Система для лечения очагового, закрытого повреждения центральной нервной системы

Резюме

Этот протокол описывает специальную систему избыточного давления воздуха, предназначенную для индуцирования повреждений центральной нервной системы (ЦНС) закрытой системы у мышей, включая травмы глаз, головного и спинного мозга. Цель этого протокола состоит в том, чтобы предоставить исследователям основу для легкой адаптации и расширения системы для своих уникальных исследований травм ЦНС.

Аннотация

Распространенность повреждений закрытой системы центральной нервной системы (ЦНС) подчеркивает необходимость более глубокого понимания этих травм для улучшения защитных и терапевтических вмешательств. Решающее значение для этого исследования имеют животные модели, которые воспроизводят повреждения ЦНС в закрытой системе. В этом контексте была разработана специальная система избыточного давления воздуха для воспроизведения ряда повреждений закрытой системы ЦНС на моделях мышей, включая травмы глаза, головного и спинного мозга. На сегодняшний день система использовалась для подачи воздуха избыточного давления, направленного на глаза, голову или позвоночник, для моделирования травмы переднезаднего полюса глаза, непрямой травматической оптической нейропатии (ИТОН), очаговой черепно-мозговой травмы и повреждения спинного мозга. В этом документе представлен подробный протокол, описывающий конструкцию и работу системы, а также представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие ее эффективность. Представленная здесь надежная структура обеспечивает прочную основу для продолжающихся исследований травмы ЦНС. Используя гибкие атрибуты системы, следователи могут изменять и тщательно контролировать местоположение, тяжесть и время травм. Это позволяет проводить всестороннее сравнение молекулярных механизмов и терапевтической эффективности при множественных повреждениях закрытой системы ЦНС.

Введение

Повреждения закрытой системы центральной нервной системы (ЦНС) — это травмы, которые вызваны повреждением головного или спинного мозга без перелома черепа или позвоночника. Эти травмы включают черепно-мозговую травму (ЧМТ) и травму спинного мозга (ТСМ) и могут возникнуть в результате различных инцидентов, включая травмы тупым предметом (например, падения, спортивные травмы, автомобильные аварии) и взрывы взрывов. Повреждения закрытой системы ЦНС обычно считаются менее серьезными по сравнению с проникающими повреждениями ЦНС, но они происходят чаще. Однако, как и проникающие травмы, повреждения закрытой системы ЦНС могут привести к долгосрочным и прогрессирующим проблемам со здоровьем, особенно после повторных случаев 1,2,3,4,5,6. Вызывает тревогу тот факт, что новые данные свидетельствуют о том, что даже субклинические повреждения ЦНС с закрытой системой, которые не соответствуют диагностическим критериям ЧМТ или ТСМ после однократного случая 7,8,9,10,11,12,13, могут развиться в хронические нейродегенеративные заболевания после повторной травмы ^6,14,15.¹⁶. Это подчеркивает настоятельную необходимость лучшего понимания механизмов и последствий однократных и повторных повреждений ЦНС в закрытой системе.  Такие знания необходимы для совершенствования защитных и терапевтических подходов. Решающее значение для этого имеют животные модели, которые воспроизводят повреждения закрытой системы ЦНС.

Современные модели повреждений ЦНС с закрытой системой на животных сыграли важную роль в углублении нашего понимания патофизиологии и потенциальных защитных и терапевтических вмешательств при этих травмах. Грызуны особенно популярны благодаря своей низкой стоимости, доступности, генетической манипулируемости, простоте в обращении, хорошо зарекомендовавшим себя поведенческим и физиологическим анализам и более^{благоприятным} этическим соображениям. Общие методы индуцирования закрытой системы ЧМТ у грызунов включают устройства для сброса веса^18,19, устройства²⁰ с контролируемым кортикальным воздействием (ЧМТ) и ударные трубки²¹, приводимые в действие сжатым воздухом. Для ТСМ модели тупой травмы обычно требуют ламинэктомии^22,23 или других хирургических техник²⁴ для прямого доступа к спинному мозгу или эпидуральному пространству. Тем не менее, были разработаны модели взрывной травмы SCI с закрытым кузовом с использованием ударных трубок ²⁵, приводимых в действие сжатым воздухом. Несмотря на то, что каждая из этих моделей предоставляет ценную информацию, она имеет уникальные ограничения. Модели снижения веса могут иметь высокую вариабельность и ограниченный контроль над локализацией и тяжестью травмы, что вызывает экспериментальные и этические опасения по поводу причинения тяжелых, неконтролируемых травм. Устройства CCI обеспечивают точность, но требуют обучения для работы, могут включать трепанацию черепа и могут страдать от механической изменчивости, влияющей на воспроизводимость^. Электрошоковые трубки, как правило, менее инвазивны, но их может быть трудно приобрести, сложно настроить и эксплуатировать, а также они могут создавать нереалистичные и сильно изменчивые условия травмы из-за факторов окружающей среды, отражений волн и сложных взаимодействий^{давления.}

Для лучшего изучения механизмов и эффектов одиночных и повторных повреждений ЦНС с закрытой системой и их лечения, в данной статье представлен модульный, удобный для пользователя, экономически эффективный и неинвазивный метод. Основная цель этого подхода заключается в обеспечении точного контроля и гибкой модификации параметров травмы, включая местоположение, тяжесть и время. Для достижения этой цели в данной рукописи представлен подробный протокол создания, калибровки и устранения неисправностей воздушной системы избыточного давления, который устраняет некоторые ограничения существующих устройств для лечения травм ЦНС в закрытой системе. Эта система не только обеспечивает экономическую эффективность и минимальное время настройки, но и очень универсальна, обеспечивая стабильные и воспроизводимые результаты, сводя к минимуму этические проблемы и максимизируя клиническую значимость. Кроме того, описывается способность системы вызывать ряд повреждений ЦНС в закрытой системе на мышиных моделях, а также ее потенциальное применение в будущих исследованиях. Примечательно, что цель данной рукописи состоит в том, чтобы обеспечить структуру, которая позволит исследователям легко приобретать, адаптировать и расширять эту систему для своих конкретных потребностей, тем самым способствуя текущим исследованиям травмы ЦНС. Также представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие эффективность системы в индуцировании аксональной травмы.

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Вандербильта (IACUC), а также в соответствии с рекомендациями Ассоциации по оценке и аккредитации ухода за лабораторными животными (AAALAC) и Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO). Все мыши содержались в группах и содержались в течение 12-часового цикла свет/темнота и получали пищу и воду в неограниченном количестве. В этом протоколе использовались трехмесячные 30,31,33 мыши C57 Bl/6.

