ve bilgisayara bağlayın.
   1. Basınç dönüştürücüsünü DAQ modülüne bağlayın ( Malzeme Tablosuna bakın), uygun polarite ve güvenli bağlantılar sağlayın.
   2. Güç almasını ve bilgisayarla iletişim kurmasını sağlamak için DAQ modülünü bir DAQ kasasına takın ( Malzeme Tablosuna bakın).
   3. DAQ kasasını bilgisayara bağlamak için bir USB kablosu kullanın.
   4. Bilgisayarın DAQ donanımıyla arabirim oluşturmak ve veri almak için gerekli yazılım ve sürücülerin kurulu olduğundan emin olun (seçenekler için Malzeme Tablosuna bakın).
2. DAQ sistem ayarlarını yapılandırın.
   1. Yüklü DAQ yazılımını açın.
   2. DAQ sisteminin bilgisayar tarafından tanındığından emin olun.
   3. Özel DAQ modülünüz/kasanız ve basınç dönüştürücünüz için teknik özelliklere ve kalibrasyon veri sayfalarına bakın ve DAQ sistem ayarlarını yapılandırın:
      NOT: Bu el yazmasında kullanılan DAQ donanımı için DAQ ayarları GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular depoya https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON adresinden erişebilirler.
      1. Analog giriş: Basınç dönüştürücüsünün bağlı olduğu DAQ modülündeki fiziksel giriş kanalını seçin.
      2. Uyarma kaynağı (Vex kaynağı): DAQ modülünün uyarma kaynağını belirtin (örn. dahili veya harici).
      3. Uyarma voltajı (Vex değeri): Vex değerini basınç dönüştürücü üreticisi tarafından belirtilen değere ayarlayın (örn. 5 veya 10 V).
      4. Köprü tipi: DAQ modülünüz için uygun köprü tipini seçin (örneğin, tam köprü, yarım köprü veya çeyrek köprü).
      5. Köprü direnci: Köprü direncini, basınç dönüştürücü üreticisi tarafından belirtilen değere ayarlayın (örn. 350).
      6. Kalibrasyon faktörü/Özel ölçeklendirme: Ölçeklendirmeyi, basınç dönüştürücüsünün üreticisi tarafından sağlanan kalibrasyon veri sayfasına göre yapılandırın. Üretici, bilinen bir fiziksel birim (psi) uygulayarak ve ortaya çıkan elektrik birimlerini (mV/V) ölçerek basınç dönüştürücüsünü kalibre eder. Elde edilen elektrik birimlerine karşı bilinen fiziksel birimleri çizerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun.
      7. Örnekleme hızı (Hz): Örnekleme hızını, basınç değişikliklerinin dinamiklerini örtüşme olmadan yakalayacak kadar yüksek ayarlayın (örneğin, deneyinizdeki basınç değişikliklerinin hızına bağlı olarak 1 veya 10 kHz).
         NOT: Aşırı basınçlı hava dalga biçiminiz ne kadar dar olursa (yani, basıncı ne kadar hızlı değiştirirse), uyardığı frekans aralığı o kadar geniş olur ve bu nedenle örnekleme hızının o kadar yüksek olması gerekir. Bu, özellikle basınç değişikliklerinin hızlı bir şekilde meydana gelebileceği CNS yaralanma modellerini içeren deneylerde önemlidir.
3. Veri toplama için DAQ yazılımında dijital bir araç oluşturun.
   NOT: Bu dijital araç, sistemin çıkış basınçlarını doğru bir şekilde ölçmek, kaydetmek, görüntülemek ve analiz etmek için kullanılacaktır. Bu el yazmasında kullanılan dijital araç GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular depoya şu adresten erişebilir: https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Dönüştürücüden gelen ham verileri filtrelemek, yükseltmek veya başka bir şekilde işlemek için sinyal işleme algoritmaları uygulayın.
   2. En yüksek basınç, ortalama basınç ve basınç olaylarının süresi gibi ölçümleri hesaplamak için analiz araçları ekleyin.
   3. Gerçek zamanlı basınç verilerini göstermek için görsel öğeleri (ör. grafikler) ve veri toplamayı başlatmak, durdurmak ve sıfırlamak için kontrol öğelerini dahil edin.
   4. Dijital aracı kaydedin.
4. Sistemin çıkış basıncını ölçün
   1. Basınç dönüştürücüsünü kalın cl'ye yerleştirinamp xy tablası üzerindeki ve namlusu hayvan tutucunun deliğinden (adım 1.10.3'te oluşturulmuştur).
