Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתאר מערכת אוויר מותאמת אישית בלחץ יתר שנועדה לגרום לפציעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) במערכת סגורה בעכברים, כולל טראומות עיניים, מוח וחוט השדרה. מטרת פרוטוקול זה היא לספק מסגרת לחוקרים להתאים ולהרחיב בקלות את המערכת למחקרי הטראומה הייחודיים שלהם במערכת העצבים המרכזית.

Abstract

השכיחות של פגיעות במערכת העצבים המרכזית (CNS) במערכת סגורה מדגישה את הצורך בהבנה משופרת של טראומות אלה כדי לשפר התערבויות הגנתיות וטיפוליות. חיוניים למחקר זה הם מודלים של בעלי חיים המשכפלים פציעות במערכת העצבים המרכזית במערכת סגורה. בהקשר זה, מערכת אוויר מותאמת אישית בלחץ יתר תוכננה לשחזר מגוון של פגיעות CNS במערכת סגורה במודלים של מורין, כולל טראומה של עיניים, מוח וחוט השדרה. עד כה, המערכת שימשה לניהול אוויר בלחץ יתר המכוון לעיניים, לראש או לעמוד השדרה כדי למדל פגיעה במוט הקדמי בעין, נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה (ITON), פגיעה מוחית טראומטית מוקדית ופגיעה בעמוד השדרה. מאמר זה מספק פרוטוקול מפורט המתאר את תכנון המערכת ותפעולה ומשתף בתוצאות מייצגות המוכיחות את יעילותה. המסגרת האיתנה המוצגת כאן מספקת בסיס חזק למחקר מתמשך בטראומה במערכת העצבים המרכזית. על ידי מינוף התכונות הגמישות של המערכת, החוקרים יכולים לשנות ולשלוט בזהירות במיקום, בחומרה ובתזמון של פציעות. זה מאפשר השוואה מקיפה של מנגנונים מולקולריים ויעילות טיפולית על פני פציעות CNS מרובות במערכת סגורה.

Introduction

פגיעות במערכת העצבים המרכזית הסגורה (CNS) הן פציעות הנגרמות על ידי נזק למוח או לחוט השדרה מבלי לגרום לשבר בגולגולת או בעמוד השדרה. פגיעות אלה כוללות פגיעה מוחית טראומטית (TBI) ופגיעה בעמוד השדרה (SCI) ויכולות להתרחש ממגוון אירועים, כולל פציעות כוח קהות (למשל, נפילות, פציעות ספורט, תאונות דרכים) ופיצוצים נפיצים. פציעות CNS במערכת סגורה נחשבות בדרך כלל פחות חמורות בהשוואה לפציעות חודרות במערכת העצבים המרכזית, אך הן מתרחשות לעתים קרובות יותר. עם זאת, בדומה לפציעות חודרות, פציעות CNS במערכת סגורה עלולות לגרום לבעיות בריאותיות ארוכות טווח ומתקדמות, במיוחד לאחר התרחשויות חוזרות ונשנות 1,2,3,4,5,6. באופן מדאיג, ראיות חדשות מצביעות על כך שאפילו פגיעות תת-קליניות במערכת העצבים המרכזית, אשר נופלות מתחת לקריטריונים האבחנתיים עבור TBI או SCI לאחר מופע יחיד 7,8,9,10,11,12,13, עשויות להתפתח למחלות נוירודגנרטיביות כרוניות לאחר פציעה חוזרת 6,14,15,16. הדבר מדגיש את הצורך הדחוף בהבנה טובה יותר של המנגנונים וההשלכות של פגיעות בודדות וחוזרות ונשנות במערכת העצבים המרכזית.  ידע כזה חיוני לשיפור גישות ההגנה והטיפול. חיוניים למאמץ זה הם מודלים של בעלי חיים המשכפלים פציעות CNS במערכת סגורה.

מודלים עכשוויים של בעלי חיים של פציעות במערכת העצבים המרכזית במערכת סגורה סייעו בקידום הבנתנו את הפתופיזיולוגיה ואת ההתערבויות ההגנתיות והטיפוליות האפשריות לטראומות אלה. מכרסמים פופולריים במיוחד בשל עלותם הנמוכה, זמינותם, יכולת המניפולציה הגנטית שלהם, קלות הטיפול, בדיקות התנהגותיות ופיזיולוגיות מבוססות היטב ושיקולים אתיים חיוביים יותר17. שיטות נפוצות לגרימת TBI במערכת סגורה במכרסמים כוללות התקני ירידה במשקל18,19, התקני השפעה קורטיקלית מבוקרת (CCI)20, ושפופרות הלם מונעות אוויר דחיסה21. עבור SCI, מודלים של טראומה קהה דורשים בדרך כלל למינקטומיה22,23 או טכניקות כירורגיות אחרות24 כדי לגשת ישירות לחוט השדרה או לחלל האפידורלי. עם זאת, מודלים של פגיעות פיצוץ SCI בגוף סגור פותחו באמצעות צינורות הלם מונעי אוויר דחיסה 25. למרות מתן תובנות חשובות, לכל אחד מהמודלים הללו יש מגבלות ייחודיות. מודלים של ירידה במשקל יכולים להיות בעלי שונות גבוהה ושליטה מוגבלת על מיקום הפציעה וחומרתה, מה שמייצר חששות ניסיוניים ואתיים לגרימת פציעה חמורה ובלתי מבוקרת26. מכשירי CCI מציעים דיוק אך דורשים הכשרה להפעלה, עשויים לכלול קרניוטומיה, ויכולים לסבול משונות מכנית המשפיעה על יכולת השחזור27. צינורות הלם הם בדרך כלל פחות פולשניים אך יכולים להיות קשים להשגה, מורכבים להקמה ולתפעול, ויכולים ליצור תנאי פציעה לא מציאותיים ומשתנים מאוד עקב גורמים סביבתיים, השתקפויות גלים ואינטראקציות לחץ מורכבות28.

כדי לחקור טוב יותר את המנגנונים וההשפעות של פציעות CNS בודדות וחוזרות ונשנות במערכת סגורה והטיפולים בהן, מאמר זה מציג שיטה מודולרית, ידידותית למשתמש, חסכונית ולא פולשנית. המטרה העיקרית של גישה זו היא לאפשר בקרה מדויקת ושינוי גמיש של פרמטרים של פציעה, כולל מיקום, חומרה ותזמון. כדי לתמוך במטרה זו, כתב יד זה מספק פרוטוקול מפורט לבנייה, כיול ופתרון בעיות של מערכת אוויר בלחץ יתר, המתייחס לחלק מהמגבלות של מכשירי פגיעה CNS קיימים במערכת סגורה. מערכת זו לא רק מציעה יחס עלות-תועלת וזמן התקנה מינימלי, אלא גם רב-תכליתית ביותר, המספקת תוצאות עקביות וניתנות לשחזור תוך מזעור חששות אתיים ומקסום הרלוונטיות הקלינית. בנוסף, מתוארת יכולתה של המערכת לייצר מגוון פציעות CNS במערכת סגורה במודלים של מערכת העצבים המרכזית, יחד עם היישומים הפוטנציאליים שלה במחקרים עתידיים. יש לציין כי מטרתו של כתב יד זה היא לספק מסגרת המאפשרת לחוקרים לרכוש, להתאים ולהרחיב בקלות מערכת זו לצרכיהם הספציפיים, ובכך לקדם את המחקר המתמשך בתחום הטראומה במערכת העצבים המרכזית. כמו כן מוצגות תוצאות מייצגות המוכיחות את יעילות המערכת בגרימת טראומה אקסונלית.

Protocol

כל ההליכים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים שלאוניברסיטת ונדרבילט (IACUC) ותחת הנחיות האגודה להערכה והסמכה של טיפול בחיות מעבדה (AAALAC) והאגודה לחקר ראייה ורפואת עיניים (ARVO). כל העכברים שוכנו בקבוצה ותוחזקו במחזור אור / חושך של 12 שעות וסיפקו מזון ומים עד לליביטום. 30,31,33 עכברי C57 Bl/6 בני שלושה חודשים שימשו בפרוטוקול זה.

