Inducción de una lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un modelo de ojo de ratón

Resumen

Este protocolo modela la lesión por isquemia-reperfusión retiniana en un ojo de ratón mediante la inducción de isquemia retiniana a través de la canulación de la cámara anterior y la elevación de la presión intraocular, seguida de la normalización de la presión intraocular para iniciar la reperfusión.

Resumen

Se sabe que las lesiones por isquemia-reperfusión causan una variedad de patologías de la retina, incluida la retinopatía diabética, el glaucoma, las oclusiones vasculares de la retina y otras afecciones vasooclusivas. Este manuscrito presenta un método para inducir la lesión por isquemia-reperfusión en un modelo de ratón. El método utilizó la canulación de la cámara anterior unida a un reservorio de solución salina, generando presión hidrostática para elevar la presión intraocular a 90-100 mmHg. Este método causó efectivamente la constricción de los capilares de la retina para inducir isquemia retiniana. Al final del período isquémico (60 min), la presión intraocular se normalizó (≤20 mmHg) antes de retirar la cánula de la cámara anterior para iniciar la reperfusión. Días después del procedimiento de isquemia/reperfusión, se recogieron los ojos y se seccionaron para la tinción histológica. La histopatología de los cortes de retina se puntuó evaluando ocho parámetros de lesión retiniana: pliegues, hemorragia, deformación, pérdida celular en la célula ganglionar, capas nuclear interna, nuclear externa y fotorreceptora, y daño a las células epiteliales pigmentarias de la retina. Este método proporcionó un modelo reproducible para estudiar los mecanismos y la patología de la lesión por isquemia/reperfusión de la retina. Además, este modelo puede facilitar el descubrimiento de posibles dianas terapéuticas para tratar la lesión por isquemia/reperfusión retiniana, avanzando en el estudio de las patologías retinianas y mejorando los resultados de los pacientes.

Introducción

Las lesiones por isquemia/reperfusión se manifiestan en diversas patologías de la retina, que abarcan la retinopatía diabética, el glaucoma, las oclusiones vasculares retinianas y las afecciones vasooclusivas relacionadas. Dada la alta demanda de oxígeno de la retina, es particularmente susceptible a la lesión por isquemia/reperfusión, un fenómeno implicado en la patogénesis de enfermedades como la retinopatía diabética. Esta forma de lesión provoca la desaparición de las células ganglionares de la retina (CGR), la degeneración morfológica de la retina, el compromiso de la función retiniana y, finalmente, el deterioro de la^visión. El modelado de la isquemia/reperfusión es apropiado para estudios sobre los mecanismos y las respuestas al tratamiento en diversas patologías de la retina relacionadas con las lesiones por isquemia/reperfusión.

Nos centramos en refinar un modelo para la lesión por isquemia/reperfusión en el ojo del ratón. El modelo de canulación de cámara anterior para la lesión por isquemia retiniana inducida por presión fue publicado por primera vez por Büchi et al. en 1991². Aumentaron con éxito la presión intraocular a 110 mmHg durante un tiempo controlado. Encontraron que la lesión de la retina resultante era consistente con hallazgos similares a la oclusión vascular de la retina y la coroides. Debido a su metodología relativamente sencilla y a su ejecución rentable, se convirtió en un modelo funcional para el estudio de la lesión isquémica de la retina. Añadimos el paso adicional de bajar la fuente de infusión al nivel del ratón antes de retirar la aguja. Esto evitó la formación de un posible diferencial de presión elevado dentro del ojo cuando se retiró la aguja, causando daño intraocular no relacionado con la isquemia/reperfusión.

El objetivo era crear un modelo controlado y replicable para investigar los mecanismos y la patología de la lesión por isquemia/reperfusión de la retina en un modelo de ratón, minimizando al mismo tiempo el daño del procedimiento ocular. Este modelo ofrece una forma de identificar posibles tratamientos y mejorar nuestra comprensión de las patologías de la retina asociadas a la oclusión vascular.

Protocolo

Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con un protocolo de uso de animales aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Boston, de acuerdo con la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y cumple con la declaración de la Asociación para la Investigación de la Visión y la Oftalmología (ARVO) para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión.

1. Animales de experimentación

1. Aloja ratones C57BL/6J en condiciones estándar.

2. Preparación de la solución requerida y la línea de infusión

1. En una jeringa de 50 ml, llénela con solución salina esterilizada de NaCl al 0,9% a razón de una por ratón. Coloque la jeringa a una altura de 120 cm sobre el nivel de la superficie del banco.
2. Conecte la jeringa llena a una línea de infusión y a una llave de paso con una aguja de 30 G conectada al extremo de la línea. Enjuague todas las burbujas de aire de la línea.

3. Preparar el espacio de trabajo

1. Coloque un microscopio quirúrgico/de disección debajo del frasco de solución salina.
2. Cree una cama para estabilizar al ratón durante el procedimiento cortando una depresión de aproximadamente 6 cm x 3 cm en una esponja y colocándola de forma segura en un pozo de espuma de poliestireno u otro recipiente plano.