   2. Basınç dönüştürücüsünün namlusunu, uç tam olarak CNS yaralanma bölgesinin bulunduğu yere gelene kadar ayarlayın.
   3. Basınç dönüştürücüyü iki plastik vidayla sabitleyin (adım 1.8.3'te takılmıştır).
5. Sistemin çıkış basıncını yakalamak, analiz etmek ve görselleştirmek için paintball tabancasının tetiğini bırakırken dijital aracı veri toplama yazılımında çalıştırın.
6. Sistemin çıkış basıncı istenen seviyeye ulaşana kadar ayar vidasını ayarlayın.
   NOT: Paintball silahının namlusunu fenestratsız, 1,5 inç uzunluğunda ve 6,5 mm çapında olacak şekilde değiştirdikten sonra, sistem, namlunun³⁴ önünden 5 mm'de 15-50 psi aralığında aşırı basınçlı hava seviyelerini güvenilir bir şekilde iletebilir. 15 psi'nin altındaki ve 50 psi'nin üzerindeki aşırı basınçlı hava seviyeleri, yoğunlukta büyük değişkenlik gösterir. Giriş basıncının (psi), namluya olan mesafenin (cm) ve zamanın (ms) bir fonksiyonu olarak sistemin çıkış basıncının (psi) kapsamlı bir gösterimi için, Hines-Beard ve ark.2, Şekil ^34'ye bakın. Bu sistemi kullanarak 50 psi'nin üzerinde aşırı basınçlı hava seviyelerini güvenilir bir şekilde elde etmek için basınçlı hava yerine basınçlı nitrojen kullanın.

3. Hayvan hazırlama ve aşırı basınçlı havaya maruz kalma

1. Fareyi, tamamen sakinleşene kadar oksijende% 1.5-3 ^30,31,32,33 izofluran içeren bir indüksiyon odasında izofluran ile uyuşturun.
   1. Bir ayak parmağı tutamına yanıt verilmemesini değerlendirerek anesteziyi onaylayın.
   2. Fareyi, başı ve üst arka omuzları dikdörtgen açıklıktan açıkta kalacak şekilde iç hayvan tutucusuna sabitleyin, sırt ve alt arka bacaklar korumalı kalır.
   3. Farenin başını, iç hayvan tutucunun sağlam alt segmentine yapıştırılmış bir yastıkla destekleyin.
   4. Üst arka omuzlara cerrahi bant uygulayarak fareyi sabitleyin.
   5. İç hayvan tutucuyu dış hayvan tutucuya yerleştirin.
   6. Hayvan tutucunun içinde izofluran vermek için ikincil anestezi hattını açın.
   7. Anesteziklerin tüpten dışarı sızmasını önlemek ve aşırı basınçlı havaya maruz kaldığında farenin hareket etmesini önlemek için hayvan tutucunun ucuna ek bir yastık yerleştirin.
2. Aşırı basınçlı hava dağıtımı
   1. Dış hayvan tutucunun 4 mm'lik dairesel diyafram açıklığını doğrudan farenin sol gözünün üzerine hizalayın.
   2. Hayvan tutucuyu, açıklığı paintball tabancasının namlusu ile aynı hizaya gelecek ve dış yüzeyi namlunun ucundan 5 mm uzakta olacak şekilde xy tablasındaki kontrol düğmelerini kullanarak konumlandırın.
      NOT: Aşırı basınçlı hava seviyesini (psi) ve şeklini değiştirmek için hayvanın namlunun ucundan olan mesafesini ayarlayın. Aşırı basınçlı hava seviyesini düşürmek ve daha dağınık bir aşırı basınçlı hava dalgası oluşturmak için hayvanı namludan daha uzağa hareket ettirin.
   3. ITON'u indüklemek için aşırı basınçlı hava dizisini başlatın:
      1. 15 gün boyunca her gün tekrarlanan 0.5 sn aralıklarla iki kez 3 psi aşırı basınçlı hava patlaması^{verin 29,30,31,32}.
         NOT: Benzer ITON, 15 sn aralıklarla^{ayrılmış 0.5} psi aşırı basınçlı havanın üç ardışık patlamasının verilmesi yoluyla indüklenebilir 23. 0,5 sn aralıklarla ayrılmış altı ardışık 15 psi aşırı basınçlı hava patlamasının verilmesinden sonra ortaya çıkan ITON derecesi burada Temsili Sonuçlarda gösterilmektedir.