1. בניית מערכת

  1. השג אקדח פיינטבול זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים) בעל וסת לחץ אוויר משולב.
  2. שנה את החבית (איור 1A) במידת הצורך.
    1. אם הקנה המקורי מגונן עם פתחים או נקבים לאורכו, האוויר הדחוס יכול לדלוף ולהתפזר לאוויר, מה שמקטין את רמת לחץ היציאה המרבית. החלף אותו על-ידי רכישת חבית מוצקה ללא הגנה כדי להגדיל את טווח לחץ היציאה (איור 1, I).
    2. אם החבית המקורית ארוכה ומסורבלת, קצרו אותה על ידי רכישת חבית קצרה יותר באורך מותאם אישית או באמצעות חותך צינורות או מסור.
    3. אם החבית המקורית אינה מפיקה את רמת לחץ היציאה הרצויה, שנה את הקוטר הפנימי (גודל הבור) של החבית על ידי רכישת חבית בקוטר בור בהתאמה אישית. הקטנת קוטר גודל הבור המקורי תגדיל את טווח לחץ היציאה, ולהיפך.
  3. שנה את הרגולטור (איור 1B) במידת הצורך.
    1. הסירו את מכסה ההנחיה כדי לספק גישה ישירה לבורג הכוונון (איור 1, II) אם הרגולטור המקורי מגיע עם מכסה הנחיה.
    2. החליפו את בורג שקע ראש אלן בבורג שקע ראש שטוח אם בורג הכוונון המקורי מגיע עם שקע ראש אלן.
  4. הסירו את מעמיס הזנת הכבידה הסטנדרטי (כלומר, המאגר להחזקה והזנה של כדורי צבע לתוך האקדח) ואטמו את צינור ההזנה האנכי (איור 1, III) כדי למנוע דליפת לחץ.
    1. ודא שאקדח הפיינטבול פרוק ומקור האוויר (CO2 או מיכל אוויר דחוס) מנותק לפני הסרת מעמיס הזנת הכבידה.
    2. אתרו את צוואר ההזנה (איור 1C) שאליו מחובר מטעין הזנת הכבידה. שחרר את מהדק צוואר ההזנה באמצעות הכלי המתאים.
    3. הסר את מטעין הזנת הכבידה הסטנדרטי על ידי משיכתו כלפי מעלה.
    4. הכנס מכסה צוואר הזנה או תקע כדי לאטום את הפתח. אלה זמינים בדרך כלל בחנויות פיינטבול או באינטרנט ונועדו להתאים היטב לצוואר ההזנה ולאטום אותו.
  5. הרכיבו פלטפורמה (איור 1D) עבור אקדח פיינטבול ושולחן מיקום של חיות x-y.
    1. בנה את בסיס הפלטפורמה על ידי חיתוך שתי חתיכות של סיבית בצפיפות בינונית.
      הערה: בהתאם לזמינות החומר ולהעדפתו, ניתן להשתמש גם בחומרים חלופיים (למשל, דיקט).
    2. חתכו חתיכה מרובעת קטנה יותר בגודל 1.5 x 1.5 רגל.
    3. חותכים חתיכה מלבנית גדולה יותר כדי למדוד 2.5 x 1.5 רגל.
    4. הרם ואבטח את הפלטפורמה הקטנה יותר 3.5 אינץ' מעל הפלטפורמה הגדולה יותר באמצעות שתי מקבילות 2 x 4 שניות.
  6. אבטח את אקדח הפיינטבול המותאם לפלטפורמה.
    1. הניחו את אקדח הפיינטבול על צדו על המשטח הקטן יותר, כך שקצה הקנה משתרע חצי סנטימטר מעבר לקצה.
    2. אבטח את אקדח הפיינטבול באמצעות סוגרי הרכבה או מלחציים המתאימים לקנה ולמלאי של אקדח הפיינטבול.
    3. חברו מיכל אוויר בלחץ (איור 1E; ראו טבלת חומרים) לווסת של אקדח הפיינטבול. לחלופין, חבר קו לחץ ישיר ממיכל חנקן דחוס כדי להגדיל את טווח רמות לחץ היציאה האמינות.
    4. אם אתם משתמשים במיכל אוויר בלחץ, הדקו אותו לסיבית באמצעות רצועת בד עמידה. חברו את הרצועה באמצעות ברגים או ברגים וכללו מנגנון כוונון להידוק והתרופפות קלים.
  7. הצמידו שולחן מיקום x-y לחתיכה הגדולה יותר של סיבית מלבנית מול קנה אקדח הפיינטבול באמצעות ברגים או ברגים (איור 1F).
    הערה: ניתן לרכוש טבלת מיקום x-y (ראה טבלת חומרים), המכונה גם שלב x-y, מספקים שונים, כולל קמעונאים מקוונים, ספקים תעשייתיים וספקי ציוד מדעי. בעת רכישת טבלת מיקום x-y, שקול את טווח הנסיעה, קיבולת המטען, הדיוק והבחירה בין כוונון ידני או בקרה ממונעת. טבלת מיקום x-y זו תאפשר תנועה ומיקום מדויקים של בעל החיים לאורך שני צירים: ציר ה-x (אופקית לכיוון הקנה או הרחק ממנו) וציר ה-y (אנכית למעלה או למטה מהקנה).
  8. שנה את טבלת המיקום x-y על ידי התקנת שלושה מלחציים PVC.
    1. הדקו שני מהדקי PVC בעובי 1 ס"מ משני צדי חזית החבית באמצעות ברגים או ברגים. ודא שהמלחציים רחבים מספיק כדי להכיל את מחזיק בעל החיים משלבים 1.9 ו-1.10 (למשל, 1.5 אינץ').
    2. הדקו מהדק PVC עבה יותר (4 ס"מ) בניצב והפוך לשני מהדקים בעובי 1 ס"מ באמצעות ברגים או ברגים. ודא שהמהדק רחב מספיק כדי להכיל את מתמר הלחץ משלב 2.4 (למשל, 1.5 אינץ').
    3. קדח שני חורים בחלק העליון של המהדק השלישי והכנס שני ברגי פלסטיק לייצוב נוסף של מתמר הלחץ במהלך כיול המערכת בשלב 2.
  9. התאימו אישית את החלק הפנימי של מחזיק החיות (איור 2A).
    1. רכוש וחתוך חתיכת צינור PVC (קוטר חיצוני 35 מ"מ, קוטר פנימי 26 מ"מ, אורך 6.75 אינץ') עבור תא ההכלה הפנימי של העכבר.
    2. צור חור בצורת מלבן (3 x 5 ס"מ) במרחק של 1 אינץ' מקצה הצינור כדי לחשוף את ראש העכבר ואת כתפיו האחוריות העליונות בעוד שאר הגוף נשאר מוגן.
      הערה: אם אתר הפגיעה במערכת העצבים המרכזית נמוך יותר על גב העכבר (למשל, עמוד השדרה החזי או המותני), הגדילו את החור המלבני.
  10. התאימו אישית את החלק החיצוני של מחזיק החיות (איור 2B).
    1. רכוש וחתוך חתיכת צינור PVC (קוטר חיצוני 44 מ"מ, קוטר פנימי 35 מ"מ, אורך 6 אינץ') עבור תא ההכלה החיצוני של העכבר.
    2. בנו צמצם חשיפה (איור 2C) בתוך תא ההכלה החיצוני לשליטה מדויקת באתר הפגיעה במערכת העצבים המרכזית.
    3. צור מפתח צמצם הדדי בצד הנגדי כדי להכניס את הקנה של מתמר הלחץ במהלך כיול המערכת בשלב 2 (למשל, חור של 9 מ"מ).
  11. שנו את החלק החיצוני של מחזיק בעל החיים כך שיתאים לאספקת גז הרדמה. אם במקום זאת ייעשה שימוש בחומר הרדמה בהזרקה, דלג על שלב זה.
    1. יש לאטום קצה אחד של החלק החיצוני של בעל החיים באמצעות סרט הדבקה. ודא התאמה הדוקה כדי למנוע דליפת גז.
    2. צור חור קטן באטם כדי להכניס את קו ההרדמה.
    3. מקם את קו ההרדמה כדי להחדיר איזופלורן לסביבת הצינור ללא מגע ישיר עם החיה.