1. Построение системы

1. Приобретите имеющееся в продаже пейнтбольное ружье (см. Таблицу материалов) со встроенным регулятором давления воздуха.
2. При необходимости модифицируйте ствол (Рисунок 1А).
   1. Если оригинальный цилиндр фенестрирован отверстиями или перфорациями по всей его длине, сжатый воздух может утечь и рассеяться в воздухе, снижая максимальный уровень давления на выходе. Замените его, купив цельный цилиндр без фенестрации, чтобы увеличить диапазон выходного давления (рис. 1, I).
   2. Если оригинальный ствол длинный и громоздкий, укоротите его, купив более короткий ствол нестандартной длины или используя труборез или пилу.
   3. Если оригинальный ствол не обеспечивает желаемого уровня давления на выходе, измените внутренний диаметр (размер канала ствола) ствола, купив ствол с нестандартным диаметром канала ствола. Уменьшение диаметра исходного отверстия приведет к увеличению диапазона выходного давления, и наоборот.
3. При необходимости модифицируйте регулятор (рис. 1B).
   1. Снимите направляющую крышку, чтобы обеспечить прямой доступ к регулировочному винту (Рисунок 1, II), если оригинальный регулятор поставляется с направляющей крышкой.
   2. Замените винт с шестигранной головкой на винт с плоской головкой, если оригинальный регулировочный винт поставляется с гнездом с шестигранной головкой.
4. Снимите стандартный загрузчик гравитационной подачи (т. е. резервуар для удержания и подачи шариков с краской в пистолет) и загерметизируйте вертикальную подающую трубку (рис. 1, III), чтобы избежать утечки давления.
   1. Перед снятием загрузчика с гравитационной подачей убедитесь, что пейнтбольное ружье разряжено, а источник воздуха (CO₂ или баллон со сжатым воздухом) отключен.
   2. Найдите загрузочную горловину (рис. 1C), к которой прикреплен загрузчик гравитационной подачи. Ослабьте зажим горловины подачи с помощью соответствующего инструмента.
   3. Снимите стандартный загрузчик гравитационной подачи, потянув его вверх.
   4. Вставьте крышку горловины подачи или заглушку, чтобы закрыть отверстие. Они обычно доступны в магазинах пейнтбола или в Интернете и спроектированы таким образом, чтобы плотно прилегать к горловине подачи, закрывая ее.
5. Соберите платформу (рис. 1D) для пейнтбольного ружья и стол для позиционирования животных.
   1. Постройте основание платформы, вырезав два куска древесноволокнистой плиты средней плотности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от доступности и предпочтений материала также могут быть использованы альтернативные материалы (например, фанера).
   2. Отрежьте меньший квадратный кусок размером 1,5 х 1,5 фута.
   3. Отрежьте большую прямоугольную деталь размером 2,5 х 1,5 фута.
   4. Поднимите и закрепите меньшую платформу на 3,5 дюйма над большой платформой с помощью двух параллельных 2 x 4 с.
6. Закрепите модифицированное пейнтбольное ружье на платформе.
   1. Положите пейнтбольное ружье на бок на меньшую платформу так, чтобы конец ствола выступал на полдюйма за край.
   2. Закрепите пейнтбольное ружье с помощью монтажных кронштейнов или зажимов, которые подходят к стволу и прикладу пейнтбольного ружья.
   3. Прикрепите баллон с сжатым воздухом (рис. 1E; см. Таблицу материалов) к регулятору пейнтбольного ружья. В качестве альтернативы можно подключить линию прямого давления от резервуара со сжатым азотом, чтобы увеличить диапазон надежных уровней давления на выходе.
   4. Если вы используете баллон с сжатым воздухом, закрепите его на ДВП с помощью прочного тканевого ремня. Прикрепите ремешок с помощью винтов или болтов и включите механизм регулировки для легкого затягивания и ослабления.
7. Закрепите позиционирующий стол x-y на большем куске прямоугольной древесноволокнистой плиты напротив ствола пейнтбольного пистолета с помощью винтов или болтов (Рисунок 1F).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стол позиционирования по оси x-y (см. Таблицу материалов), также известный как стол по оси x-y, может быть приобретен у различных поставщиков, включая интернет-магазины, промышленных поставщиков и поставщиков научного оборудования. При покупке позиционирующего стола x-y учитывайте диапазон перемещения, грузоподъемность, точность и выбор между ручной регулировкой и моторизованным управлением. Этот стол позиционирования по оси X-y обеспечит точное перемещение и позиционирование животного по двум осям: оси X (горизонтально к стволу или от него) и оси y (вертикально вверх или вниз от ствола).
8. Модифицируйте позиционирующий стол x-y, установив три зажима из ПВХ.
   1. Закрепите два зажима из ПВХ толщиной 1 см с обеих сторон передней части ствола с помощью винтов или болтов. Убедитесь, что зажимы достаточно широкие, чтобы вместить держатель для животных из шагов 1.9 и 1.10 (например, 1,5 дюйма).
   2. Закрепите более толстый (4 см) зажим из ПВХ перпендикулярно и напротив двух зажимов толщиной 1 см с помощью винтов или болтов. Убедитесь, что зажим достаточно широк, чтобы вместить датчик давления, указанный на шаге 2,4 (например, 1,5 дюйма).
   3. Просверлите два отверстия в верхней части третьего зажима и вставьте два пластиковых винта для дополнительной стабилизации датчика давления во время калибровки системы на Шаге 2.
9. Настройте внутреннюю часть держателя для животных (рис. 2A).
   1. Купите и отрежьте кусок трубки из ПВХ (внешний диаметр 35 мм, внутренний диаметр 26 мм, длина 6,75 дюйма) для внутренней камеры хранения мыши.
   2. Создайте отверстие прямоугольной формы (3 х 5 см) на расстоянии 1 дюйма от конца трубки, чтобы обнажить голову мыши и верхнюю часть задних плеч, в то время как остальная часть тела остается защищенной.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если место повреждения ЦНС находится ниже на спине мыши (например, в грудном или поясничном отделе позвоночника), увеличьте прямоугольное отверстие.
10. Настройте внешнюю сторону держателя для животных (рисунок 2B).
    1. Купите и отрежьте кусок трубки из ПВХ (внешний диаметр 44 мм, внутренний диаметр 35 мм, длина 6 дюймов) для внешней камеры хранения мыши.
    2. Создайте отверстие для экспозиции (рис. 2C) во внешней камере герметизации для точного контроля места повреждения ЦНС.
    3. Создайте взаимное отверстие на противоположной стороне, чтобы вставить цилиндр преобразователя давления во время калибровки системы на этапе 2 (например, отверстие диаметром 9 мм).
11. Измените внешнюю сторону держателя для животных, чтобы обеспечить его доставку под газовой анестезией. Если вместо этого будет использоваться инъекционный анестетик, пропустите этот шаг.
    1. Заклейте один конец внешней стороны держателя для животных с помощью ленты. Обеспечьте плотное прилегание для предотвращения утечки газа.
    2. Создайте небольшое отверстие в уплотнении, чтобы ввести анестезиологическую капельницу.
    3. Расположите анестезиологическую линию так, чтобы изофлуран вводился в среду трубки без прямого контакта с животным.