4. Anestesiar el ratón

1. Anestesiar al ratón con una mezcla estándar de ketamina y xilacina a un nivel para lograr una anestesia profunda.
   NOTA: En este protocolo, se inyectó una mezcla de ketamina 100 mg/kg y xilacina 10 mg/kg por vía intraperitoneal para lograr una profundidad de anestesia adecuada.
2. Logre una anestesia adecuada cuando no hay retirada de la pata en respuesta a un pellizco en el dedo del pie y no hay reflejo de parpadeo cuando se toca suavemente la córnea. Administre anestesia adicional si el ratón muestra algún signo de dolor, como hiperventilación o movimiento de las extremidades, mientras está anestesiado.

5. Dilatar el iris

1. Dilatar el iris del ojo a perfundir con 1 gota de tropicamida al 1%. Espere 5 minutos para la dilatación. Aplique un ungüento oftálmico como la bacitracina en el ojo que no se perfundirá.

6. Canulación de la cámara anterior

1. Coloque de forma segura el ratón anestesiado en el lecho de esponja bajo el microscopio. Aplique una solución salina en los ojos para enjuagar cualquier residuo o pelo de la superficie del ojo.
2. Utilice un par de pinzas no dentadas y proponga suavemente uno de los ojos.
   NOTA: Un experimento utilizará los ojos izquierdo o derecho del ratón, pero nunca ambos en el mismo ratón.
3. Con la vía de infusión cerrada, cánula la cámara anterior con la aguja aproximadamente a 2 mm del limbo. Asegúrese de que la aguja perfore la córnea perpendicularmente a la superficie periférica y curvada de la córnea, luego se aplana ligeramente en paralelo al plano del iris. La córnea se puede manipular para hacer avanzar la aguja y mantener el control ocular. Evite golpear el iris o el cristalino y agrandar la herida corneal, lo que puede provocar fugas. Los detalles son descritos con más detalle por Buchi et ^al.2.

7. Fase isquémica

1. Gire la llave de paso para pasar la línea de infusión. Verifique que no haya fugas a través de la herida corneal. Asegúrese de que haya una distensión gradual de la córnea a medida que aumenta la presión intraocular.
   NOTA: Si una fuga significativa no se sella a medida que la córnea se distiende, no se mantendrá la presión adecuada y el procedimiento tendrá que realizarse en un ratón diferente.
2. Comprobar que la presión intraocular se ha elevado a 90-100 mmHg con un tonómetro. Asegure la línea de infusión con cinta adhesiva, asegurándose cuidadosamente de que la aguja no cambie de posición y comience a gotear.
3. Aplique un ungüento oftálmico como la bacitracina en el ojo perfundido para prevenir la sequedad. Coloque el ratón lejos del microscopio y debajo de una lámpara de calefacción para mantener la temperatura corporal normal y controle durante los próximos 60 minutos.
4. Vuelva a medir la presión intraocular 30 minutos antes de que finalice el procedimiento para asegurarse de que la presión intraocular esté entre 90 y 100 mmHg.

8. Fase de reperfusión

1. Después de 60 minutos, vuelva a colocar el ratón en el microscopio. Bajar el frasco de solución salina al nivel del ratón, normalizando la presión intraocular.
2. Medir la presión intraocular con la tonometría para comprobar que está cerca de lo normal, 20 mmHg. Una vez normalizada la presión intraocular, retire la aguja con cuidado, evitando dañar el cristalino o el iris.

9. Cuidados postoperatorios

1. Cubra los ojos de ratón con cualquier ungüento antibacteriano oftálmico, como un ungüento oftálmico veterinario de bacitracina.
2. Monitoree el ratón durante 1-2 horas en una superficie caliente hasta que se recupere completamente de la anestesia. No deje al ratón desatendido hasta que haya recuperado la conciencia suficiente para mantener la decúbito esternal. Regrese los ratones a las jaulas y al alojamiento una vez que estén completamente recuperados.

10. Enuclear el ojo³

1. Anestesiar primero al ratón con una mezcla de ketamina 100 mg/kg y xilacina 10 mg/kg inyectada por vía intraperitoneal y luego eutanasiar mediante luxación cervical.
2. Coloque el ratón sacrificado sobre una superficie plana, seca y lisa. Enjuague el ojo con unas gotas de solución salina.
3. Aplique una presión suave sobre el canto lateral con las pinzas hasta que el globo ocular se desplace de la cuenca y el nervio óptico sea accesible. Con unas tijeras Westcott, corte siguiendo los márgenes orbitales para cortar los músculos extraoculares.
4. Coloque las tijeras Westcott en el aspecto más posterior de la cuenca del ojo y corte el nervio óptico.