2. כיול המערכת

  1. חברו מתמר לחץ (איור 2D; ראו טבלת חומרים לקבלת אפשרויות) למערכת איסוף נתונים (DAQ) ולמחשב כדי לתרגם קריאות לחץ פיזיות לנתונים דיגיטליים.
    1. חבר את מתמר הלחץ למודול DAQ (ראה טבלת חומרים), כדי להבטיח קוטביות תקינה וחיבורים מאובטחים.
    2. הכנס את מודול DAQ למארז DAQ (ראה טבלת חומרים) כדי לאפשר לו לקבל חשמל ולתקשר עם המחשב.
    3. השתמש בכבל USB כדי לחבר את מארז DAQ למחשב.
    4. ודא שבמחשב מותקנות התוכנות ומנהלי ההתקנים הדרושים לצורך התממשקות עם חומרת DAQ ולקבלת נתונים (ראה טבלת חומרים לקבלת אפשרויות).
  2. קביעת תצורה של הגדרות מערכת DAQ.
    1. פתח את תוכנת DAQ המותקנת.
    2. ודא שהמחשב מזהה את מערכת DAQ.
    3. עיין בגיליונות הנתונים של המפרט והכיול עבור המודול/מארז ומתמר הלחץ הספציפיים של DAQ וקבע את תצורת הגדרות מערכת DAQ:
      הערה: הגדרות DAQ עבור חומרת DAQ המשמשת בכתב יד זה זמינות לציבור ב- GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בכתובת https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      1. קלט אנלוגי: בחר את ערוץ הקלט הפיזי במודול DAQ שבו מחובר מתמר הלחץ.
      2. מקור עירור (מקור Vex): ציין את מקור העירור של מודול DAQ (לדוגמה, פנימי או חיצוני).
      3. מתח עירור (ערך Vex): הגדר את ערך vex לערך שצוין על-ידי יצרן מתמר הלחץ (לדוגמה, 5 או 10 V).
      4. סוג גשר: בחר את סוג הגשר המתאים של מודול DAQ שלך (לדוגמה, גשר מלא, חצי גשר או רבע גשר).
      5. התנגדות גשר: הגדר את התנגדות הגשר לערך שצוין על-ידי יצרן מתמר הלחץ (לדוגמה, 350).
      6. גורם כיול/קנה מידה מותאם אישית: הגדר את קנה המידה בהתבסס על גליון נתוני כיול שסופק על-ידי היצרן של מתמר הלחץ. היצרן מכייל את מתמר הלחץ על ידי החלת יחידה פיזיקלית ידועה (psi) ומדידת היחידות החשמליות המתקבלות (mV/V). צור עקומת כיול על ידי התוויית היחידות הפיזיקליות הידועות כנגד היחידות החשמליות המתקבלות.
      7. קצב הדגימה (Hz): הגדר את קצב הדגימה גבוה מספיק כדי ללכוד את הדינמיקה של שינויי הלחץ ללא החלקה (לדוגמה, 1 או 10 קילו-הרץ, בהתאם למהירות שינויי הלחץ בניסוי).
        הערה: ככל שצורת הגל של האוויר בלחץ יתר צרה יותר (כלומר, ככל שהיא משנה לחץ מהר יותר), כך טווח התדרים שהיא מעוררת רחב יותר ולכן קצב הדגימה צריך להיות גבוה יותר. זה חשוב במיוחד בניסויים הכוללים מודלים של פגיעה במערכת העצבים המרכזית, שבהם שינויי לחץ יכולים להתרחש במהירות.
  3. צור כלי דיגיטלי בתוכנת DAQ לרכישת נתונים.
    הערה: כלי דיגיטלי זה ישמש למדידה, הקלטה, הצגה וניתוח מדויקים של לחצי הפלט של המערכת. הכלי הדיגיטלי המשמש בכתב היד שלו זמין לציבור ב- GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בכתובת https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.x
    1. הטמע אלגוריתמים לעיבוד אותות כדי לסנן, להגביר או לעבד בדרך אחרת את הנתונים הגולמיים מהמתמר.
    2. הוסף כלי ניתוח כדי לחשב מדדים כגון לחץ שיא, לחץ ממוצע ומשך אירועי לחץ.
    3. שלב רכיבים חזותיים (לדוגמה, גרפים) כדי להציג נתוני לחץ בזמן אמת ורכיבי בקרה כדי להתחיל, לעצור ולאפס את רכישת הנתונים.
    4. שמור את הכלי הדיגיטלי.
  4. מדידת לחץ היציאה של המערכת
    1. הכנס את מתמר הלחץ לתוך המהדק העבה על שולחן x-y ואת הקנה שלו דרך החור של בעל החיים (נוצר בשלב 1.10.3).
    2. התאם את קנה מתמר הלחץ עד שהקצה נמצא בדיוק במיקום של אתר הפציעה של CNS.
    3. אבטח את מתמר הלחץ באמצעות שני ברגי פלסטיק (מותקנים בשלב 1.8.3).
  5. הפעל את הכלי הדיגיטלי בתוכנת רכישת הנתונים תוך שחרור ההדק של אקדח הפיינטבול כדי ללכוד, לנתח ולדמיין את לחץ הפלט של המערכת.
  6. כוונן את בורג הכוונון עד שלחץ היציאה של המערכת יגיע לרמה הרצויה.
    הערה: לאחר שינוי קנה אקדח הפיינטבול כך שיהיה ללא הגנה, 1.5 אינץ' אורך וקוטר 6.5 מ"מ, המערכת מסוגלת לספק באופן אמין רמות אוויר בלחץ יתר בטווח של 15-50 psi ב 5 מ"מ מקדמת הקנה34. רמות אוויר בלחץ יתר מתחת ל-15 psi ומעל 50 psi מציגות שונות גדולה בעוצמתן. לתצוגה מקיפה של לחץ היציאה של המערכת (psi) כפונקציה של לחץ קלט (psi), מרחק מהקנה (cm) וזמן (ms), ראו איור 2 של Hines-Beard et al.34. השתמש בחנקן דחוס במקום באוויר דחוס כדי להשיג באופן אמין רמות אוויר בלחץ יתר מעל 50 psi באמצעות מערכת זו.

3. הכנת בעלי חיים וחשיפה לאוויר בלחץ יתר

  1. מרדימים את העכבר עם isoflurane בתא אינדוקציה עם 1.5-3%30,31,32,33 isoflurane בחמצן עד טשטוש מלא.
    1. לאשר הרדמה על ידי הערכה של היעדר תגובה צביטת בוהן.
    2. הצמידו את העכבר למחזיק בעל החיים הפנימי כאשר ראשו וכתפיו האחוריות העליונות חשופים דרך הפתח המלבני, בעוד הגפיים האחוריות והתחתונות נשארות מוגנות.
    3. תמכו בראש העכבר באמצעות כרית המוצמדת לחלק התחתון השלם של מחזיק החיה הפנימי.
    4. אבטח את העכבר על ידי מריחת סרט כירורגי על הכתפיים האחוריות העליונות.
    5. הכנס את מחזיק החיות הפנימי למחזיק החיות החיצוני.
    6. קו הרדמה משני פתוח להעברת איזופלורן בתוך בעל החיים.
    7. הניחו כרית נוספת בקצה מחזיק בעל החיים כדי למנוע דליפה של חומר הרדמה מהצינור וכדי למנוע מהעכבר לזוז במהלך חשיפה לאוויר בלחץ יתר.
  2. אספקת אוויר בלחץ יתר
    1. יש ליישר את הצמצם המעגלי בקוטר 4 מ"מ של מחזיק החיות החיצוני ישירות מעל עינו השמאלית של העכבר.
    2. מקם את מחזיק החיה באמצעות ידיות הבקרה על שולחן x-y כך שהצמצם שלו מתיישר עם קנה אקדח הפיינטבול והמשטח החיצוני יהיה 5 מ"מ מקצה הקנה.
      הערה: התאם את המרחק של בעל החיים מקצה הקנה כדי לשנות את רמת האוויר בלחץ יתר (psi) ואת הצורה. הרחיקו את בעל החיים מהחבית כדי להוריד את מפלס האוויר בלחץ יתר וליצור גל אוויר מפוזר יותר בלחץ יתר.
    3. הפעל את רצף האוויר בלחץ יתר כדי לגרום ל- ITON:
      1. לספק שני התפרצויות של אוויר בלחץ יתר של 15 psi במרווח של 0.5 שניות החוזרות על עצמן מדי יום במשך 3 ימים 29,30,31,32.
        הערה: ITON דומה יכול להיגרם על ידי משלוח של שלושה התפרצויות רצופות של 15 psi לחץ יתר אוויר המופרד על ידי 0.5 s מרווחים23. מידת ITON המתקבלת לאחר מסירה של שישה התפרצויות רצופות של אוויר בלחץ יתר של 15 psi המופרדים במרווחים של 0.5 שניות מוצגת כאן בתוצאות מייצגות.
      2. חשוף עכברי דמה לרעש האוויר בלחץ יתר, אך לא לאוויר לחץ היתר עצמו על ידי סיבוב מחזיק בעלי החיים כך שהצמצם כבר לא פונה לחבית וחסום את האוויר עם מגן קרטון.
  3. שחזור עכבר
    1. תנו לעכברים להתאושש מההרדמה.
      1. יש לתת טיפות עיניים עם חומר סיכה (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע מהעיניים להתייבש מההרדמה.
      2. ספק חום באמצעות תמיכת חימום מבוקרת (ראה טבלת חומרים).
    2. עקוב חזותית אחר העכברים עד שהם שומרים על יציבה זקופה והולכים כרגיל. אפשרו להם להיות בחברת חבריהם לכלוב.
    3. ספקו לכל העכברים שנחשפו לאוויר בלחץ יתר מזון להתאוששות מג'ל (ראו טבלת חומרים) במשך 3 הימים הראשונים לאחר הפציעה כדי למנוע ירידה במשקל.