2. Калибровка системы

1. Подключите преобразователь давления (рис. 2D; варианты см. в таблице материалов ) к системе сбора данных (DAQ) и компьютеру, чтобы преобразовать показания физического давления в цифровые данные.
   1. Подключите датчик давления к модулю сбора данных (см. Таблицу материалов), обеспечив правильную полярность и надежное соединение.
   2. Вставьте модуль сбора данных в шасси сбора данных (см. таблицу материалов), чтобы он мог получать питание и обмениваться данными с компьютером.
   3. Используйте USB-кабель для подключения корпуса системы сбора данных к компьютеру.
   4. Убедитесь, что на компьютере установлено необходимое программное обеспечение и драйверы для взаимодействия с оборудованием системы сбора данных и сбора данных (варианты см. в Таблице материалов ).
2. Настройте параметры системы сбора данных.
   1. Откройте установленное программное обеспечение для сбора данных.
   2. Убедитесь, что система сбора данных распознается компьютером.
   3. Ознакомьтесь со спецификациями и спецификациями калибровки для конкретного модуля сбора данных/шасси и преобразователя давления и настройте параметры системы сбора данных:
      ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки сбора данных для аппаратного обеспечения базы данных, используемого в этой рукописи, находятся в открытом доступе на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. Аналоговый вход: выберите физический входной канал на модуле сбора данных, к которому подключен преобразователь давления.
      2. Источник возбуждения (источник Vex): Укажите источник возбуждения модуля сбора данных (например, внутренний или внешний).
      3. Напряжение возбуждения (значение Vex): Установите значение vex на значение, указанное производителем преобразователя давления (например, 5 или 10 В).
      4. Тип моста: Выберите соответствующий тип моста вашего модуля сбора данных (например, полный мост, полумост или четвертьмост).
      5. Сопротивление моста: установите сопротивление моста на значение, указанное производителем датчика давления (например, 350).
      6. Калибровочный коэффициент/Пользовательское масштабирование: Настройте масштабирование на основе калибровочного листа, предоставленного производителем датчика давления. Производитель калибрует преобразователь давления, применяя известную физическую единицу измерения (фунт на квадратный дюйм) и измеряя результирующие электрические единицы (мВ/В). Создание калибровочной кривой путем сопоставления известных физических единиц с полученными электрическими единицами.
      7. Частота дискретизации (Гц): установите частоту дискретизации на достаточно высоком уровне, чтобы зафиксировать динамику изменений давления без искажения (например, 1 или 10 кГц в зависимости от скорости изменения давления в вашем эксперименте).
         ПРИМЕЧАНИЕ: Чем уже форма волны избыточного давления (т.е. чем быстрее она изменяет давление), тем шире диапазон частот, который она возбуждает, и, следовательно, тем выше должна быть частота дискретизации. Это особенно важно в экспериментах с использованием моделей травм ЦНС, где изменения давления могут происходить быстро.
3. Создайте цифровой инструмент в программном обеспечении сбора данных для сбора данных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот цифровой инструмент будет использоваться для точного измерения, записи, отображения и анализа выходного давления системы. Цифровой инструмент, использованный в рукописи, находится в открытом доступе на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
   1. Реализуйте алгоритмы обработки сигналов для фильтрации, усиления или иной обработки необработанных данных от преобразователя.
   2. Добавьте инструменты анализа для расчета таких показателей, как пиковое давление, среднее давление и продолжительность событий давления.
   3. Используйте визуальные элементы (например, графики) для отображения данных о давлении в режиме реального времени и элементы управления для запуска, остановки и сброса сбора данных.
   4. Сохраните цифровой инструмент.
4. Измерение выходного давления системы
   1. Вставьте датчик давления в толстый зажим на x-y столе и его стволе через отверстие держателя животного (созданного на шаге 1.10.3).
   2. Отрегулируйте ствол датчика давления до тех пор, пока наконечник не окажется точно в месте повреждения ЦНС.
   3. Закрепите преобразователь давления двумя пластиковыми винтами (установлен на. 1.8.3).
5. Запустите цифровой инструмент в программном обеспечении для сбора данных, отпустив спусковой крючок пейнтбольного ружья, чтобы захватить, проанализировать и визуализировать выходное давление системы.
6. Отрегулируйте регулировочный винт до тех пор, пока выходное давление системы не достигнет нужного уровня.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После модификации ствола пейнтбольного ружья на незащищенный, 1,5 дюйма в длину и 6,5 мм в диаметре, система способна надежно подавать избыточное давление воздуха в диапазоне 15-50 фунтов на квадратный дюйм на расстоянии 5 мм от передней части ствола³⁴. Уровни избыточного давления в воздухе ниже 15 фунтов на квадратный дюйм и выше 50 фунтов на квадратный дюйм демонстрируют большую изменчивость интенсивности. Полное отображение выходного давления системы (psi) в зависимости от входного давления (psi), расстояния от барабана (cm) и времени (ms) см. на рисунке 2 Hines-Beard et ^al.34. Используйте сжатый азот вместо сжатого воздуха для надежного получения уровня избыточного давления воздуха выше 50 фунтов на квадратный дюйм с помощью этой системы.