      2. Sahte fareleri aşırı basınçlı havanın gürültüsüne maruz bırakın, ancak hayvan tutucuyu açıklık artık namluya bakmayacak şekilde çevirerek ve havayı bir karton kalkanla bloke ederek aşırı basınçlı havanın kendisine maruz bırakmayın.
3. Fare kurtarma
   1. Farelerin anesteziden kurtulmasına izin verin.
      1. Gözlerin anesteziden kurumasını önlemek için kayganlaştırıcı göz damlası uygulayın ( Malzeme Tablosuna bakın).
      2. Kontrollü bir ısıtma desteği kullanarak sıcaklık sağlayın (bkz. Malzeme Tablosu).
   2. Fareleri dik bir duruş sağlayana ve normal şekilde yürüyene kadar görsel olarak izleyin. Kafes arkadaşlarıyla birlikte olmalarına izin verin.
   3. Kilo kaybını önlemek için yaralanmadan sonraki ilk 3 gün boyunca aşırı basınçlı havaya maruz kalan tüm farelere jel geri kazanım gıdası sağlayın (Malzeme Tablosuna bakınız).

4. Doku toplama ve işleme

1. Avertin Çalışma Çözeltisinin intraperitoneal enjeksiyonu ile fareleri ötenazi yapın.
   1. 10 g 2,2,2,-tribromoetanolü (Malzeme Tablosuna bakınız) 10 mL 1-Pentanol (Malzeme Tablosuna bakınız) ile karıştırarak Avertin Stoku yapın. Karanlıkta 4 °C'de saklayın.
   2. 50 mL'lik bir tüpte 1.25 mL Avertin Stoku, 45 mL çift damıtılmış su ve 5 mL 10x PBS'yi ( Malzeme Tablosuna bakınız) birleştirerek Avertin Çalışma Solüsyonu yapın. Filtre, karışımı sterilize edin ve karanlıkta 4 °C'de saklayın.
2. Fareleri 1x PBS'de (Malzeme Tablosuna bakınız) %4 paraformaldehit ile transkardiyal olarak perfüze edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
3. Aşırı basınçlı havaya maruz kalan gözü ince forseps (Malzeme Tablosuna bakınız) ve makas (Malzeme Tablosuna bakınız) kullanarak enüklee edin ve optik siniri koruduğunuzdan emin olun (AÇIK).
4. Daha fazla analiz için ON'u enükleasyonlu göz dokusu ile birlikte toplayın.
5. Doku üzerinde osmikat.
   1. 1x PBS'de %4 paraformaldehit ve %2 glutaraldehit ( Malzeme Tablosuna bakınız) içinde gece boyunca doku AÇIK ekleyin. Perfüze edilmemiş doku ile çalışıyorsanız (adım 4.2'de olduğu gibi), gece yerine 5 gün boyunca postfix.
   2. ON dokusunu bir boya fırçası (Malzeme Tablosuna bakınız) veya keskin bir tahta çubuk kullanarak 1x PBS ile 12 veya 24 oyuklu bir plakaya (Malzeme Tablosuna bakınız) aktarın.
   3. Çeker ocakta, 1xPBS'yi 2 M kkodilat tamponunda %0.2 osmiyum tetroksit ( Malzeme Tablosuna bakın) ile değiştirin (tarif GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular, bir transfer pipeti kullanarak https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) adresindeki depoya erişebilirler. 2 saat buz üzerinde inkübe edin.
   4. 1x PBS ile üç yıkama gerçekleştirin
      1. Osmiyum atıklarını uygun şekilde atın.
      2. Üçüncü PBS yıkamasından sonra plakayı iki gece çeker ocakta bırakın.
6. Dereceli bir etanol serisinde dokuyu dehidre edin.
   1. Sinirleri %50 etanol içeren yeni bir plakaya aktarın ve 30 dakika inkübe edin.
   2. 30 dakika boyunca% 70 etanol ile değiştirin.
   3. 30 dakika boyunca% 95 etanol ile değiştirin.
   4. 30 dakika boyunca %100 etanol ile değiştirin.
7. ON dokusunu epon'a gömün.
   NOT: Epon tarifi GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular depoya https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON adresinden erişebilir; tarifte listelenen malzemeler için Malzeme Tablosuna bakın.