4. איסוף רקמות ועיבודן

  1. הרדימו את העכברים באמצעות הזרקה תוך צפקית של Avertin Working Solution.
    1. צור Avertin Stock על ידי ערבוב 10 גרם של 2,2,2,-tribromoethanol (ראה טבלה של חומרים) עם 10 מ"ל של 1-Pentanol (ראה טבלה של חומרים). יש לאחסן בחושך בטמפרטורה של 4°C.
    2. הפוך את פתרון העבודה של Avertin על ידי שילוב של 1.25 מ"ל של Avertin Stock, 45 מ"ל של מים מזוקקים כפול ו- 5 מ"ל של 10x PBS (ראה טבלת חומרים) בצינור של 50 מ"ל. סנן, לעקר את התערובת ולאחסן בחושך ב 4 ° C.
  2. לנקב את העכברים באופן טרנסקרדילי עם 4% פרפורמלדהיד (ראו טבלת חומרים) ב-1x PBS (ראו טבלת חומרים).
  3. יש לחנך את העין החשופה לאוויר בלחץ יתר באמצעות מלקחיים עדינים (ראו טבלת חומרים) ומספריים (ראו טבלת חומרים), תוך הקפדה על שימור עצב הראייה (ON).
  4. לאסוף את ON יחד עם רקמת העין enucleated לניתוח נוסף.
  5. אוסמיקאט על רקמות.
    1. Postfix ON רקמה לילה ב 4% paraformaldehyde ו 2% glutaraldehyde (ראה טבלה של חומרים) ב 1x PBS. אם עובדים עם רקמה שלא הייתה מחוררת (כמו בשלב 4.2), יש לבצע פוסטפיקס למשך 5 ימים במקום למשך הלילה.
    2. מעבירים את הרקמה לצלחת בת 12 או 24 בארות (ראו טבלת חומרים) עם PBS אחד באמצעות מברשת צבע (ראו טבלת חומרים) או מקל עץ חד.
    3. במכסה אדים, החלף את 1xPBS ב-2% אוסמיום טטרוקסיד (ראה טבלת חומרים) במאגר קקודילט 0.2 M (המתכון זמין לציבור ב-GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בשעה https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON) באמצעות פיפטת העברה. לדגור על קרח במשך 2 שעות.
    4. בצע שלוש שטיפות עם PBS אחד
      1. יש להשליך פסולת אוסמיום כראוי.
      2. השאירו את הצלחת במכסה האדים למשך שני לילות לאחר שטיפת PBS השלישית.
  6. התייבשות על רקמה בסדרת אתנול מדורגת.
    1. מעבירים את העצבים לצלחת חדשה עם 50% אתנול ודגרים במשך 30 דקות.
    2. יש להחליף באתנול 70% למשך 30 דקות.
    3. יש להחליף באתנול 95% למשך 30 דקות.
    4. יש להחליף באתנול 100% למשך 30 דקות.
  7. הטמע על רקמה באפון.
    הערה: מתכון Epon זמין לציבור ב- GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בכתובת https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON; ראו טבלת חומרים לחומרים המופיעים במתכון.
    1. יום 1: מעבירים את הרקמה לבקבוקון של 2 מ"ל עם פרופילן אוקסיד (ראו טבלת חומרים)/אתנול 100% (1:1) ומנערים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. יש להחליף בפרופילן אוקסיד טהור ולנער במשך 15 דקות, תוך חזרה על הפעולה פעם אחת. יש להחליף בפרופילן אוקסיד/אפון (1:1) ולנער למשך הלילה בחדר הקר.
    2. יום 2: מעבירים את הממחטות לצלחת של 12 או 24 בארות עם 100% אפון ומנערים במשך 4 שעות בטמפרטורת החדר. יש להחליף ב-100% אפון טרי ולדגור לילה בטמפרטורת החדר בשואב.
    3. יום 3: חזור על דגירה של אפון כמו ביום 2.
    4. יום 4: מעבירים את הממחטה לתבנית שטוחה עם 100% אפון, מכוונים מחדש את הרקמה ומכניסים לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות למשך 48 שעות.
  8. סעיף על רקמות.
    1. חותכים תבניות תחת היקף חיתוך לפירמידה כפולה עם העצב במרכז.
    2. אספו חתכים בעובי 700 ננומטר באמצעות אולטרה-מיקרוטום וסכין יהלום (ראו טבלת חומרים).
    3. אספו מקטעים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לבנה טעונות באמצעות מים מזוקקים.
    4. יש לייבש בתנור בטמפרטורה של 60°C עד שהמים מתאדים. מצננים בטמפרטורת החדר.
  9. כתם על רקמות.
    1. יש לטבול שקופיות בפרפנילאנדיאמין 1% (PPD) (ראו טבלת חומרים) בתערובת של 1:1 מתנול ו-2-פרופנול למשך 28 דקות.
    2. שטפו שקופיות בשתי תערובות רצופות של מתנול ביחס 1:1 (ראו טבלת חומרים) ו-2-פרופנול (ראו טבלת חומרים) במשך דקה אחת כל אחת.
    3. יש לשטוף את המגלשות באתנול 100% למשך דקה אחת ולאפשר להן להתייבש באוויר.
    4. הניחו שקופיות בקופסה לחה וכסו חלקים בכחול טולוידין 1% (ראו טבלת חומרים) באמצעות פיפטה להעברה.
    5. דוגרים בתנור של 60 מעלות למשך 20 דקות.
    6. יש לשטוף את המגלשות במים מזוקקים פעמיים ולאפשר להן להתייבש באוויר.
  10. הר ותמונה על רקמות.
    1. כיסוי שקופיות באמצעות מדיית הרכבה (ראה טבלת שיטות), הסרת מדיה עודפת.
    2. יש לאפשר למגלשות להתייבש למשך הלילה.
    3. חתכי תמונה באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר עם מטרה טבילת שמן פי 100.
  11. להטביע, לחתוך ולהכתים את רקמת הרשתית באופן אימונוהיסטוכימי.
    1. Postfix רקמת עין שלמה ב 4% paraformaldehyde במשך 2-4 שעות.
    2. Cryoprotect את כל רקמת העין ב 30% סוכרוז (ראה טבלה של חומרים ב 1x PBS לילה ב 4 ° C.
    3. הטמע רקמת עין בתווך הקפאה (ראה טבלת חומרים).
    4. אספו חתכי רשתית בעובי 10 מיקרומטר על גבי הקפאה והרכיבו את החלקים על שקופיות מיקרוסקופ זכוכית לבנה טעון (ראו טבלת חומרים).
    5. שטפו שקופיות ב-1x PBS ודגרו בחיץ חוסם (5% Triton X-100 ו-2% אלבומין בסרום בקר (BSA) (ראו טבלת חומרים) ב-1x PBS) עם 5% סרום חמור רגיל (NDS) (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    6. יש לדגור על שקופיות למשך הלילה בטמפרטורה של 4°C (או בטמפרטורת החדר למשך 4 שעות) בנוגדן ראשוני (ראו טבלת חומרים) ב-0.5% Triton X-100 (ראו טבלת חומרים) ב-1xPBS (PBT).
    7. יש לשטוף שקופיות ב-PBT ולדגור בנוגדן משני (ראה טבלת חומרים) בחיץ חוסם עם 5% NDS.
    8. יש לשטוף שקופיות ב-PBT, למרוח אמצעי הרכבה עם DAPI (ראו טבלת חומרים), לכסות ולאטום בלק.
    9. שקופיות תמונה במיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.
    10. אם אתם מכמתים את עוצמת הפלואורסצנטיות, ודאו שהתמונות מצולמות מאותו אזור ברשתית עם הגדרות הגדלה, רווח וחשיפה זהות.
  12. סמוך על אקסונים.
    1. ספירה ידנית של מספר האקסונים באמצעות תוכנה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים) על ידי דגימה של 20% משטח חתך העצבים הכולל באמצעות שכבת רשת קבועה להערכת צפיפות האקסון (אקסונים/מ"מ2).
    2. מדוד את שטח חתך הרוחב ON.
      1. השתמשו בפונקציה Set Scale כדי להגדיר פיקסלים/מיקרונים למטרה המשמשת לתמונה.
      2. השתמש בכלי בחירת מצולע כדי לעקוב לאורך מעטפת המיאלין של עצב הראייה, למעט כלי הדם.
      3. מדוד את שטח ה- ON באמצעות הפונקציה מדידה .
      4. קבע 20% מהשטח הכולל על-ידי הכפלת השטח הנמדד ב- 0.2.
    3. שכבו-על את הרשת הקבועה בחתך פועל.
      1. הורד את תוסף Counting Array.
        הערה: תוסף זה זמין לציבור ב-GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בכתובת https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. פתח את התוסף Counting Array כדי לכסות רשת קבועה על גבי חתך הרוחב, המורכב מ- 9 ריבועים במרווחים שווים בצורת סימן חיבור.
      3. ערוך את השטח לכל אחד מ- 9 האזורים על-ידי חלוקת 20% מהשטח הכולל של חתך ON (מחושב בשלב 4.6.2.4) ב- 9.
      4. מרכז את הרשת הקבועה כך שמרכז סימן החיבור יהיה ממורכז באמצע חתך ההפעלה.
    4. ספרו אקסונים חיים ומנוונים בנפרד.
      1. הורד ופתח את התוסף Cell Counter.
        הערה: תוסף זה זמין לציבור ב-GitHub. קוראים המעוניינים בכך יכולים לגשת למאגר בכתובת https://github.com/amystahl19/RexLab-ITON.
      2. עבור כל אחד מ -9 האזורים, ספור את מספר פרופילי האקסון החיים והמנוונים בנפרד על ידי הדמיה של מצב נדן המיאלין. ודא שכימות האקסון מבוצע תוך עיוורון לקבוצת הניסוי של בעל החיים כדי למנוע הטיה.
      3. עבור אקסונים חיים, חפשו את אלה שבהם מעטפת המיאלין נראית שלמה, מוכתמת באופן אחיד ומוקפת בצורה חלקה ואחידה סביב האקסון.
      4. עבור אקסונים מנוונים, חפשו אקסונים עם עיבוי, בצל או קריסה של מעטפת המיאלין.
      5. אם האקסון נחתך חלקית על ידי הרשת השכובה, כלול אותו בספירת האקסון רק אם הלומן נראה.
      6. ודא שאקסונים מלבניים אינם נספרים בטעות יותר מפעם אחת, ואל תטעה בין פסולת או אבק לפרופיל אקסון מנוון.
    5. בצע ניתוחים סטטיסטיים כדי לבדוק הבדלים משמעותיים בספירות האקסון הממוצעות בין קבוצות. ודא שלפחות ארבעה ONs כלולים בכל קבוצה כדי לקחת בחשבון את השונות הנורמלית שנצפתה בניתוחים קודמים.
      1. בצע מבחן t של דגימות עצמאיות (הידוע גם בשם מבחן t של התלמיד לדגימות עצמאיות) כדי להעריך הבדלים משמעותיים בין האמצעים של שתי קבוצות עצמאיות.
      2. בצע את החלופה הלא פרמטרית, מבחן Mann-Whitney U, אם לא ניתן לעמוד בתנאים למבחן t של דגימות עצמאיות (כלומר, אם הנתונים אינם מופצים בדרך כלל או שגודל המדגם קטן מדי).