3. Подготовка животных и воздействие воздуха под избыточным давлением

1. Обезболить мышь изофлураном в индукционной камере с 1,5-3^%30,31,32,33 изофлураном в кислороде до полного успокоения.
   1. Подтвердите обезболивание, оценив отсутствие реакции на защемление пальца ноги.
   2. Закрепите мышь во внутреннем держателе животного так, чтобы ее голова и верхняя часть задних плеч были открыты через прямоугольное отверстие, в то время как спинные и нижние задние конечности оставались защищенными.
   3. Поддержите голову мыши с помощью подушки, прикрепленной к неповрежденному нижнему сегменту внутреннего держателя для животных.
   4. Закрепите мышь, наложив хирургическую ленту на верхнюю часть задних плеч.
   5. Вставьте внутренний держатель животного во внешний держатель для животных.
   6. Открыта вторичная анестезиологическая линия для доставки изофлурана внутрь держателя для животных.
   7. Поместите дополнительную подушку на конец держателя для животных, чтобы предотвратить утечку анестетика из трубки и предотвратить движение мыши во время воздействия воздуха под избыточным давлением.
2. Подача воздуха под избыточным давлением
   1. Совместите внешнее круглое отверстие держателя животного диаметром 4 мм непосредственно над левым глазом мыши.
   2. Расположите держатель для животных с помощью ручек управления на x-y столе так, чтобы его отверстие совпадало со стволом пейнтбольного ружья, а внешняя поверхность находилась на расстоянии 5 мм от конца ствола.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте расстояние животного от конца бочки, чтобы изменить уровень избыточного давления воздуха (psi) и форму. Переместите животное подальше от бочки, чтобы снизить уровень избыточного давления воздуха и создать более диффузную воздушную волну избыточного давления.
   3. Инициируйте последовательность сжатия воздуха под избыточным давлением, чтобы вызвать ITON:
      1. Подайте два потока воздуха с избыточным давлением 15 фунтов на квадратный дюйм с интервалом 0,5 с, повторяя их ежедневно в течение 3 дней 29,30,31,32.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Аналогичный ITON может быть вызван подачей трех последовательных импульсов воздуха с избыточным давлением 15 фунтов на квадратный дюйм, разделенных интервалом^{0,5 с 23}. Степень ИТОН в результате подачи шести последовательных пакетов воздуха избыточного давления 15 фунтов на квадратный дюйм, разделенных интервалом 0,5 с, показана здесь в разделе «Репрезентативные результаты».
      2. Подвергните мышей воздействию шума воздуха избыточного давления, но не самого воздуха избыточного давления, повернув держатель животного так, чтобы отверстие больше не было обращено к стволу, и заблокируйте воздух картонным щитом.
3. Восстановление мыши
   1. Дайте мышам восстановиться после анестезии.
      1. Введите глазные капли-лубриканты (см. Таблицу материалов), чтобы предотвратить высыхание глаз от анестезии.
      2. Обеспечьте тепло с помощью регулируемой опоры для нагрева (см. Таблицу материалов).
   2. Визуально наблюдайте за мышами до тех пор, пока они не сохранят прямую осанку и не начнут нормально ходить. Позвольте им быть в компании своих товарищей по клетке.
   3. Обеспечьте всех мышей, подвергшихся воздействию воздуха под избыточным давлением, гелевым кормом для восстановления (см. Таблицу материалов) в течение первых 3 дней после травмы, чтобы предотвратить потерю веса.