11. Fijación de la muestra⁴

1. Coloque el ojo enucleado en paraformaldehído al 4% en PBS 0,1 M en un vial sellado. Después de 3 días, retire el ojo, colóquelo en un vial de solución de etanol al 70% y guárdelo durante la noche.
2. Retire los ojos y colóquelos en un vial de solución de etanol al 95%. A continuación, coloque el vial en una aspiradora sellada durante 15 minutos, retírelo de la aspiradora y déjelo en el aire ambiente durante 45 minutos.
3. Repita el proceso de vacío, colocando secuencialmente el ojo en las siguientes soluciones: 100% etanol, 100% etanol, 100% solución de xileno y 100% solución de xileno.
4. Retire el ojo y colóquelo en un frasco limpio y vacío. Llene el vial con parafina líquida a 60 °C. Coloque el vial en un horno de vacío sellado a 60 °C durante 30 minutos y luego 30 minutos en el horno a 60 °C sin vacío.
5. Retire el ojo, colóquelo en un vial limpio y vacío y llénelo con parafina líquida a 60 °C. Almacene el vial a 60 °C durante toda la noche.

12. Incrustación de la muestra

1. Transfiera el ojo a un molde de incrustación de metal y llene el molde con parafina líquida en una placa calefactora a 60 °C, orientando el ojo en la dirección deseada para hacer secciones a través del disco óptico. Deje que el molde se enfríe a temperatura ambiente (RT), luego guárdelo a 4 °C.

13. Seccionar la muestra⁵

1. Transfiera las muestras incrustadas al micrótomo. Recorte lentamente el bloque hasta llegar al ojo y las secciones incluyan el disco óptico.
2. Cortar secciones como cintas de 5 μm de grosor y hacerlas flotar en un baño de agua. Levante la cinta de parafina con cuidado con pinzas, coloque cintas de tres secciones en un portaobjetos y déjela secar durante la noche.
3. Repita este proceso hasta que haya al menos 8 portaobjetos para cada ojo con secciones centradas en el disco óptico.

14. Manchar las secciones⁵

1. Calentar los portaobjetos en un horno a 60 °C durante 1 h para derretir la parafina. Sumerja los portaobjetos en xileno RT tres veces, durante 5 minutos cada una.
2. Sumerja los portaobjetos en etanol al 100% tres veces, durante 3 minutos cada una. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 1 min.
3. Incubar las secciones en tinción de hematoxilina durante 45 s. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 2 minutos.
4. Incubar las secciones en el reactivo azulado durante 1 min. Enjuague las secciones con agua del grifo durante 1 min.
5. Incubar las secciones en eosina durante 15 s.
6. Enjuague las secciones con etanol al 95% y al 100% dos veces durante 1 minuto cada una. Enjuague las secciones con xileno al 100% cuatro veces, durante 1 minuto cada una. A continuación, monte las guías con medios de montaje.

15. Análisis histológico⁶

1. Analice cada sección de la retina bajo el microscopio y registre el número de pliegues de la retina, el porcentaje de pérdida de células en las diversas capas de la retina (capa de células ganglionares, capa nuclear interna, capa nuclear externa), la presencia de hemorragia vítrea o subretiniana y la extensión del daño epitelial del pigmento de la retina. Consulte la Tabla 1 para obtener detalles sobre los criterios de puntuación.

Resultados

Para evaluar la patología de las retinas después de la isquemia/reperfusión, se recolectaron ojos de un grupo de ratones 2 días después del procedimiento y de otro grupo de ratones 7 días después del procedimiento. Los ojos enucleados se fijaron en paraformaldehído al 4%, se incrustaron en parafina y se cortaron en secciones de 5 μm. Las secciones se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) y se tomaron imágenes para el examen histológico (Figura 1

Discusión

El modelo de isquemia/reperfusión proporciona un método reproducible para estudiar los mecanismos y la patología de la lesión por isquemia/reperfusión de la retina. Este modelo es útil para estudiar la patología de la lesión por isquemia/reperfusión retiniana y para identificar dianas terapéuticas. Varios pasos críticos en el protocolo pueden plantear desafíos y requerir habilidades técnicas para completarse con éxito. Una de ellas es la canulación propiamente dicha, que p...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% Proparacaine	Sandoz	61314-016-01
1% tropicamide	Sumerset Therapeutics	700069-016-01
30 G needle	Becton Dickinson	305106
4% paraformaldehyde	Electron Microscopy Sciences	15700
Bluing reagent	Fisher Scientific	22-050-114
C57BL/6J mice	Jackson Laboratories	664
Dissecting Microscope	Olympus	SZ61
Eosin stain	Electron Microscopy Sciences	26051-11
Hematoxylin stain	Electron Microscopy Sciences (Gill's #2)	26030-20
Imager	Olympus	Q-Color 5
Infusion line (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Ketamine	Covetrus	10004027	Zoetis NDC# 00856440301
Microscope	Olympus	CX-33
Microtome	Microm	HM335S
Ophthalmic antibacterial ointment	Henry Schein	1410468	Baush & Lomb NDC# 2420879535
Permount Mounting Media	Fisher Scientific	SP15-100
Prism	GraphPad	10.3.1 for macOS	data collection, statistical anlaysis, graphs
Saline Solution	KD Medical Inc	50-103-1363
Stopcock (included in the in vivo perfusion system)	Braintree Scientific	IV4140
Tonometer	iCare	TA01i
Xylazine	Covetrus	1XYL006	Covetrus NDC# 11695402401