תוצאות

באמצעות המערכת לייצור אוויר בלחץ יתר שתוארה כאן, נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה (ITON) התעוררה על ידי חשיפת העין השמאלית של עכברי C57Bl/6 זכרים בוגרים (בני 3 חודשים) (n = 4) לשישה התפרצויות רצופות של אוויר בלחץ יתר של 15 psi המופרדים במרווחים של 0.5 שניות. חיות דאם (n = 8; נתונים שנלקחו מ- Vest et al.33) הורדמו, הוכנסו למחזיק החיה, ונחשפו לרעש אך לא לאוויר בלחץ יתר.

עצבי הראייה הפרוקסימליים של חיות דמה (איור 3A) נראו בריאים עם אקסונים צפופים ובגודל אחיד מוקפים בתאי גלייה עם מורפולוגיה ותפוצה נורמליות. לשם השוואה, העצבים האופטיים הפרוקסימליים של עכברים שנחשפו ל-ITON (כלומר, 6 התפרצויות רצופות של אוויר בלחץ יתר של 15 psi המופרדים במרווחים של 0.5 שניות) (איור 3B) נראו מתנוונים עם סימנים של אובדן אקסונים, כגון מרווח מוגבר בין האקסונים הנותרים, סימנים של ניוון אקסונים, כולל נפיחות, אי סדירות בצורת האקסון והתמוטטות מעטפת המיאלין של האקסונים, וסימנים של גליוזיס, כולל היפרטרופיה והיפרפלזיה של תאי גלייה. בדיקות Mann-Whitney U אישרו הבדל משמעותי בסך האקסונים (p = 0.0040) (איור 3C) ובפרופילים ניווניים (p = 0.0028) (איור 3D) בין ITON לעכברי דמה. תוצאות אלה מצביעות על כך ש- ITON מקטין באופן משמעותי את סך האקסונים ומגדיל באופן משמעותי פרופילים ניווניים. מבחני Mann-Whitney U בוצעו מכיוון שהנתונים עבור קבוצת ITON לא היו בגודל מדגם גדול מספיק עבור מבחן t של דגימות עצמאיות.

צביעה אימונוהיסטוכימית של חתכי רשתית עם אנטי-Iba1 (ראו טבלת חומרים), סמן למיקרוגליה (תאי החיסון העיקריים של מערכת העצבים המרכזית), בוצעה גם בעכברי דמה (איור 4A) וגם בעכברי ITON (איור 4B). הצביעה גילתה כי תאי מיקרוגליה היו במצב מנוחה עבור כל העכברים, המאופיינים בגופי תאים קטנים עם תהליכים ארוכים, דקים ומסועפים מאוד. יש לציין כי מספר מוגבר של תאי מיקרוגליה נצפה בעכברי ITON (איור 4B), מה שמרמז על התפשטות מיקרוגליה בתגובה לפציעה. נוסף על כך, בעכברי ITON נצפתה התפשטות חריגה של תאי מיקרוגליה לתוך השכבה הגרעינית החיצונית (ONL), שבה שוכנים גופי תאים קולטי אור (איור 4B). זה בניגוד לחיות דמה (איור 4A), שבהן תאי מיקרוגליה היו ממוקמים לשכבת תאי הגנגליון (GCL), שכבת הפרספקס הפנימית (IPL), השכבה הגרעינית הפנימית (INL) ושכבת הפרספקס החיצונית (OPL) – השכבות שבהן תאי מיקרוגליה שוכנים בדרך כלל ברשתית בריאה ולא פגועה.

צביעה אימונוהיסטוכימית עוקבת עם אנטי-PKC-α (ראו טבלת חומרים) ואנטי-סינפטופיזין (ראו טבלת חומרים), סמנים עבור תאים דו-קוטביים של מוטות וסינפסות סרט של קולטני אור, בהתאמה, חשפו קשרים סינפטיים שלמים הן בעכברי דמה (איור 5A) והן בעכברי ITON (איור 5B). באופן ספציפי, הדנדריטים של תאים דו קוטביים מוט נצפו מתרחבים וחופפים עם הטרמינלים הסינפטיים של פוטורצפטורים. ממצא זה מנוגד למחקר מוקדם35, שהראה נסיגה של דנדריטים של תאים דו-קוטביים מוט לכיוון גוף התא שלהם ארבעה שבועות לאחר ITON משני התפרצויות רצופות של 15 psi של אוויר בלחץ יתר (0.5 שניות זה מזה) פעם ביום במשך 3 ימים. ניתן לייחס פער זה לנקודות הזמן השונות של איסוף הרקמה בין שני המחקרים. הדגימות הנוכחיות נאספו שבועיים לאחר ITON בהשוואה ל-4 שבועות לאחר ITON במחקר הקודם. אף על פי שלא זוהתה סינפטופתיה בניתוח הנוכחי, שמנו לב להתרחבות של תהליכי מיקרוגליה לתוך ה-ONL (איור 4B), שם נמצאים גופי תאים קולטי אור. תצפית זו מצביעה על כך ששיבוש הקשרים הסינפטיים בין תאים דו-קוטביים לבין פוטורצפטורים עשוי להופיע כהשפעה משנית של הפגיעה, בעוד שאובדן אקסונים, ניוון אקסונים וגליוזיס מהווים השפעות ראשוניות של נזק.

figure-results-3856
איור 1: מערכת לפגיעה מוקדית במערכת העצבים המרכזית של מערכת העצבים המרכזית. מלבנים מקווקווים בתמונה העליונה מוגדלים ומוצגים כ- B, C ו- A בשתי התמונות הבאות (כפי שמסומן בחצים לבנים). (A) קנה מותאם אישית בקוטר 1.5 אינץ', ללא הגנה (I) בקצה אקדח הפיינטבול. (B) וסת לחץ עם מכסה מנחה שהוסר כדי לחשוף בורג כוונון (II). (C) צוואר הזנה עם מטעין הזנת הכבידה הוסר וכיסוי צוואר הזנה מותקן (III). (D) פלטפורמת בסיס המורכבת מחתיכת סיבית בגודל 1.5 רגל x 1.5 רגל מוגבהת מעל פיסת סיבית גדולה יותר בגודל 2.5 רגל x 1.5 רגל. (ה) מיכל אוויר דחוס המחובר לווסת הלחץ של אקדח הפיינטבול ומחובר לפלטפורמת הסיבית באמצעות רצועה עמידה. (F)x-y טבלת מיקום בעלי חיים. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-4922
איור 2: מחזיק מותאם אישית לבעלי חיים להעברה מוקדית של אוויר בלחץ יתר. (A) בתוך מחזיק בעל החיים המורכב מצינור PVC צר עם חור בצורת מלבן (3 x 5 ס"מ) כדי לחשוף את ראשו של בעל החיים ואת כתפיו האחוריות העליונות. (B) מחוץ למחזיק בעל החיים מורכב מצינור PVC רחב יותר שצינור ה-PVC הצר יותר מחליק לתוכו, ומגן על כל גוף בעל החיים מלבד הרקמה החשופה בתוך פתח החשיפה. (C) צמצם חשיפה להעברה מוקדית של אוויר בלחץ יתר לאתר הפגיעה במערכת העצבים המרכזית. (D) מתמר לחץ לכיול לחץ היציאה של המערכת. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-5813
איור 3: ITON עקב העברה מוקדית של אוויר בלחץ יתר. (א,ב) מיקרוגרפים מייצגים של שדה בהיר של חתכי עצב הראייה הפרוקסימלי מ-(A) sham ו-(B) ITON. (C) כימות של סך כל ספירות האקסון. (D) כימות פרופילי אקסונים ניווניים. n = 4 עבור ITON. n = 9 עבור מזויף. נתוני ספירת האקסון עבור קבוצת ההונאה נלקחו מ-Vest et al.33. **P < 0.005. קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. פסי קנה מידה = 20 מיקרומטר. קיצור: ITON = נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-6735
איור 4: התפשטות חריגה של תאי מיקרוגליה והגירה לתוך ה-ONL כתוצאה מ-ITON המושרה על-ידי המערכת. (A,B) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מייצגים של חתכי רשתית עם תיוג אנטי-Iba1 של מיקרוגליה (אדום) מ-(A) דמה ו-(B) חיות ITON. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: ITON = נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה; GCL = שכבת תאי גנגליון, INL = שכבה גרעינית פנימית, ONL = שכבה גרעינית חיצונית. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

figure-results-7501
איור 5: התמדה מוקדמת של קשרים סינפטיים בין תאים דו-קוטביים של מוטות לבין פוטורצפטורים כתוצאה מ-ITON המושרה על-ידי המערכת, למרות הפוטנציאל לסינפטופתיה מאוחרת. (A,B) מיקרוגרפים פלואורסצנטיים מייצגים של חתכי רשתית עם תיוג אנטי-סינפטופיזיני של סינפסות סרט פוטורצפטור (אדום) ותיוג אנטי-PKC-α של תאים דו-קוטביים מוט (ירוק) מ-(A) sham ו-(B) חיות ITON. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר. קיצורים: ITON = נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה; PKC = חלבון קינאז C. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

מערכת אוויר מותאמת אישית זו בלחץ יתר היא כלי שימושי לחקר פציעות CNS במערכת סגורה במודלים מורינים. התוצאות המייצגות מהניסוי לדוגמה מראות כי העברה מוקדית של אוויר בלחץ יתר באמצעות מערכת זו יכולה לגרום ביעילות ל- ITON, וכתוצאה מכך לאובדן וניוון אקסונים משמעותיים. זה מדגיש את היכולת של המערכת לייצר פגיעה CNS מדויקת וניתנת לשחזור.