   1. 1. Gün: Dokuyu propilen oksit ( Malzeme Tablosuna bakınız)/%100 etanol (1:1) içeren 2 mL'lik bir şişeye aktarın ve oda sıcaklığında 30 dakika çalkalayın. Saf propilen oksit ile değiştirin ve bir kez tekrarlayarak 15 dakika çalkalayın. Propilen oksit/epon (1:1) ile değiştirin ve gece boyunca soğuk odada çalkalayın.
   2. 2. Gün: Dokuyu %100 epon içeren 12 veya 24 oyuklu bir plakaya aktarın ve oda sıcaklığında 4 saat çalkalayın. Taze% 100 epon ile değiştirin ve gece boyunca oda sıcaklığında vakumda inkübe edin.
   3. 3. Gün: Epon inkübasyonunu 2. gündeki gibi tekrarlayın.
   4. 4. Gün: Dokuyu %100 epon içeren düz bir kalıba aktarın, dokuyu yeniden yönlendirin ve 60 °C'lik bir fırında 48 saat bekletin.
8. Doku ÜZERİNDE bölüm.
   1. Kalıpları, sinir merkezde olacak şekilde çift piramit şeklinde bir diseksiyon kapsamı altında kesin.
   2. Bir ultramikrotom ve bir elmas bıçak kullanarak 700 nm kalınlığındaki kesitleri toplayın (Malzeme Tablosuna bakınız).
   3. Damıtılmış su kullanarak şarjlı beyaz cam mikroskop slaytları üzerindeki bölümleri toplayın.
   4. Slaytları 60 °C'lik bir fırında su buharlaşana kadar kurutun. Oda sıcaklığında soğutun.
9. Doku üzerinde leke.
   1. Slaytları 1:1 metanol ve 2-propanol karışımında %1 parafenilendiamin (PPD) içine daldırın (Malzeme Tablosuna bakınız) 28 dakika boyunca.
   2. Slaytları 1: 1 metanol (Malzeme Tablosuna bakınız) ve 2-propanol (Malzeme Tablosuna bakınız) olmak üzere iki ardışık karışımda 1 dakika durulayın.
   3. Slaytları %100 etanolde 1 dakika durulayın ve kurumaya bırakın.
   4. Slaytları nemli bir kutuya yerleştirin ve bir transfer pipeti kullanarak bölümleri %1 toluidin mavisi ile örtün (Malzeme Tablosuna bakın).
   5. 60 °C fırında 20 dakika inkübe edin.
   6. Slaytları çift damıtılmış suyla durulayın ve kurumaya bırakın.
10. Doku üzerinde montaj ve görüntü.
    1. Lamel montaj ortamını kullanarak kayar (Yöntemler Tablosuna bakın), fazla ortamı çıkarın.
    2. Slaytların gece boyunca kurumasına izin verin.
    3. 100x yağa daldırma objektifi ile parlak alan mikroskobu kullanarak görüntü kesitleri.
11. Retina dokusunu gömün, kesit alın ve immünohistokimyasal olarak boyayın.
    1. Tüm göz dokusunu %4 paraformaldehit içinde 2-4 saat süreyle sabitleyin.
    2. Tüm göz dokusunu %30 sükroz içinde kriyoprotektif (4 ° C'de gece boyunca 1x PBS'deki Malzeme Tablosuna bakın.
    3. Göz dokusunu dondurucu bir ortama gömün (bkz. Malzeme Tablosu).
    4. Bir kriyostat üzerinde 10 μm kalınlığında retina kesitlerini toplayın ve bölümleri yüklü beyaz cam mikroskop slaytlarına monte edin (bkz. Malzeme Tablosu).
    5. Slaytları 1x PBS'de yıkayın ve% 5 Triton X-100 ve% 2 sığır serum albümini (BSA ) 1x PBS'de) bir bloke edici tamponda inkübe edin% 5 normal eşek serumu (NDS) ile% 5 normal eşek serumu (NDS) (bkz . Malzeme Tablosu) oda sıcaklığında 30 dakika.
    6. Slaytları gece boyunca 4 ° C'de (veya 4 saat boyunca oda sıcaklığında) primer antikorda (Malzeme Tablosuna bakınız) % 0.5 Triton X-100'de (Malzeme Tablosuna bakınız) 1xPBS'de (PBT) inkübe edin.
    7. Slaytları PBT'de yıkayın ve %5 NDS ile bloke edici tamponda ikincil antikorda ( Malzeme Tablosuna Bakınız) inkübe edin.