4. Сбор и обработка тканей

1. Усыпьте мышей путем внутрибрюшинной инъекции рабочего раствора Авертина.
   1. Приготовьте авертиновый бульон, смешав 10 г 2,2,2,-трибромэтанола (см. Таблицу материалов) с 10 мл 1-пентанола (см. Таблицу материалов). Хранить в темноте при температуре 4 °C.
   2. Приготовьте рабочий раствор Avertin, смешав 1,25 мл Avertin Stock, 45 мл воды двойной дистилляции и 5 мл 10x PBS (см. Таблицу материалов) в пробирке объемом 50 мл. Фильтруйте, стерилизуйте смесь и храните в темноте при температуре 4 °C.
2. Транскардиально перфузируйте мышей 4% параформальдегидом (см. Таблицу материалов) в 1x PBS (см. Таблицу материалов).
3. Энуклеируйте глаз, подвергшийся воздействию воздуха под избыточным давлением, с помощью тонких щипцов (см. Таблицу материалов) и ножниц (см. Таблицу материалов), обеспечивая сохранение зрительного нерва (ВКЛ).
4. Соберите ON вместе с энуклеированной тканью глаза для дальнейшего анализа.
5. Осмикат ON ткани.
   1. Постфикс ON ткань на ночь в 4% параформальдегиде и 2% глутаральдегиде (см. Таблицу материалов) в 1x PBS. При работе с тканью, которая не была перфузирована (как в пункте 4.2), постфикс на 5 дней вместо ночи.
   2. Перенесите салфетку ON на 12- или 24-луночный планшет (см. Таблицу материалов) с 1x PBS с помощью кисти (см. Таблицу материалов) или острой деревянной палочки.
   3. В вытяжном шкафу замените 1xPBS на 2% тетраоксид осмия (см. Таблицу материалов) в 0,2 М какодилатном буфере (рецепт общедоступен на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) с помощью передаточной пипетки. Выдерживать на льду в течение 2 ч.
   4. Выполните три промывки с 1x PBS
      1. Утилизируйте отходы осмия надлежащим образом.
      2. Оставьте тарелку в вытяжном шкафу на две ночи после третьей промывки PBS.
6. Обезвоживайте ткани ON в серии градуированного этанола.
   1. Перенесите нервы в новую тарелку с 50% этанолом и инкубируйте в течение 30 минут.
   2. Замените на 70% этанол на 30 минут.
   3. Замените 95% этанолом на 30 минут.
   4. Замените на 100% этанол на 30 минут.
7. Заложите ткань ON в эпон.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рецепт Epon находится в открытом доступе на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; Материалы, перечисленные в рецепте, см. в Таблице материалов .
   1. День 1: Переложите салфетку во флакон объемом 2 мл с оксидом пропилена (см. Таблицу материалов)/100% этанолом (1:1) и встряхните в течение 30 минут при комнатной температуре. Замените чистым оксидом пропилена и встряхивайте в течение 15 минут, повторив один раз. Замените на оксид пропилена/эпон (1:1) и встряхните на ночь в холодной комнате.
   2. День 2: Перенесите ткань в 12- или 24-луночный планшет со 100% эпон и встряхните в течение 4 часов при комнатной температуре. Замените на свежий 100% эпон и выдержите в течение ночи при комнатной температуре в вакууме.
   3. День 3: Повторите инкубацию эпона, как и на день 2.
   4. День 4: Перенесите ткань в плоскую форму со 100% эпоном, переориентируйте ткань и поместите в духовку при температуре 60 °C на 48 часов.
8. Раздел О ткани.
   1. Обрежьте формочки под рассекающим скопом в двойную пирамиду с нервом в центре.
   2. Соберите сечения толщиной 700 нм с помощью ультрамикротома и алмазного ножа (см. Таблицу материалов).
   3. Соберите срезы на заряженных предметных стеклах микроскопа белого цвета с использованием дистиллированной воды.
   4. Сушите горки в духовке при температуре 60 °C до испарения воды. Охладите при комнатной температуре.
9. Окрашивание на ткани.
   1. Погрузите предметные стекла в 1% парафенилендиамин (PPD) (см. Таблицу материалов) в смесь метанола и 2-пропанола в соотношении 1:1 на 28 минут.
   2. Промойте предметные стекла в двух последовательных смесях метанола 1:1 (см. Таблицу материалов) и 2-пропанола (см. Таблицу материалов) в течение 1 минуты каждая.
   3. Промойте предметные стекла в 100% этаноле в течение 1 минуты и дайте высохнуть на воздухе.
   4. Поместите предметные стекла во влажную коробку и накройте секции 1% толуидинового синего (см. Таблицу материалов) с помощью переводной пипетки.
   5. Выдерживать в духовке при температуре 60 °C в течение 20 минут.
   6. Промойте предметные стекла двойной дистиллированной водой и дайте высохнуть на воздухе.
10. Крепление и нанесение изображения на ткань.
    1. Задвижки покровного стекла с помощью монтажного носителя (см. Таблицу способов), удаляя излишки носителя.
    2. Дайте предметным стеклам высохнуть в течение ночи.
    3. Изображения поперечных срезов с помощью светлопольной микроскопии со 100-кратным масляным иммерсионным объективом.
11. Встраивание, разрез и иммуногистохимическое окрашивание ткани сетчатки.
    1. Закрепить целую ткань глаза в 4% параформальдегиде в течение 2-4 ч.
    2. Криозащита всей ткани глаза в 30% сахарозе (см. Таблицу материалов в 1x PBS на ночь при 4 °C.
    3. Внедрите ткани глаза в замораживающую среду (см. Таблицу материалов).
    4. Соберите срезы сетчатки толщиной 10 мкм на криостате и закрепите срезы на предметных стеклах микроскопа из заряженного белого стекла (см. Таблицу материалов).
    5. Промойте предметные стекла в 1x PBS и инкубируйте в блокирующем буфере (5% Triton X-100 и 2% бычий сывороточный альбумин (BSA) (см. Таблицу материалов) в 1x PBS) с 5% нормальной ослиной сывороткой (NDS) (см. Таблицу материалов) при комнатной температуре в течение 30 минут.
    6. Инкубируйте предметные стекла в течение ночи при 4 °C (или при комнатной температуре в течение 4 ч) в первичном антителе (см. Таблицу материалов) в 0,5% Triton X-100 (см. Таблицу материалов) в 1xPBS (PBT).
    7. Промыть предметные стекла в PBT и инкубировать во вторичном антителе (см. Таблицу материалов) в блокирующем буфере с 5% NDS.
    8. Вымойте предметные стекла в PBT, нанесите монтажный носитель с помощью DAPI (см. Таблицу материалов), покройте и запечатайте лаком для ногтей.
    9. Изображение слайдирует на эпифлуоресцентном микроскопе.
    10. При количественном определении интенсивности флуоресценции убедитесь, что изображения получены из одной и той же области сетчатки с одинаковыми настройками увеличения, усиления и экспозиции.
12. Рассчитывайте НА аксоны.
    1. Вручную подсчитайте количество аксонов с помощью программного обеспечения для анализа изображений (см. Таблицу материалов), отведя выборку из 20% от общей площади поперечного сечения нерва с помощью фиксированного наложения сетки для оценки плотности аксонов (аксоны/мм²).
    2. Измерьте площадь поперечного сечения ВКЛ.
       1. Используйте функцию «Установить масштаб », чтобы задать пиксели/микроны для объектива, используемого для изображения.
       2. С помощью инструмента «Выделение многоугольника » проведите контур вдоль миелиновой оболочки зрительного нерва, исключая сосудистую сеть.
       3. Измерьте площадь ВКЛ с помощью функции «Измерить ».
       4. Определите 20% от общей площади, умножив измеренную площадь на 0,2.
    3. Наложите неподвижную сетку на поперечное сечение ON.
       1. Скачайте плагин Counting Array.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Этот плагин находится в открытом доступе на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Откройте плагин Counting Array, чтобы наложить фиксированную сетку поверх поперечного сечения, состоящую из 9 равномерно расположенных квадратов в форме знака плюс.
       3. Отредактируйте площадь для каждой из 9 областей, разделив 20% от общей площади поперечного сечения ВКЛ (рассчитанной на шаге 4.6.2.4) на 9.
       4. Центрируйте фиксированную сетку так, чтобы центр знака «плюс» был центрирован в середине поперечного сечения ON.
    4. Посчитайте живые и вырождающиеся аксоны отдельно.
       1. Загрузите и откройте подключаемый модуль Cell Counter.
          ПРИМЕЧАНИЕ: Этот плагин находится в открытом доступе на GitHub. Заинтересованные читатели могут получить доступ к репозиторию по адресу https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
       2. Для каждой из 9 областей подсчитайте количество живых и дегенеративных профилей аксонов отдельно, визуализировав состояние миелиновой оболочки. Убедитесь, что количественная оценка аксонов выполняется во время слепой от экспериментальной группы животного, чтобы избежать систематической ошибки.
       3. Что касается живых аксонов, ищите те, у которых миелиновая оболочка выглядит неповрежденной, равномерно окрашенной и плавно и равномерно обведенной вокруг аксона.
       4. Что касается дегенеративных аксонов, ищите те, у которых миелиновая оболочка утолщена, луковичная или коллапсирующая.
       5. Если аксон частично обрезан наложенной сеткой, включайте его в подсчет аксона только в том случае, если виден просвет.
       6. Убедитесь, что продолговатые аксоны случайно не подсчитываются более одного раза, и не путайте мусор или пыль с дегенеративным профилем аксона.
    5. Выполнение статистического анализа для проверки существенных различий в среднем количестве аксонов между группами. Убедитесь, что в каждую группу включено не менее четырех ОН, чтобы учесть нормальную вариабельность, наблюдаемую в предыдущих анализах.
       1. Проведите t-критерий независимых выборок (также известный как t-критерий Стьюдента для независимых выборок) для оценки существенных различий между средними двумя независимыми группами.
       2. Выполните непараметрическую альтернативу, U-критерий Манна-Уитни, если условия для t-критерия независимых выборок не могут быть выполнены (т. е. если данные не распределены нормально или размеры выборки слишком малы).

Результаты

С помощью описанной здесь системы производства воздуха с избыточным давлением непрямая травматическая оптическая нейропатия (ITON) была вызвана путем воздействия на левый глаз взрослых (3-месячных) мышей мужского пола C57Bl/6 (n = 4) шестью последовательными всплесками воздуха с избыточным давлением 15 фунтов на квадратный дюйм, разделенными интервалом 0,5 с. Фиктивных животных (n = 8; данные взяты из Vest et ^al.33) обезболивали, поместили в держатель для животных и подвергли воздействию звука, но не воздуха под избыточным давлением.

Проксимальные зрительные нервы фиктивных животных (рис. 3А) выглядели здоровыми с плотно упакованными и одинаково большими аксонами, окруженными глиальными клетками с нормальной морфологией и распределением. Для сравнения, проксимальные зрительные нервы мышей, подвергшихся воздействию ITON (т.е. 6 последовательных всплесков воздуха с избыточным давлением 15 фунтов на квадратный дюйм, разделенных интервалом 0,5 с) (рис. 3B), по-видимому, дегенерировали с признаками потери аксонов, такими как увеличенное расстояние между оставшимися аксонами, признаки дегенерации аксонов, включая отек, неровности формы аксонов и разрушение миелиновой оболочки аксонов. и признаки глиоза, включая гипертрофию и гиперплазию глиальных клеток. U-тесты Манна-Уитни подтвердили значительную разницу в общем количестве аксонов (p = 0,0040) (рисунок 3C) и дегенеративных профилях (p = 0,0028) (рисунок 3D) между ITON и фиктивными мышами. Эти результаты свидетельствуют о том, что ITON значительно уменьшает общее количество аксонов и значительно увеличивает дегенеративные профили. U-тесты Манна-Уитни были проведены потому, что данные для группы ITON не имели достаточно большого размера выборки для t-критерия независимых выборок.

Иммуногистохимическое окрашивание поперечных сечений сетчатки анти-Iba1 (см. таблицу материалов), маркер микроглии (первичных иммунных клеток центральной нервной системы), проводили на мышах как фиктивных (рис. 4А), так и ИТОН (рис. 4В). Окрашивание показало, что микроглия находилась в состоянии покоя у всех мышей, характеризуясь мелкими клеточными телами с длинными, тонкими и сильно разветвленными отростками. Примечательно, что у мышей ITON было отмечено повышенное количество микроглии (рис. 4B), что свидетельствует о пролиферации микроглии в ответ на травму. Кроме того, у мышей ITON наблюдалось аномальное распространение микроглии во внешний ядерный слой (ONL), где находятся тела фоторецепторных клеток (рис. 4B). Это контрастирует с фиктивными животными (рис. 4A), где микроглия была локализована в слое ганглиозных клеток (GCL), внутреннем плексиформном слое (IPL), внутреннем ядерном слое (INL) и внешнем плексиформном слое (OPL) - слоях, где микроглия обычно находится в здоровой, неповрежденной сетчатке.

Последующее иммуногистохимическое окрашивание анти-PKC-α (см. Таблицу материалов) и антисинаптофизином (см. Таблицу материалов), маркерами палочатых биполярных клеток и фоторецепторными ленточные синапсы, соответственно, выявило интактные синаптические связи как у фиктивных мышей (Рисунок 5А), так и у мышей ITON (Рисунок 5В). В частности, наблюдалось расширение и перекрытие дендритов палочковидных биполярных клеток с синаптическими окончаниями палочных фоторецепторов. Этот вывод контрастирует с ранним^{исследованием}, которое показало втягивание биполярных дендритов палочек к их телам через четыре недели после ITON от двух последовательных всплесков избыточного давления воздуха с давлением 15 фунтов на квадратный дюйм (с интервалом 0,5 секунды) один раз в день в течение 3 дней. Это расхождение может быть связано с разными временными точками сбора тканей между двумя исследованиями. Текущие образцы были собраны через 2 недели после ITON по сравнению с 4 неделями после ITON в более раннем исследовании. Несмотря на то, что в данном анализе синаптопатия не была обнаружена, мы отметили распространение процессов микроглии в ONL (рис. 4B), где расположены тела фоторецепторных клеток. Это наблюдение позволяет предположить, что нарушение синаптических связей между биполярными клетками и фоторецепторами может возникнуть как вторичный эффект повреждения, в то время как потеря аксонов, дегенерация аксонов и глиоз являются первичными эффектами повреждения.

Рисунок 1: Система при очаговом поражении центральной нервной системы с закрытой системой. Пунктирные прямоугольники на верхнем изображении увеличены и показаны как B, C и A на двух изображениях ниже (как обозначено белыми стрелками). (A) Изготовленный на заказ 1,5-дюймовый ствол без остекления (I) на конце пейнтбольного ружья. (B) Регулятор давления со снятой направляющей крышкой для обнажения регулировочного винта (II). (C) Загрузочная горловина со снятым самотечным загрузчиком и установленной крышкой подающей горловины (III). (D) Базовая платформа, состоящая из куска древесноволокнистой плиты размером 1,5 x 1,5 фута, приподнятой над более крупным куском древесноволокнистой плиты размером 2,5 x 1,5 фута. (E) Баллон со сжатым воздухом, подключенный к регулятору давления пейнтбольного пистолета и закрепленный на платформе из ДВП с помощью прочного ремня. (F)x-y таблица позиционирования животных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Специальный держатель для животных для фокусной подачи воздуха под избыточным давлением. (A) Внутри держателя для животного, состоящего из узкой трубки из ПВХ с отверстием прямоугольной формы (3 x 5 см) для обнажения головы животного и верхней части задних плеч. (B) Снаружи держателя для животного, состоящего из более широкой трубки из ПВХ, в которую вставляется более узкая трубка из ПВХ, защищая все тело животного, за исключением открытых тканей в пределах отверстия для экспонирования. (C) Экспозиционная апертура для фокальной подачи воздуха избыточного давления к интересующему месту повреждения ЦНС. (D) Преобразователь давления для калибровки выходного давления системы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: ИТОН из-за очаговой подачи воздуха избыточного давления. (А,Б) Репрезентативные светлопольные микрофотографии поперечных сечений проксимального зрительного нерва из (А) симуляции и (В) ИТОНА. (C) Количественная оценка общего количества аксонов. (D) Количественная оценка профилей дегенеративных аксонов. n = 4 для ITON. n = 9 для бутафории. Данные о количестве аксонов в фиктивной группе были взяты из Vest et ^al.33. **p < 0,005. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение. Масштабные линейки = 20 μм. Аббревиатура: ITON = непрямая травматическая нейропатия зрительного нерва. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Аномальная пролиферация микроглии и миграция в ONL из-за системно-индуцированного ITON. (A,B) Репрезентативные флуоресцентные микрофотографии поперечных срезов сетчатки с анти-Iba1-маркировкой микроглии (красной) от (A) фиктивных и (B) ITON животных. Масштабные линейки = 100 μм. Сокращения: ITON = непрямая травматическая нейропатия зрительного нерва; GCL = слой ганглиозных клеток, INL = внутренний ядерный слой, ONL = внешний ядерный слой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Ранняя персеверация синаптических связей между палочковидными биполярными клетками и фоторецепторами из-за системно-индуцированного ИТОНА, несмотря на потенциал замедленной синаптопатии. (A,B) Репрезентативные флуоресцентные микрофотографии поперечных срезов сетчатки с антисинаптофизиновым мечением фоторецепторных ленточных синапсов (красный) и анти-PKC-α мечением палочек биполярных клеток (зеленый) из (A) фиктивных и (B)) ITON животные. Масштабные линейки = 100 μм. Сокращения: ITON = непрямая травматическая нейропатия зрительного нерва; PKC = протеинкиназа С. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Эта специальная система избыточного давления воздуха является полезным инструментом для изучения повреждений закрытой системы ЦНС на моделях мышей. Репрезентативные результаты эксперимента демонстрируют, что фокальная подача воздуха под избыточным давлением с использованием этой системы может эффективно индуцировать ITON, что приводит к значительной потере аксонов и дегенерации. Это подчеркивает способность системы производить точное и воспроизводимое повреждение ЦНС.

Одним из основных преимуществ этой системы является ее настраиваемость для вызова целого ряда повреждений ЦНС. Тяжесть травмы может быть скорректирована путем изменения общего выходного давления системы, расстояния от животного до конца бочки с помощью позиционирования x-y, размера и формы экспозиционной апертуры, количества контактов с воздухом избыточного давления и интервала между экспозициями. Кроме того, расположение повреждения ЦНС можно отрегулировать, изменив расположение апертуры экспозиции в держателе для животных. Такая универсальность позволила системе получить спектр повреждений ЦНС в закрытой системе на моделях мышей. Первоначально система использовалась для моделирования повреждений закрытого глазного яблока, уделяя особое внимание повреждениям переднего и заднего полюсов и связанным с ними дефицитам^34,36, включая влияние реакции иммунной системы³⁷, специфические для штамма исходы³⁸ и эффективность нейропротекторных агентов³⁹. В конечном счете, это приложение было расширено для оценки последствий повторных воздействий, направленных на глаза, для моделирования непрямой травматической оптической нейропатии (ITON)³⁰ и изучения влияния количества и интервала между повторными^{воздействиями33}. С тех пор применение системы расширилось и стало моделировать закрытую головную легкую черепно-мозговую травму (ЧМТ) с помощью воздействия на голову^40,41 и закрытое повреждение спинного мозга (ТСМ) с помощью воздействия на тыльной стороне⁴², что подчеркивает адаптивность и универсальность устройства в изучении различных областей повреждения ЦНС.

При использовании данной системы критически важно принять меры по минимизации вариабельности исходов травм для обеспечения воспроизводимости и надежности экспериментальных результатов. Ключевые меры включают калибровку уровней выходного давления системы до и после каждой серии из трех воздействий для обеспечения стабильной подачи давления. Несмотря на то, что вариативность невелика при работе системы в диапазоне от 15 до 50 фунтов на квадратный дюйм при использовании сжатого воздуха³⁴, последовательная калибровка помогает обнаруживать непредвиденные ошибки, такие как низкий уровень заряда батареи или низкий уровень воздуха. Кроме того, расположите каждое животное на одинаковом расстоянии от конца бочки, чтобы обеспечить постоянную величину избыточного давления, поскольку интенсивность волны давления уменьшается с расстоянием. Равномерное позиционирование также гарантирует, что на каждое животное воздействует одна и та же часть эфира. Кроме того, равномерное закрепление животных внутри держателя обеспечивает постоянное воздействие на интересующую ткань, особенно в моделях повторного воздействия, когда существует риск перемещения. Наконец, однородность в возрасте, поле и генетическом фоне животных имеет решающее значение, поскольку эти факторы влияют на реакцию на травму. Например, в предыдущих исследованиях с использованием этой системы сравнивалось воздействие воздуха избыточного давления, направленного на глаза, на различные линии мышей, что выявило значительные различия в реакции на травму между мышами C57Bl/6J³⁶, DBA/2J³⁷ и Balb/c³⁸ . У мышей DBA/2J и Balb/c наблюдались более тяжелые патологии передних полюсов, большее повреждение сетчатки, более высокий окислительный стресс и более выраженные нейровоспалительные реакции по сравнению с мышами C57Bl/6J с мышами Balb/^c, демонстрирующими особенно устойчивые и длительные профили травм.

Устранение неполадок в системе
Если значения давления нехарактерно малы для данной настройки манометра, нажмите на спусковой крючок 5-10 раз, позволяя воздуху пройти через систему и регулятору отрегулироваться на новую настройку. В воздушном баке не должно быть утечек. Уплотнительное кольцо на воздушном баке не должно быть повреждено или изношено, в воздушном баке должно быть достаточно воздуха, а батарея пушки не должна быть разряжена. Стол x-y не должен был смещаться в сторону от своего обычного положения от торца ствола, а отверстие для воздействия избыточного давления воздуха должно быть выровнено со стволом пистолета, а не закупоривать его. Регулятор должен быть плотно закреплен на рукоятке пистолета. Если значения давления слишком низкие, несмотря на использование самой высокой настройки манометра, манометр не должен превышать 200 фунтов на квадратный дюйм, а настройка скорости на пистолете должна быть отрегулирована до максимальной настройки. Если настройки давления непостоянны (например, высокое, а затем низкое), убедитесь, что в воздушном резервуаре достаточно воздуха, регулятор плотно прикреплен к рукоятке пистолета, в воздушном резервуаре нет утечек и что он плотно завинчен, а уплотнительное кольцо на воздушном баллоне не повреждено и не изношено.

Чтобы всесторонне понять все возможности этой системы, важно признать ее ограничения. Имитация реальных сценариев в лабораторных условиях по-прежнему остается сложной задачей. Хотя эта система генерирует воздух под избыточным давлением, она не воспроизводит сложную динамику взрывного события, такую как изменение градиентов давления и температуры, наличие обломков и отраженных волн, а также многофазность. Кроме того, она не имитирует форму волны Фридлендера («первичная взрывная волна»), которая характеризуется резким, почти мгновенным пиком давления, за которым следует быстрое экспоненциальное затухание, которое падает ниже давления окружающей среды, прежде чем вернуться к исходной линии⁴³. Скорее, форма волны, создаваемая этой системой, представляет собой более простой, более симметричный профиль, в котором происходит более постепенное повышение и понижение давления без выраженной отрицательной фазы (см. рисунок 2C в Hines-Beard et ^al.34). Несколько выгодно, что эта форма волны сочетает в себе элементы как взрывных, так и тупых травм. Колоколообразный «импульс давления» обеспечивает постоянный удар от избыточного давления, сродни удару «воздушной стены» по объекту. Тем не менее, воздух под избыточным давлением, подаваемый волной, также является ключевым характерным аспектом взрывных травм. Некоторые могут возразить, что, хотя эта форма волны включает в себя аспекты обоих типов травм, она не полностью отражает сложность любого из них. Тем не менее, этот последовательный и воспроизводимый «импульс давления» идеально подходит для контролируемых экспериментов в лабораторных условиях по изучению фокального повреждения закрытой системы ЦНС. Ранее мы уже демонстрировали очаговый характер травмы. Например, воздействие на один глаз не вызывает повреждения первичного эпителия носа или головного мозга⁴⁴. Также при направлении в сторону головы мыши поражается небольшой участок мозга⁴⁵. Наконец, энергия воздуха избыточного давления из этой системы на уровне давления, используемом для ITON, не воздействует на мышь, если ее не повторять с коротким интервалом^{времени 33}. Таким образом, давление не причиняет вреда и, следовательно, не воспроизводит силу со стороны струи. Кроме того, даже при многократном воздействии на глаз воздуха под избыточным давлением не наблюдалось никакого влияния на передние структуры глаза³³. Значительная дегенерация зрительного нерва и потеря зрения происходили только при повторном воздействии с интервалом между контактами менее 1 мин³³.

По сравнению с другими лабораторными устройствами для создания повреждений ЦНС в закрытой системе, эта система обладает уникальными преимуществами. Он может подавать последовательные порывы воздуха избыточного давления в быстрой последовательности (с интервалом 0,5 с)³³, имитируя условия в профессиональных средах с высоким риском, где быстрое воздействие взрыва является распространенной опасностью. Например, военнослужащие, как в учебных, так и в боевых сценариях, используют множество автоматического огнестрельного оружия, способного вести быструю многократную стрельбу, включая автоматические винтовки (например, M16, AK-47), пулеметы (например, M2 калибра .50), пулеметы Гатлинга и миниганы. К другим более медленным, но повторяющимся видам оружия, используемым военнослужащими, относятся артиллерия, минометы, гранаты и самодельные взрывные устройства (СВУ). Рабочие, занимающиеся сносом зданий, и горняки, участвующие в взрывных работах по разрушению породы и добыче полезных ископаемых, также подвергаются последовательным взрывам в быстрой последовательности. Наконец, строители, использующие пневматические инструменты, сваебойные машины или другое тяжелое оборудование, которое генерирует мощные ударные силы, могут испытывать быстрые повторяющиеся удары, имитирующие воздействие взрывной волны. Примечательно, что быстрая подача воздуха избыточного давления невозможна с помощью таких устройств, как ударные трубки, которые требуют обширной перенастройки или повторного нагнетания давления между каждым событием. В ударных трубках используются мембраны, которые лопаются для создания ударных волн, и после каждого взрыва мембрану необходимо заменить. Этот процесс требует времени, так как ударная трубка должна быть открыта, отработанная диафрагма удалена, установлена новая диафрагма, а системе дано время на сброс и восстановление давления. Таким образом, особенно для исследований, изучающих повреждение ЦНС после быстрого повторного взрывного воздействия, идеально подходит система, которая не требует обширной перенастройки или повторного давления между каждым событием.

Будущее применение этой модуляционной, удобной в использовании и экономичной системы является многообещающим. Используя свои адаптируемые и уникальные характеристики, эта система открывает несколько многообещающих направлений для будущих доклинических терапевтических исследований. Его способность подавать быстрые, последовательные всплески воздуха под избыточным давлением может быть использована для изучения кумулятивных эффектов повторного воздействия взрыва, что имеет отношение к пониманию хронической травматической энцефалопатии и других долгосрочных нейродегенеративных состояний. Кроме того, эта система может быть использована для изучения эффективности различных фармакологических вмешательств, направленных на смягчение повреждений закрытой системы ЦНС, включая время и дозирование нейропротекторных препаратов для определения оптимальных окон лечения. Кроме того, точность системы в имитации аспектов механизмов как тупой, так и взрывной травмы позволяет разрабатывать комплексные модели травм, отражающие сложную травму, полученную людьми в реальных сценариях. Это может облегчить тестирование мультимодальных методов лечения, которые направлены на общие глобальные аспекты травмы, такие как воспаление, окислительный стресс и гибель нейронов. В целом, это устройство предлагает универсальную и мощную платформу для улучшения нашего понимания повреждений закрытой системы ЦНС и разработки эффективных терапевтических вмешательств.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Pentanol	Fisher Scientific	AC160600250	Used to make Avertin solution
2,2,2-tribomoethanol	Sigma Aldrich	T48402	Used to make Avertin solution
24-well plates with lid	VWR	76520-634	24-well plate
2-Propanol	Fisher Scientific	A451-1
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module	National Instruments	NI-9237	DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA)	Research Products International	A30075	BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal)	Abcam	ab5076	Marker for microglia, Used at 1:500 concentration
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal)	Abcam	ab8049	Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502	Electron Microscopy Sciences	10900
Cacodylate buffer	Electron Microscopy Sciences	11652
Charcoal Filter Canister	E-Z Systems	EZ-258	Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76A	Clear H2O	72-07-5022	Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ Chassis	National Instruments	USB-9162	DAQ chassis
Compressed Air	A-L Gas	GSMCA300	Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G	Southern Biotech		Mounting media with DAPI
Diamond knife	Micro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc.		For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-11058	Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21203	Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	A-21206	Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration
Donkey Serum	Sigma Aldrich	D9662	NDS
Dumont #3 Forceps	Fine Science Tools	11231-30	Fine forceps for whole eye enucleation
Ethanol (200 proof)	KOPTEC (Supplier: VWR)	89125-188	Ethanol
Fluoromount-G	Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)	00-4958-02	Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic Gel	Covetrus	72359	Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia
Glutaraldehyde	Electron Microscopy Sciences	16200
Graduated Cylinder 1000 mL	Fisher Scientific	08-572G
Graduated Cylinder 250 mL	Fisher Scientific	08-572E
Graduated Cylinder 500 mL	Fisher Scientific	08-572F
Heating pad	Braintree Scientific	AP-R 26E	Controlled heating support
High Pressure Fill Station	Ninja Paintball	HPFSV2	Used to refill pressurized air tank
ImageJ	National Institutes of Health		Image analysis software
Invert Mini	Empire Paintball		Paintball gun
Isoflurane	Covetrus	29405	Inhalation anesthetic
Isoflurane Vaporizer	VetEquip	901806	Animal anesthesia
Masterflex Pump	Cole-Parmer		Used for animal perfusion
Methanol	Sigma Aldrich	322415-2L
Microscope Slides	Globe Scientific	1358W	White glass microscope slides
NI LabVIEW	National Instruments		Software to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX)	National Instruments		Software to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers	National Instruments		Driver for interacing with DAQ system
Nikon Eclipse Ni-E microscope	Nikon Instruments
Osmium tetroxide 2%	Electron Microscopy Sciences	19152
Paraformaldehyde 32%	Electron Microscopy Sciences	15714-S	PFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine	Sigma Aldrich	P6001
PBS (10x), pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	70011044	PBS diluted down to 1x
Propylene oxide	Electron Microscopy Sciences	20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated Tank	Ninja Paintball		Pressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mL	Fisher Scientific	06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mL	Fisher Scientific	06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mL	Fisher Scientific	06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal)	Abcam	ab32376	Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration
Resin 812	Electron Microscopy Sciences	14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi	Honeywell	060-0708-10TJG	Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Sucrose	Sigma Aldrich	S5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi	Honeywell		Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements
Syringe/Needle Combo	Covetrus	60728	Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT Compound	Fisher Scientific	23-730-571	Freezing medium
Toluidine blue	Fisher Scientific	BP107-10
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787
UniSlide XY Table	Velmex	AXY40 Series	XY positioning table
University Brush - Series 233- Round, Size 000	Winsor and Newton		Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting Edge	Fine Science Tools	15000-08	Scissors for whole eye enucleation
Virtual Instrument	National Instruments		Digital tool for data acquisition software