אחת החוזקות העיקריות של מערכת זו היא יכולת ההתאמה האישית שלה כדי לגרום למגוון פציעות CNS. ניתן להתאים את חומרת הפגיעה על ידי שינוי לחץ היציאה הכולל של המערכת, מרחק החיה מקצה הקנה באמצעות שלב מיקום x-y, גודל וצורת צמצם החשיפה, מספר החשיפות לאוויר בלחץ יתר והמרווח בין החשיפות. בנוסף, ניתן להתאים את מיקום הפגיעה במערכת העצבים המרכזית על ידי שינוי מיקום צמצם החשיפה בתוך בעל החיים. רב-תכליתיות זו אפשרה למערכת לייצר ספקטרום של פגיעות CNS במערכת סגורה במודלים של מערכת העצבים המרכזית. בתחילה, המערכת שימשה למידול פציעות בכדור סגור, תוך התמקדות בנזק לקוטב הקדמי והאחורי וליקויים קשורים34,36, כולל ההשפעות של תגובת מערכת החיסון37, תוצאות ספציפיות לזן38, והיעילות של חומרים נוירופרוטקטיביים39. בסופו של דבר, יישום זה התרחב כדי להעריך את sequelae של חשיפות חוזרות ומכוונות עין למודל נוירופתיה אופטית טראומטית עקיפה (ITON)30 ולחקור את ההשפעה של מספר ומרווח בין חשיפות חוזרות33. מאז, היישום של המערכת התרחב למודל של פגיעה מוחית טראומטית קלה בראש סגור (mTBI) באמצעות חשיפות מכוונות ראש40,41 ופגיעה בעמוד השדרה של גוף סגור (SCI) באמצעות חשיפות מכוונות דורסום42, תוך הדגשת יכולת ההסתגלות והרבגוניות של המכשיר בחקר תחומי פגיעה מגוונים במערכת העצבים המרכזית.

בעת שימוש במערכת זו, חיוני לנקוט אמצעים למזעור השונות בתוצאות הפציעה כדי להבטיח את יכולת השחזור והאמינות של תוצאות הניסוי. המדדים העיקריים כוללים כיול רמות לחץ היציאה של המערכת לפני ואחרי כל סדרה של שלוש חשיפות כדי להבטיח אספקת לחץ עקבית. למרות שהשונות נמוכה כאשר המערכת מופעלת בין 15 psi ל- 50 psi בעת שימוש באוויר דחוס34, כיול עקבי מסייע לזהות שגיאות בלתי צפויות, כגון סוללה חלשה או אוויר חלש. בנוסף, מקם כל בעל חיים באותו מרחק מקצה הקנה כדי להבטיח גודל לחץ יתר עקבי, שכן עוצמת גל הלחץ פוחתת עם המרחק. מיקום אחיד גם מבטיח שכל בעל חיים יושפע מאותו חלק של גלי האוויר. יתר על כן, אבטחת בעלי חיים באופן אחיד בתוך המחזיק מבטיחה שהרקמה המעניינת תהיה ממוקדת באופן עקבי, במיוחד במודלים של חשיפה חוזרת כאשר קיים סיכון לתנועה. לבסוף, אחידות בגיל, במין וברקע הגנטי של בעלי החיים היא קריטית מכיוון שגורמים אלה משפיעים על התגובה לפציעה. לדוגמה, מחקרים קודמים שהשתמשו במערכת זו השוו את ההשפעות של אוויר בלחץ יתר מכוון עין על זני עכברים שונים, והדגישו הבדלים משמעותיים בתגובת הפציעה בין עכברי C57Bl/6J36, DBA/2J37 ו-Balb/c38 . עכברי DBA/2J ו-Balb/c הציגו פתולוגיות חמורות יותר בקוטב הקדמי, נזק גדול יותר לרשתית, עקה חמצונית גבוהה יותר ותגובות נוירו-דלקתיות בולטות יותר בהשוואה לעכברי C57Bl/6J עם עכברי Balb/c שהראו פרופילי פציעה חזקים ומתמשכיםבמיוחד 38.

פתרון בעיות מערכת
אם ערכי הלחץ נמוכים באופן לא אופייני עבור הגדרת מד לחץ נתונה, לחץ על ההדק 5-10x, כדי לאפשר לאוויר לעבור דרך המערכת ולוסת להסתגל להגדרה חדשה. אסור שיהיו דליפות במיכל האוויר. אסור לפגוע או ללבוש את טבעת ה- O במיכל האוויר, מיכל האוויר צריך להיות מספיק אוויר, ואין לרוקן את סוללת האקדח. שולחן x-y לא היה צריך לזוז ממיקומו הרגיל מקצה הקנה וצמצם החשיפה לאוויר בלחץ יתר צריך להיות בשורה עם קנה האקדח ולא להסתיר אותו. הרגולטור צריך להיות מאובטח היטב לאחיזת האקדח. אם ערכי הלחץ נמוכים מדי למרות השימוש בהגדרה הגבוהה ביותר במד הלחץ, אין להגדיל את מד הלחץ מעבר ל- 200 psi, ויש להתאים את הגדרת המהירות באקדח להגדרה המרבית. אם הגדרות הלחץ אינן עקביות (למשל, גבוה ואז נמוך), ודא שלמיכל האוויר יש מספיק אוויר, לווסת מחובר היטב לאחיזת האקדח, שאין דליפות במיכל האוויר ושהוא מוברג בחוזקה, וטבעת ה- O במיכל האוויר אינה פגומה או בלויה.

כדי להבין באופן מקיף את מלוא יכולותיה של מערכת זו, חשוב להכיר במגבלותיה. חיקוי תרחישים מהעולם האמיתי בסביבת מעבדה נותר מאתגר. למרות שמערכת זו מייצרת אוויר בלחץ יתר, היא אינה משכפלת את הדינמיקה המורכבת של אירוע נפיץ, כגון שיפועי הלחץ והטמפרטורה המשתנים, נוכחות פסולת וגלים מוחזרים, ואופי רב-שלבי. בנוסף, הוא אינו מחקה צורת גל פרידלנדר ("גל הדף ראשוני"), המאופיין בשיא לחץ חד וכמעט מיידי ואחריו דעיכה מעריכית מהירה היורדת מתחת ללחץ הסביבה לפני שהיא חוזרת לקו הבסיס43. במקום זאת, צורת הגל המיוצרת על-ידי מערכת זו מייצגת פרופיל פשוט וסימטרי יותר, שבו יש עלייה וירידה הדרגתיות יותר בלחץ ללא פאזה שלילית ברורה (ראו איור 2C ב-Hines-Beard et al.34). יתרון מסוים, צורת גל זו משלבת אלמנטים של פציעות הדף וקהות כאחד. "פעימת הלחץ" בצורת פעמון מספקת השפעה עקבית של לחץ יתר, בדומה ל"קיר אוויר" הפוגע בנושא. עם זאת, האוויר בלחץ יתר המועבר על ידי הגל הוא גם היבט אופייני מרכזי של פציעות הדף. יש שיטענו כי בעוד צורת גל זו כוללת היבטים של שני סוגי הפגיעות, היא אינה לוכדת במלואה את המורכבות של אף אחד מהם. עם זאת, "פעימת לחץ" עקבית וניתנת לשחזור זו אידיאלית לניסויים מבוקרים בסביבת מעבדה לחקר פגיעה מוקדית במערכת העצבים המרכזית. הדגמנו בעבר את האופי המוקדי של הפגיעה. לדוגמה, חשיפה לעין אחת אינה גורמת נזק לאפיתל האף הראשוני או למוח44. כמו כן, כאשר מכוונים לצד ראש העכבר, אזור קטן במוח מושפע45. לבסוף, האנרגיה מהאוויר בלחץ יתר ממערכת זו ברמת הלחץ המשמשת ל- ITON לא השפיעה על העכבר אלא אם כן חזרה על עצמה במרווח זמן קצר33. לפיכך, הלחץ אינו מזיק ולכן אינו משכפל כוח סילון. יתר על כן, גם עם חשיפה חוזרת ונשנית של אוויר בלחץ יתר לעין, לא נמצאה השפעה על מבני העין הקדמיים33. ניוון משמעותי של עצב הראייה ואובדן ראייה התרחשו רק בחשיפה חוזרת עם מרווח חשיפה של פחות מדקה33.