    8. Slaytları PBT'de yıkayın, montaj ortamını DAPI (Malzeme Tablosuna bakınız), lamel ile uygulayın ve oje ile kapatın.
    9. Görüntü epifloresan mikroskobunda kayar.
    10. Floresan yoğunluğunu ölçüyorsanız, görüntülerin aynı büyütme, kazanç ve pozlama ayarlarıyla aynı retina bölgesinden alındığından emin olun.
12. Aksonlara güvenin.
    1. Akson yoğunluğunu (aksonlar^/mm2) tahmin etmek için sabit bir ızgara kaplaması kullanarak toplam sinir kesit alanının %20'sini örnekleyerek görüntü analiz yazılımını kullanarak (Malzeme Tablosuna bakın) akson sayısını manuel olarak sayın.
    2. ON kesitinin alanını ölçün.
       1. Görüntülemek için kullanılan hedefin piksellerini/mikronlarını ayarlamak için Ölçek Ayarla işlevini kullanın.
       2. Damar sistemi hariç olmak üzere optik sinirin miyelin kılıfı boyunca izlemek için Poligon seçim aracını kullanın.
       3. Ölçüm işlevini kullanarak AÇIK alanını ölçün.
       4. Ölçülen alanı 0,2 ile çarparak toplam alanın %20'sini belirleyin.
    3. Sabit ızgarayı ON kesitine yerleştirin.
       1. Sayma Dizisi eklentisini indirin.
          NOT: Bu eklenti GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular depoya https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON adresinden erişebilirler.
       2. Artı işareti şeklinde eşit aralıklı kare şeklinde 9 parçadan oluşan sabit bir ızgarayı enine kesitin üzerine yerleştirmek için Sayma Dizisi eklentisini açın.
       3. ON kesitinin toplam alanının %20'sini (adım 4.6.2.4'te hesaplanmıştır) 9'a bölerek 9 bölgenin her birinin alanını düzenleyin.
       4. Sabit ızgarayı, artı işaretinin merkezi AÇIK kesitinin ortasında ortalanacak şekilde ortalayın.
    4. Canlı ve dejenere aksonları ayrı ayrı sayın.
       1. Hücre Sayacı eklentisini indirin ve açın.
          NOT: Bu eklenti GitHub'da herkese açıktır. İlgilenen okuyucular depoya https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON adresinden erişebilirler.
       2. 9 bölgenin her biri için, miyelin kılıfının durumunu görselleştirerek canlı ve dejenere akson profillerinin sayısını ayrı ayrı sayın. Yanlılığı önlemek için akson nicelemesinin hayvanın deney grubuna kör durumdayken yapıldığından emin olun.
       3. Canlı aksonlar için, miyelin kılıfının sağlam, düzgün bir şekilde lekelenmiş ve aksonun etrafında düzgün ve eşit bir şekilde çevrelenmiş göründüğü aksonları arayın.
       4. Dejenere aksonlar için, miyelin kılıfında kalınlaşma, soğanlanma veya çökme olanları arayın.
       5. Akson, üst üste binen ızgara tarafından kısmen kesilirse, bunu yalnızca lümen görülürse akson sayısına dahil edin.
       6. Dikdörtgen aksonların yanlışlıkla bir kereden fazla sayılmadığından emin olun ve dejenere akson profili için döküntü veya tozu karıştırmayın.
    5. Gruplar arasındaki ortalama akson sayılarındaki önemli farklılıkları test etmek için istatistiksel analizler yapın. Önceki analizlerde gözlemlenen normal değişkenliği hesaba katmak için her gruba en az dört ON'un dahil edildiğinden emin olun.
       1. İki bağımsız grubun ortalamaları arasındaki önemli farklılıkları değerlendirmek için bir Bağımsız Örnekler t-testi (bağımsız örnekler için Öğrenci t-testi olarak da bilinir) gerçekleştirin.
       2. Parametrik olmayan alternatif olan Mann-Whitney U Testini, Bağımsız Örnekler t-testi için koşullar karşılanamıyorsa (yani, veriler normal olarak dağılmamışsa veya örneklem boyutları çok küçükse) gerçekleştirin.

Tartışmalar

Bu özel aşırı basınçlı hava sistemi, fare modellerinde kapalı sistem CNS yaralanmalarını incelemek için yararlı bir araçtır. Örnek deneyden elde edilen temsili sonuçlar, bu sistemi kullanarak aşırı basınçlı havanın odak dağıtımının ITON'u etkili bir şekilde indükleyebileceğini ve bunun da önemli akson kaybı ve dejenerasyonu ile sonuçlanabileceğini göstermektedir. Bu, sistemin hassas ve tekrarlanabilir CNS yaralanması üretme yeteneğini vurgular.

Bu sistemin en güçlü yönlerinden biri, bir dizi CNS yaralanmasına neden olacak şekilde özelleştirilebilirliğidir. Yaralanmanın ciddiyeti, sistemin genel çıkış basıncı, xy konumlandırma aşaması kullanılarak hayvanın namlunun ucundan olan mesafesi, maruz kalma açıklığının boyutu ve şekli, aşırı basınçlı havaya maruz kalma sayısı ve maruziyetler arasındaki aralık değiştirilerek ayarlanabilir. Ek olarak, CNS yaralanmasının yeri, hayvan tutucu içindeki maruz kalma açıklığının konumu değiştirilerek ayarlanabilir. Bu çok yönlülük, sistemin fare modellerinde bir dizi kapalı sistem CNS yaralanması üretmesini sağlamıştır. Başlangıçta sistem, ön ve arka kutup hasarına ve ilgili eksikliklere^34,36 odaklanarak, bağışıklık sistemi yanıtının 37, suşa özgü sonuçların³⁸ ve nöroprotektif ajanların^{etkinliğinin 39} dahil olmak üzere kapalı küre yaralanmalarını modellemek için kullanıldı. Sonunda, bu uygulama, dolaylı travmatik optik nöropatiyi (ITON) modellemek için tekrarlanan göze yönelik maruziyetlerin sekellerini değerlendirmek için ^{genişletildi.30} ve tekrarlanan maruziyetler arasındaki sayı ve aralığın^{etkisini keşfetmek 33}. O zamandan beri, sistemin uygulaması, başa yönelik maruziyetler^40,41 yoluyla kapalı kafa hafif travmatik beyin hasarını (mTBI) ve sırta yönelik maruziyetler⁴² yoluyla kapalı vücut omurilik yaralanmasını (SCI) modellemek için genişledi ve cihazın çeşitli CNS yaralanma alanlarını incelemede uyarlanabilirliğini ve çok yönlülüğünü vurguladı.

Bu sistemi kullanırken, deneysel sonuçların tekrarlanabilirliğini ve güvenilirliğini sağlamak için yaralanma sonuçlarındaki değişkenliği en aza indirecek önlemler almak çok önemlidir. Temel önlemler, tutarlı basınç dağıtımını sağlamak için her üç maruziyet serisinden önce ve sonra sistemin çıkış basıncı seviyelerinin kalibre edilmesini içerir. Basınçlı hava³⁴ kullanılırken sistem 15 psi ile 50 psi arasında çalıştırıldığında değişkenlik düşük olsa da, tutarlı kalibrasyon, düşük pil veya düşük hava gibi beklenmedik hataların algılanmasına yardımcı olur. Ek olarak, basınç dalgasının yoğunluğu mesafe ile azaldığından, tutarlı aşırı basınç büyüklüğü sağlamak için her bir hayvanı namlunun ucundan aynı mesafeye yerleştirin. Düzgün konumlandırma ayrıca her hayvanın hava dalgasının aynı kısmından etkilenmesini sağlar. Ayrıca, hayvanların tutucu içinde eşit şekilde sabitlenmesi, özellikle hareket riski olduğunda tekrarlanan maruz kalma modellerinde, ilgilenilen dokunun tutarlı bir şekilde hedeflenmesini sağlar. Son olarak, hayvanların yaşı, cinsiyeti ve genetik geçmişindeki tekdüzelik, bu faktörler yaralanmaya verilen yanıtı etkilediği için çok önemlidir. Örneğin, bu sistemi kullanan önceki çalışmalar, göze yönelik aşırı basınçlı havanın farklı fare suşları üzerindeki etkilerini karşılaştırarak, C57Bl / 6J³⁶, DBA / 2J³⁷ ve Balb / c³⁸ fareleri arasındaki yaralanma tepkisindeki önemli farklılıkları vurguladı. DBA/2J ve Balb/c fareleri, özellikle sağlam ve kalıcı yaralanma profilleri gösteren Balb/c fareleri ile C57Bl/6J farelere kıyasla daha şiddetli ön kutup patolojileri, daha fazla retina hasarı, daha yüksek oksidatif stres ve daha belirgin nöroinflamatuar yanıtlar sergiledi³⁸.

Sistem sorun giderme
Belirli bir manometre ayarı için basınç değerleri alışılmadık derecede düşükse, tetiği 5-10x çekerek havanın sistemden geçmesine ve regülatörün yeni bir ayara geçmesine izin verin. Hava tankında sızıntı olmamalıdır. Hava tankı üzerindeki O-ring hasar görmemeli veya aşınmamalı, hava tankı yeterli havaya sahip olmalı ve tabancanın pili bitmemelidir. XY tablası, namlunun ucundan itibaren normal konumundan uzaklaşmamalı ve aşırı basınçlı havaya maruz kalma açıklığı, tabancanın namlusu ile aynı hizada olmalı ve onu kapatmamalıdır. Regülatör, tabancanın kabzasına sıkıca sabitlenmelidir. Manometrede en yüksek ayarın kullanılmasına rağmen basınç değerleri çok düşükse, manometre 200 psi'nin üzerine çıkarılmamalı ve tabanca üzerindeki hız ayarı maksimum ayara getirilmelidir. Basınç ayarları tutarsızsa (örneğin, yüksek ve sonra düşük), hava tankının yeterli havaya sahip olduğundan, regülatörün tabancanın kabzasına sıkıca sabitlendiğinden, hava tankında sızıntı olmadığından ve sıkıca vidalandığından ve hava tankındaki O-ring'in hasar görmediğinden veya aşınmadığından emin olun.

Bu sistemin tüm yeteneklerini kapsamlı bir şekilde anlamak için, sınırlamalarını tanımak önemlidir. Laboratuvar ortamında gerçek dünya senaryolarını taklit etmek zor olmaya devam ediyor. Bu sistem aşırı basınçlı hava üretmesine rağmen, değişen basınç ve sıcaklık gradyanları, enkaz ve yansıyan dalgaların varlığı ve çok fazlı bir yapı gibi patlayıcı bir olayın karmaşık dinamiklerini kopyalamaz. Ek olarak, basınçta keskin, neredeyse anlık bir tepe noktası ve ardından taban^{çizgisi 43'e} dönmeden önce ortam basıncının altına düşen hızlı bir üstel bozulma ile karakterize edilen bir Friedlander dalga biçimini ("birincil patlama dalgası") taklit etmez. Daha ziyade, bu sistem tarafından üretilen dalga biçimi, belirgin bir negatif faz olmaksızın basınçta daha kademeli bir yükselme ve düşüşün olduğu daha basit, daha simetrik bir profili temsil eder (bkz. Hines-Beard ve ^ark.34'teki Şekil 2C). Biraz avantajlı bir şekilde, bu dalga formu hem patlama hem de künt yaralanmaların unsurlarını birleştirir. Çan şeklindeki "basınç darbesi", nesneye çarpan bir "hava duvarına" benzer şekilde tutarlı bir aşırı basınç etkisi sağlar. Yine de, dalga tarafından verilen aşırı basınçlı hava aynı zamanda patlama yaralanmalarının önemli bir karakteristik yönüdür. Bazıları, bu dalga formunun her iki yaralanma türünün de yönlerini içermesine rağmen, her ikisinin de karmaşıklığını tam olarak yakalamadığını iddia edebilir. Bununla birlikte, bu tutarlı ve tekrarlanabilir "basınç darbesi", fokal kapalı sistem CNS yaralanmasını incelemek için bir laboratuvar ortamında kontrollü deneyler için idealdir. Yaralanmanın fokal doğasını daha önce gösterdik. Örneğin, bir göze maruz kalmak birincil burun epiteline veya beyne zarar vermez⁴⁴. Ayrıca, fare kafasının yan tarafına yönlendirildiğinde, beynin küçük bir alanı etkilenir⁴⁵. Son olarak, ITON için kullanılan basınç seviyesinde bu sistemden gelen aşırı basınçlı havadan gelen enerji, kısa bir zaman aralığı³³ ile tekrarlanmadıkça fareyi etkilemedi. Bu nedenle, basınç zarar vermez ve bu nedenle bir jet ucu kuvvetini tekrarlamaz. Ayrıca, göze tekrarlanan aşırı basınçlı hava maruziyetinde bile, ön göz yapıları üzerinde hiçbir etki olmamıştır³³. Önemli optik sinir dejenerasyonu ve görme kaybı, yalnızca 1 dakikadan daha az bir maruziyet aralığı ile tekrarlanan maruziyet ile meydana geldi³³.

Kapalı sistem CNS yaralanmaları oluşturmak için diğer laboratuvar cihazlarıyla karşılaştırıldığında, bu sistem benzersiz faydalar sunar. Hızlı patlamaya maruz kalmanın yaygın bir tehlike olduğu yüksek riskli mesleki ortamlardaki koşulları taklit ederek, hızlı bir şekilde art arda (0,5 sn aralıklarla)³³ ardışık aşırı basınçlı hava patlamaları sağlayabilir. Örneğin, askeri personel, hem eğitim hem de savaş senaryolarında, otomatik tüfekler (örneğin, M16, AK-47), makineli tüfekler (örneğin, M2 .50 kalibreli), Gatling silahları ve mini silahlar dahil olmak üzere hızlı tekrarlanan ateşleme yeteneğine sahip bir dizi otomatik ateşli silah kullanır. Askeri personel tarafından kullanılan diğer daha yavaş, ancak tekrarlayan silahlar arasında topçu, havan topları, el bombaları ve el yapımı patlayıcı cihazlar (IED'ler) bulunur. Kontrollü yıkımda yer alan yıkım işçileri ve kayaları parçalamak ve mineralleri çıkarmak için patlatma operasyonlarında yer alan madenciler de hızlı bir şekilde art arda patlamalar yaşarlar. Son olarak, pnömatik aletler, kazık çakma makineleri veya güçlü vurmalı kuvvetler üreten diğer ağır ekipmanları kullanan inşaat işçileri, patlama maruziyetlerini taklit eden hızlı tekrarlanan darbeler yaşayabilir. Özellikle, aşırı basınçlı havanın hızlı bir şekilde iletilmesi, her olay arasında kapsamlı yeniden yapılandırma veya yeniden basınçlandırma gerektiren şok tüpleri gibi cihazlarla mümkün değildir. Şok tüpleri, şok dalgaları oluşturmak için patlayan diyaframlar kullanır ve her patlamadan sonra diyaframın değiştirilmesi gerekir. Şok tüpünün açılması, kullanılmış diyaframın çıkarılması, yeni bir diyaframın takılması ve sistemin sıfırlanması ve yeniden basınçlandırılması için zaman tanınması gerektiğinden bu işlem zaman alır. Bu nedenle, özellikle hızlı tekrarlanan patlama maruziyetinden sonra CNS hasarını araştıran çalışmalar için, her olay arasında kapsamlı yeniden yapılandırma veya yeniden basınçlandırma gerektirmeyen bir sistem idealdir.

Bu modülel, kullanıcı dostu, uygun maliyetli sistemin gelecekteki uygulamaları umut vericidir. Uyarlanabilir ve benzersiz özelliklerinden yararlanan bu sistem, gelecekteki klinik öncesi terapötik çalışmalar için umut verici birkaç yol açmaktadır. Hızlı, sıralı aşırı basınçlı hava patlamaları sağlama yeteneği, kronik travmatik ensefalopati ve diğer uzun vadeli nörodejeneratif durumları anlamak için ilgili olan tekrarlanan patlama maruziyetlerinin kümülatif etkilerini incelemek için kullanılabilir. Ek olarak, bu sistem, optimal tedavi pencerelerini belirlemek için nöroprotektif ilaçların zamanlaması ve dozu da dahil olmak üzere, kapalı sistem CNS yaralanmalarını hafifletmeyi amaçlayan çeşitli farmakolojik müdahalelerin etkinliğini araştırmak için kullanılabilir. Ayrıca, sistemin hem künt hem de patlama yaralanma mekanizmalarının özelliklerini taklit etmedeki hassasiyeti, gerçek dünya senaryolarında bireylerin yaşadığı karmaşık travmayı yansıtan kapsamlı yaralanma modellerinin geliştirilmesine olanak tanır. Bu, iltihaplanma, oksidatif stres ve nöronal ölüm gibi yaralanmanın ortak küresel yönlerini ele alan çok modlu tedavilerin test edilmesini kolaylaştırabilir. Genel olarak, bu cihaz, kapalı sistem CNS yaralanmaları konusundaki anlayışımızı ilerletmek ve etkili terapötik müdahaleler geliştirmek için çok yönlü ve güçlü bir platform sunar.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software