בהשוואה למכשירי מעבדה אחרים ליצירת פציעות CNS במערכת סגורה, מערכת זו מציעה יתרונות ייחודיים. הוא יכול לספק התפרצויות רציפות של אוויר בלחץ יתר ברצף מהיר (מרווחים של 0.5 שניות)33, תוך חיקוי תנאים בסביבות תעסוקתיות בסיכון גבוה שבהן חשיפות מהירות להדף הן סכנה נפוצה. לדוגמה, אנשי צבא, הן באימונים והן בתרחישי לחימה, משתמשים בשורה של כלי נשק אוטומטיים המסוגלים לירות במהירות חוזרת, כולל רובים אוטומטיים (למשל, M16, AK-47), מקלעים (למשל, M2 .50 קליבר), תותחי גאטלינג ומיני-אקדחים. כלי נשק איטיים יותר אך חוזרים על עצמם המשמשים אנשי צבא כוללים ארטילריה, מרגמות, רימונים ומטעני חבלה מאולתרים. עובדי הריסה המעורבים בהריסה מבוקרת וכורים המעורבים בפעולות פיצוץ לפירוק סלעים והפקת מינרלים חווים גם הם פיצוצים רציפים ברצף מהיר. לבסוף, פועלי בניין המשתמשים בכלים פניאומטיים, נהגי כלונסאות או ציוד כבד אחר שכוחות הקשה חזקים גנרטיביים יכולים לחוות פגיעות חוזרות מהירות המחקות חשיפות לפיצוץ. יש לציין כי העברה מהירה של אוויר בלחץ יתר אינה אפשרית עם מכשירים כמו צינורות הלם הדורשים הגדרה מחדש נרחבת או לחץ מחדש בין כל אירוע. צינורות הלם משתמשים בסרעפת שמתפרצת כדי ליצור גלי הלם, ולאחר כל התפרצות יש להחליף את הסרעפת. תהליך זה לוקח זמן, שכן יש לפתוח את צינור ההלם, להסיר את הסרעפת המשומשת, להתקין דיאפרגמה חדשה ולאפשר למערכת זמן לאפס ולהדחיק. לכן, במיוחד עבור מחקרים החוקרים פגיעה במערכת העצבים המרכזית לאחר חשיפה מהירה לפיצוץ חוזר, מערכת שאינה דורשת הגדרה מחדש נרחבת או לחץ מחדש בין כל אירוע היא אידיאלית.

יישומים עתידיים של מערכת אפנתית, ידידותית למשתמש וחסכונית זו מבטיחים. תוך מינוף תכונותיה הניתנות להתאמה והייחודיות, מערכת זו פותחת מספר אפיקים מבטיחים למחקרים טיפוליים פרה-קליניים עתידיים. ניתן למנף את יכולתו לספק התפרצויות מהירות ורציפות של אוויר בלחץ יתר כדי לחקור את ההשפעות המצטברות של חשיפות חוזרות ונשנות לפיצוץ, דבר הרלוונטי להבנת אנצפלופתיה טראומטית כרונית ומצבים ניווניים ארוכי טווח אחרים של מערכת העצבים. בנוסף, ניתן להשתמש במערכת זו כדי לחקור את היעילות של התערבויות פרמקולוגיות שונות שמטרתן להקל על פציעות CNS במערכת סגורה, כולל תזמון ומינון של תרופות נוירופרוטקטיביות כדי לקבוע חלונות טיפול אופטימליים. יתר על כן, הדיוק של המערכת בחיקוי היבטים של מנגנוני פציעה קהה ופיצוץ מאפשר פיתוח מודלים מקיפים של פציעות המשקפים את הטראומה המורכבת שחווים אנשים בתרחישים בעולם האמיתי. זה יכול להקל על הבדיקה של טיפולים רב-מודאליים המטפלים בהיבטים גלובליים נפוצים של פציעה, כגון דלקת, עקה חמצונית ומוות עצבי. בסך הכל, מכשיר זה מציע פלטפורמה רב-תכליתית ורבת עוצמה לקידום ההבנה שלנו של פציעות CNS במערכת סגורה ופיתוח התערבויות טיפוליות יעילות.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מימון של NIH NEI P30 EY008126, מענק גילוי פוטוצ'נק ברפואה רגנרטיבית, האלוף בדימוס סטיבן ל. ג'ונס, MD Fund, ו- Research Prevent Blindness, Inc Unrestricted Funds (VEI).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-PentanolFisher ScientificAC160600250Used to make Avertin solution 
2,2,2-tribomoethanolSigma AldrichT48402Used to make Avertin solution 
24-well plates with lidVWR76520-63424-well plate
2-Propanol Fisher ScientificA451-1 
50 kS/s/channel Bridge Analog Input Module National InstrumentsNI-9237DAQ module
Albumin Bovine Fraction V (BSA) Research Products International A30075BSA
Anti-Iba1 Primary Antibody (Goat polyclonal) Abcam ab5076Marker for microglia, Used at 1:500 concentration 
Anti-Synaptophysin Primary Antibody (Mouse monoclonal) Abcam ab8049Marker for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:20 concentration
Araldite GY 502 Electron Microscopy Sciences10900
Cacodylate bufferElectron Microscopy Sciences11652
Charcoal Filter CanisterE-Z SystemsEZ-258Collection of anesthetic waste
Clear H20 DietGel 76AClear H2O 72-07-5022Used post blast to aid animal recovery
CompactDAQ ChassisNational InstrumentsUSB-9162DAQ chassis
Compressed AirA-L GasGSMCA300 Used to refill pressurized air tank
DAPI Fluoromount-G Southern BiotechMounting media with DAPI
Diamond knifeMicro Star Technologies, Group of Bruker Nano, Inc. For sectioning optic nerves, 3 mm/45 degrees/Style H 
Donkey Anti-Goat IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-11058Secondary antibody for microglia, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 594Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21203Secondary antibody for photoreceptor ribbon synapses, Used at 1:200 concentration
Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) High Cross Adsorbed Secondary Antibody, Alex Fluor 488Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)A-21206Secondary antibody for rod bipolar cells, Used at 1:200 concentration 
Donkey Serum Sigma Aldrich D9662NDS
Dumont #3 ForcepsFine Science Tools11231-30Fine forceps for whole eye enucleation 
Ethanol (200 proof) KOPTEC (Supplier: VWR) 89125-188Ethanol 
Fluoromount-G Invitrogen (Supplier: Fisher Scientific)00-4958-02Mounting media
Genteal Tears Ophthalmic GelCovetrus72359Eye lubricant to prevent eyes from drying out during/after anesthesia 
GlutaraldehydeElectron Microscopy Sciences16200
Graduated Cylinder 1000 mLFisher Scientific08-572G
Graduated Cylinder 250 mLFisher Scientific08-572E
Graduated Cylinder 500 mLFisher Scientific08-572F
Heating pad Braintree ScientificAP-R 26EControlled heating support
High Pressure Fill StationNinja PaintballHPFSV2Used to refill pressurized air tank
ImageJNational Institutes of Health Image analysis software
Invert MiniEmpire PaintballPaintball gun
IsofluraneCovetrus29405Inhalation anesthetic
Isoflurane VaporizerVetEquip901806Animal anesthesia
Masterflex PumpCole-ParmerUsed for animal perfusion
Methanol Sigma Aldrich322415-2L 
Microscope SlidesGlobe Scientific1358WWhite glass microscope slides
NI LabVIEW National InstrumentsSoftware to acquire data from DAQ system (other examples include Matlab, Python, or other softwares provided by different DAQ hardware manufacturers)
NI Measurement and Automation Explorer (NI MAX) National InstrumentsSoftware to configure DAQ system settings
NI-DAQmx drivers National InstrumentsDriver for interacing with DAQ system 
Nikon Eclipse Ni-E microscopeNikon Instruments
Osmium tetroxide 2%Electron Microscopy Sciences19152
Paraformaldehyde 32%Electron Microscopy Sciences15714-SPFA diluted down to 4%
Paraphenylenediamine Sigma AldrichP6001
PBS (10x), pH 7.4Thermo Fisher Scientific70011044PBS diluted down to 1x
Propylene oxide Electron Microscopy Sciences20401
PROV3 48 L, 48 in3 Aluminum 3000 psi Rated TankNinja PaintballPressurized air tank
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 1000 mLFisher Scientific06-414-1D
Pyrex Reusable Media Storage Bottle 500 mLFisher Scientific06-414-1C
Pyrex Reusable Media Storage Bottles 250 mLFisher Scientific06-414-1B
Recombinant Anti-PKC-a Primary Antibody (Rabbit monoclonal) Abcam ab32376Marker for rod bipolar cells, Used at 1:500 concentration 
Resin 812Electron Microscopy Sciences14900
Series TJE Pressure Transducer, 100 psi Honeywell 060-0708-10TJGConsider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
SucroseSigma AldrichS5016
Super TJE Pressure Transducer, 7500 psi Honeywell Consider the range when selecting pressure transducer to optimize resolution of measurements 
Syringe/Needle ComboCovetrus 60728Syringe/Needle to perform IP injections
Tissue-Plus OCT CompoundFisher Scientific23-730-571 Freezing medium 
Toluidine blueFisher ScientificBP107-10
Triton X-100Sigma AldrichT8787
UniSlide XY TableVelmex AXY40 SeriesXY positioning table 
University Brush - Series 233- Round, Size 000Winsor and Newton Paintbrush
Vannas Spring Scissors - 2.5mm Cutting EdgeFine Science Tools15000-08Scissors for whole eye enucleation
Virtual InstrumentNational Instruments Digital tool for data acquisition software 

References

  1. Schneiderman, A. I., Braver, E. R., Kang, H. K. Understanding sequelae of injury mechanisms and mild traumatic brain injury incurred during the conflicts in Iraq and Afghanistan: Persistent postconcussive symptoms and posttraumatic stress disorder. Am J Epidemiol. 167 (12), 1446-1452 (2008).
  2. Terrio, H., et al. Traumatic brain injury screening: Preliminary findings in a us army brigade combat team. J Head Trauma Rehabil. 24 (1), 14-23 (2009).
  3. Morissette, S. B., et al. Deployment-related tbi, persistent postconcussive symptoms, ptsd, and depression in oef/oif veterans. Rehabil Pyschol. 56 (4), 340 (2011).
  4. Cooper, D. B., et al. Treatment of persistent post-concussive symptoms after mild traumatic brain injury: A systematic review of cognitive rehabilitation and behavioral health interventions in military service members and veterans. Brain Imaging Behav. 9, 403-420 (2015).
  5. Elder, G. A. Update on tbi and cognitive impairment in military veterans. Curr Neurol Neurosci Rep. 15 (10), 68 (2015).
  6. Vincent, A. S., Roebuck-Spencer, T. M., Cernich, A. Cognitive changes and dementia risk after traumatic brain injury: Implications for aging military personnel. Alzheimers Dement. 10, S174-S187 (2014).
  7. St Onge, P., Mcilwain, D. S., Hill, M. E., Walilko, T. J., Bardolf, L. B. Marine corps breacher training study: Auditory and vestibular findings. US Army Med Dep J. , 97-107 (2011).
  8. Capó-Aponte, J. E., et al. Effects of repetitive low-level blast exposure on visual system and ocular structures. J Rehabil Res Dev. 52 (3), 273-290 (2015).
  9. Tate, C. M., et al. Serum brain biomarker level, neurocognitive performance, and self-reported symptom changes in soldiers repeatedly exposed to low-level blast: A breacher pilot study. J Neurotrauma. 30 (19), 1620-1630 (2013).
  10. Carr, W., et al. Repeated low-level blast exposure: A descriptive human subjects study. Mil Med. 181 (suppl_5), 28-39 (2016).
  11. Caplan, B., et al. Relation of repeated low-level blast exposure with symptomology similar to concussion. J Head Trauma Rehabil. 30 (1), 47-55 (2015).
  12. Woodall, J. L., et al. Repetitive low-level blast exposure and neurocognitive effects in army ranger mortarmen. Mil Med. 188 (3-4), e771-e779 (2023).
  13. Stone, J. R., et al. Functional and structural neuroimaging correlates of repetitive low-level blast exposure in career breachers. J Neurotrauma. 37 (23), 2468-2481 (2020).
  14. Gavett, B. E., Stern, R. A., Cantu, R. C., Nowinski, C. J., Mckee, A. C. Mild traumatic brain injury: A risk factor for neurodegeneration. Alzheimers Res Ther. 2, 1-3 (2010).
  15. Smith, D. H., Johnson, V. E., Stewart, W. Chronic neuropathologies of single and repetitive tbi: Substrates of dementia. Nat Rev Neurol. 9 (4), 211-221 (2013).
  16. Juan, S. M., Daglas, M., Adlard, P. A. Tau pathology, metal dyshomeostasis and repetitive mild traumatic brain injury: An unexplored link paving the way for neurodegeneration. J Neurotrauma. 39 (13-14), 902-922 (2022).
  17. Kundi, S., Bicknell, R., Ahmed, Z. Spinal cord injury: Current mammalian models. Am J Neurosci. 4 (1), 1-12 (2013).
  18. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nat Protoc. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  19. Khalin, I., et al. A mouse model of weight-drop closed head injury: Emphasis on cognitive and neurological deficiency. Neural Regen Res. 11 (4), 630-635 (2016).
  20. Jamnia, N., et al. A clinically relevant closed-head model of single and repeat concussive injury in the adult rat using a controlled cortical impact device. J Neurotrauma. 34 (7), 1351-1363 (2017).
  21. Mishra, V., et al. Primary blast causes mild, moderate, severe and lethal tbi with increasing blast overpressures: Experimental rat injury model. Sci Rep. 6 (1), 1-14 (2016).
  22. Hu, C. -. K., Chen, M. -. H., Wang, Y. -. H., Sun, J. -. S., Wu, C. -. Y. Integration of multiple prognostic predictors in a porcine spinal cord injury model: A further step closer to reality. Front Neurol. 14, 1136267 (2023).
  23. Lim, J. -. H., et al. Establishment of a canine spinal cord injury model induced by epidural balloon compression. J Vet Sci. 8 (1), 89 (2007).
  24. Fukuda, S., et al. New canine spinal cord injury model free from laminectomy. Brain Res Protoc. 14 (3), 171-180 (2005).
  25. Norris, C., et al. A closed-body preclinical model to investigate blast-induced spinal cord injury. Front Mol Neurosci. 16, 1199732 (2023).
  26. Zhao, Q., Zhang, J., Li, H., Li, H., Xie, F. Models of traumatic brain injury-highlights and drawbacks. Front Neurol. 14, 1151660 (2023).
  27. Osier, N. D., Dixon, C. E. The controlled cortical impact model: Applications, considerations for researchers, and future directions. Front Neurol. 7, 214364 (2016).
  28. Chen, Y., Constantini, S. Caveats for using shock tube in blast-induced traumatic brain injury research. Front Neurol. 4, 117 (2013).
  29. Bernardo-Colón, A., et al. Antioxidants prevent inflammation and preserve the optic projection and visual function in experimental neurotrauma. Cell Death Dis. 9 (11), 1097 (2018).
  30. Bernardo-Colón, A., et al. Progression and pathology of traumatic optic neuropathy from repeated primary blast exposure. Front Neurosci. 13, 719 (2019).
  31. Thomas, C. N., et al. Assessment of necroptosis in the retina in a repeated primary ocular blast injury mouse model. Exp Eye Res. 197, 108102 (2020).
  32. Naguib, S., Bernardo-Colón, A., Rex, T. S. Intravitreal injection worsens outcomes in a mouse model of indirect traumatic optic neuropathy from closed globe injury. Exp Eye Res. 202, 108369 (2021).
  33. Vest, V., Bernardo-Colón, A., Watkins, D., Kim, B., Rex, T. S. Rapid repeat exposure to subthreshold trauma causes synergistic axonal damage and functional deficits in the visual pathway in a mouse model. J Neurotrauma. 36 (10), 1646-1654 (2019).
  34. Hines-Beard, J., et al. A mouse model of ocular blast injury that induces closed globe anterior and posterior pole damage. Exp Eye Res. 99, 63-70 (2012).
  35. Naguib, S., Bernardo-Colon, A., Cencer, C., Rex, T. S. Galantamine confers neuroprotection in a model of indirect traumatic optic neuropathy. Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (9), 4407-4407 (2019).
  36. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Molecular changes and vision loss in a mouse model of closed-globe blast trauma. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (8), 4853-4862 (2014).
  37. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., D'surney, L., Rex, T. S. Exacerbation of blast-induced ocular trauma by an immune response. J Neuroinflammation. 11 (1), 1-15 (2014).
  38. Bricker-Anthony, C., Hines-Beard, J., Rex, T. S. Eye-directed overpressure airwave-induced trauma causes lasting damage to the anterior and posterior globe: A model for testing cell-based therapies. J Ocul Pharmacol Ther. 32 (5), 286-295 (2016).
  39. Bricker-Anthony, C., et al. Erythropoietin either prevents or exacerbates retinal damage from eye trauma depending on treatment timing. Optom Vis Sci. 94 (1), 20-32 (2017).
  40. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2 (2014).
  41. Guley, N. H., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury using focal primary overpressure blast to the cranium in mice. J Neurotrauma. 33 (4), 403-422 (2016).
  42. Del Mar, N., et al. A novel closed-body model of spinal cord injury caused by high-pressure air blasts produces extensive axonal injury and motor impairments. Exp Neurol. 271, 53-71 (2015).
  43. Wolf, S. J., Bebarta, V. S., Bonnett, C. J., Pons, P. T., Cantrill, S. V. Blast injuries. Lancet. 374 (9687), 405-415 (2009).
  44. Bricker-Anthony, C., Rex, T. S. Neurodegeneration and vision loss after mild blunt trauma in the c57bl/6 and dba/2j mouse. PLoS One. 10 (7), e0131921 (2015).
  45. Heldt, S. A., et al. A novel closed-head model of mild traumatic brain injury caused by primary overpressure blast to the cranium produces sustained emotional deficits in mice. Front Neurol. 5, 2 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved